專利名稱：從黃芪中同時(shí)提取和分離黃酮富集物、皂苷富集物和多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中草藥有效成分的提取方法，尤其涉及一種從黃芪中同時(shí)提取和分離黃酮富集物、皂苷富集物和多糖的方法。
背景技術(shù)：
黃芪是名貴中藥，屬補(bǔ)氣藥，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益胃固表、利水消腫、脫毒生肌等功效。黃苗為豆科植物蒙古黃苗(Astragalus membranaceus)或膜莢黃苗(Astragalusmembranaceus)的干燥根，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌等功效。黃苗中的主要有效成分為黃酮類、皂苷類和多糖。其中黃酮類化合物主要包括芒柄花素(formononetin)、芒柄花苷(ononion)、毛蕊異黃酮(calycosin )及其糖苷等。研究證實(shí)黃芪總黃酮具有清除02_ 和OH- 防止生物膜過(guò)氧化的作用，也能顯著抑制OH- 對(duì)DNA的損傷作用，是黃芪抗氧化作用的主要成分，表現(xiàn)為顯著的抗肝臟毒性、抗炎、抗菌及保護(hù)心 血管系統(tǒng)的作用。黃芪總皂苷在免疫調(diào)節(jié)、心肌缺血保護(hù)等方面有顯著活性，其藥理作用廣泛，包括抗病毒、保肝、抑瘤、改善心臟功能、抗炎鎮(zhèn)痛、抑制滑膜成纖維細(xì)胞增殖等。黃芪多糖具有廣泛的生物活性，在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床上研究應(yīng)用也較廣泛，可作為免疫促進(jìn)劑或調(diào)節(jié)劑。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明，黃芪多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、強(qiáng)心降壓、降血糖、抗應(yīng)激、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗氧化等多種藥理功效。現(xiàn)有文獻(xiàn)雖然報(bào)道了較為詳細(xì)的將黃芪中部分有效成分進(jìn)行分離的方法，但同樣也沒(méi)有一個(gè)將多糖、黃酮類化合物和皂苷類化合物從黃芪中同時(shí)進(jìn)行分離和富集的過(guò)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)而提供一種從黃芪中同時(shí)提取和分離黃酮富集物、皂苷富集物和多糖的方法，其工藝簡(jiǎn)單、成本低、損失小和產(chǎn)品質(zhì)量高。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是從黃芪中同時(shí)提取和分離黃酮富集物、皂苷富集物和多糖的方法，包括以下步驟
1)將黃芪根莖原料粉碎過(guò)20-60目篩后放入容器，加入乙醇提取，在5(T90°C下回流提取1飛小時(shí)，反復(fù)提取2-3次，過(guò)濾藥渣后，合并得到乙醇提取液；
2)乙醇提取液冷卻至室溫，靜置2 I天，有沉淀物A析出，過(guò)濾得到沉淀物A和乙醇提取液過(guò)濾液；
3)待步驟I)所得藥渣揮去溶劑之后用水提取I飛小時(shí)，反復(fù)提取2-3次，過(guò)濾藥渣后，合并得到水提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，得到水提濃縮液；
4)步驟3)所得水提濃縮液用乙醇醇沉，過(guò)濾得到的沉淀物B與沉淀物A合并，真空干燥研磨成粉，即得到黃芪多糖富集物；
5)將步驟2)的乙醇提取液過(guò)濾液和步驟4)過(guò)濾所得的過(guò)濾液合并，攪拌下加入堿液，離心分離，得到黃色粘稠沉淀C ；6)將步驟5)離心分離得到的清液進(jìn)行蒸餾回收有機(jī)溶劑，濃縮后的母液室溫放置沉降，離心得到淡黃色沉淀D，通過(guò)蒸餾水水洗該沉淀3-5次后，將其真空干燥研磨成粉，得到黃芪總皂苷富集物；
7)將步驟5)所得黃色粘稠沉淀C加酸液酸化，至不再沉出物質(zhì)為止，離心分離，所得沉淀物經(jīng)水洗后，將其真空干燥研磨成粉，即得到黃芪總黃酮富集物。按上述方案，步驟I) 所述的乙醇濃度是5(T95. wt%0按上述方案，步驟I)所述的黃芪根莖與乙醇的投料比為Ig 5 30ml，步驟3)所述的揮去溶劑之后的藥渣與水的投料比為Ig 5 30ml。按上述方案，步驟4)所述的乙醇濃度為50 100. wt%0按上述方案，步驟3)所述的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮蒸發(fā)后體積為水提取液原體積的1/2 1/10，步驟6)所述的濃縮后母液體積為清液原體積的1/2 1/10。按上述方案，步驟5)所述的堿液為NaOH、Ca(OH)2或KOH以控制pH為8 10。按上述方案，步驟7)所述的酸液為鹽酸、硫酸或醋酸以控制pH為3 5。本發(fā)明的反應(yīng)機(jī)理是采用固液萃取將固體混合物浸在選定的溶劑中，利用其組分在溶劑中的不同溶解度，使易溶的組分溶解為溶液，即可達(dá)到不同機(jī)型物質(zhì)與固體殘?jiān)姆蛛x。本發(fā)明使用堿沉淀法將黃酮類和皂苷類化合物進(jìn)行分離和富集時(shí)，所用堿液濃度不宜過(guò)高，以免在強(qiáng)堿性下，尤其加熱進(jìn)破壞黃酮母核。在加酸酸化時(shí)，酸性也不宜過(guò)強(qiáng)，以免生成詳鹽，致使析出的黃酮類化合物又重新溶解，降低產(chǎn)品收率。本發(fā)明所得產(chǎn)品的分析方法
I、黃芪總黃酮的含量測(cè)定
紫外分光光度法以蘆丁為對(duì)照品，在259. 5 nm下測(cè)定吸光度，并制作黃芪黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出回歸方程為A=30. 3571C+0.01357(A為吸光度；C為濃度g /L)，相關(guān)系數(shù)R2=O. 99991。由回歸方程求出待測(cè)樣品總黃酮濃度。2、黃芪總皂苷的含量測(cè)定
香草酸-冰醋酸顯色后，用分光光度法在波長(zhǎng)為456 nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=3. 0378C-0. 0599 (A為吸光度；C為濃度g /L)，相關(guān)系數(shù)R2=O. 9988，由回歸方程求出待測(cè)樣品中總皂苷的濃度。3、黃芪多糖的含量測(cè)定
苯酚-濃硫酸顯色后，用分光光度法在波長(zhǎng)為480 nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=16. 087C+0. 0253 (A為吸光度；C為濃度g /L)，相關(guān)系數(shù)R2=O. 9959，由回歸方程求出待測(cè)樣品中多糖含量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明利用不同極性的溶劑將黃芪中黃酮、皂苷和多糖從其中同時(shí)提取出來(lái)，利用酸堿沉淀法將黃酮和皂苷進(jìn)行分離，工藝簡(jiǎn)單，易操作，達(dá)到三種目標(biāo)物質(zhì)的分離和富集。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I :1、稱取經(jīng)粉碎至60目的40g黃芪根莖原料，放入1000 mL的三口燒瓶中，以固液比為
I 20，加入質(zhì)量百分比濃度為60%的乙醇，在50°C下回流提取2小時(shí)進(jìn)行一次提取，過(guò)濾得到乙醇提取液A，濾渣用于二次提取。二次提取的固液比為I : 15，在相同溫度下提取時(shí)間為I. 5小時(shí)，過(guò)濾藥渣后，得到乙醇提取液B，合并乙醇提取液A和乙醇提取液B ;
2、冷卻至室溫靜置3天，過(guò)濾得到沉淀物A和乙醇提取液過(guò)濾液；
3、待步驟I)所得藥渣揮去溶劑之后用水提取2小時(shí)，所述的揮去溶劑之后的藥渣與水的投料比為I : 15，停止加熱和攪拌，過(guò)濾后得到水提取液，濾渣備用。重復(fù)上述水提操作一次，合并兩次水提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后體積為水提取液原體積的1/3，冷卻后得到水提濃縮液；
4、往水提濃縮液中加入質(zhì)量百分比濃度為80%的乙醇，醇沉，靜置24小時(shí)之后，過(guò)濾得到沉淀物B和過(guò)濾液；合并沉淀物A和沉淀物B，將其真空干燥研磨成粉，即得到黃芪多糖 富集物(經(jīng)過(guò)紅外檢測(cè)其圖譜確定)；
5、合并乙醇提取液過(guò)濾液和步驟4過(guò)濾液，攪拌下加入5gNaOH固體配置的NaOH水溶液，控制PH為9，出現(xiàn)大量沉淀，離心分離得到黃色粘稠沉淀C ；
6、將步驟5離心分離得到的清液進(jìn)行蒸餾回收有機(jī)溶劑，濃縮后的母液室溫放置沉降，濃縮后母液體積為清液原體積的1/3，離心得到淡黃色沉淀D，通過(guò)蒸餾水水洗該沉淀3次后，將其真空干燥研磨成粉，即得到黃芪總皂苷富集物(經(jīng)過(guò)紅外檢測(cè)其圖譜確定);
7、將黃色粘稠沉淀C加入鹽酸酸化，控制pH至3.5，黃芪黃酮及其類似物從水中析出，至不再沉出物質(zhì)為止，離心分離得到黃芪總黃酮，所得產(chǎn)物水洗2次后，將其真空干燥研磨成粉，即得到黃芪總黃酮富集物(經(jīng)過(guò)紅外檢測(cè)其圖譜確定)。上述實(shí)施例提取的結(jié)果為
干燥后濾渣稱重為24. 969 g ;黃芪粗多糖6. 447 g，得率為16. 12%，純度為54. 7% ;黃芪總皂苷富集物6. 065 g，得率為15. 16%，純度為40. 6% ;黃芪總黃酮富集物3. 043 g，得率為
7.61%，純度為 41. 4%。
實(shí)施例2
1、稱取經(jīng)粉碎至20目的30g黃芪根莖原料，放入1000 mL的三口燒瓶中，加入無(wú)水食用工業(yè)酒精配置的質(zhì)量百分比濃度為70%的乙醇600 mL，在70°C下回流提取2小時(shí)進(jìn)行一次提取，過(guò)濾得到乙醇提取液A (體積565 mL)，濾渣用于二次提取。二次提取補(bǔ)加質(zhì)量百分比濃度為70%的乙醇565 mL，在相同溫度下提取時(shí)間仍為2小時(shí)，過(guò)濾藥渣后，得到乙醇提取液B (體積為590 mL)，合并乙醇提取液A和乙醇提取液B ;
2、冷卻至室溫靜置4天，過(guò)濾得到沉淀A和乙醇提取液過(guò)濾液；
3、待步驟I)所得藥渣揮去溶劑之后加入一次蒸餾水450mL提取2小時(shí)，所述的揮去溶劑之后的藥渣與水的投料比為I : 15，停止加熱和攪拌，過(guò)濾后得到水提取液，濾渣備用。重復(fù)上述水提取操作一次，合并兩次水提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后體積為水提取液原體積的1/5，冷卻后得到水提濃縮液；
4、往水提濃縮液中加入質(zhì)量百分比濃度為80%的乙醇，醇沉，靜置12小時(shí)之后，過(guò)濾得到沉淀物B和過(guò)濾液，合并沉淀物A和沉淀物B，將其真空干燥研磨成粉，即得到黃芪多糖富集物；5、合并乙醇提取液過(guò)濾液和步驟4過(guò)濾液，攪拌下加入3g固體KOH粉末，控制pH為
9.5，出現(xiàn)大量沉淀，離心分離得到黃色粘稠沉淀C ；
6、將步驟5離心分離得到的清液進(jìn)行蒸餾回收有機(jī)溶劑，濃縮后的母液室溫放置沉降，濃縮后母液體積為清液原體積的1/3，離心得到淡黃色沉淀D，通過(guò)蒸餾水水洗該沉淀3次后，將其真空干燥研磨成粉，即得到黃芪總皂苷富集物；
7、將黃色粘稠沉淀C加入硫酸酸化，控制pH至4，黃芪黃酮及其類似物從水中析出，至不再沉出物質(zhì)為止，離心分離得到黃芪總黃酮，所得產(chǎn)物水洗后，將其真空干燥研磨成粉，即得到黃芪總黃酮富集物。上述實(shí)施例提取的結(jié)果為
干燥后濾渣稱重為15. 83 g ;黃芪粗多糖6. 32 g，得率為21. 6%，純度為50. 1% ;黃芪總皂苷5. 203 g，得率為17. 34%，純度為40. 2% ;黃芪總黃酮2. 639 g，得率為8. 80%,純度為43. 4%。
實(shí)施例3
1、稱取經(jīng)粉碎至20目的40g黃芪根莖原料，放入1000 mL的三口燒瓶中，加入無(wú)水食用工業(yè)酒精配置的質(zhì)量百分比濃度為70%的乙醇600 mL，在70°C下回流提取2小時(shí)進(jìn)行一次提取，過(guò)濾得到乙醇提取液A (體積570 mL)，濾渣用于二次提取。二次提取補(bǔ)加質(zhì)量百分比濃度為70%的乙醇570 mL，在相同溫度下提取時(shí)間仍為2小時(shí)，過(guò)濾藥渣后，得到乙醇提取液B (體積為590 mL)，合并乙醇提取液A和乙醇提取液B ;
2、冷卻至室溫靜置4天，過(guò)濾得到沉淀A和乙醇提取液過(guò)濾液；
3、待步驟I)所得藥渣揮去溶劑之后加入一次蒸餾水445mL提取2小時(shí)，所述的揮去溶劑之后的藥渣與水的投料比為I : 15，停止加熱和攪拌，過(guò)濾后得到水提取液，濾渣備用。重復(fù)上述水提取操作一次，合并兩次水提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后體積為水提取液原體積的1/6，冷卻后得到水提濃縮液；
4、往水提濃縮液中加入質(zhì)量百分比濃度為80%的乙醇，醇沉，靜置12小時(shí)之后，過(guò)濾得到沉淀物B和過(guò)濾液，合并沉淀物A和沉淀物B，將其真空干燥研磨成粉，即得到黃芪多糖富集物；
5、合并乙醇提取液過(guò)濾液和步驟4過(guò)濾液，攪拌下加入8g固體Ca (OH) 2粉末，控制pH為10，出現(xiàn)大量沉淀，離心分離得到黃色粘稠沉淀C ；
6、將步驟5離心分離得到的清液進(jìn)行蒸餾回收有機(jī)溶劑，濃縮后的母液室溫放置沉降，濃縮后母液體積為清液原體積的1/2，離心得到淡黃色沉淀D，通過(guò)蒸餾水水洗該沉淀3次后，將其真空干燥研磨成粉，即得到黃芪總皂苷富集物；
7、將黃色粘稠沉淀C加入鹽酸酸化，控制pH至3，黃芪黃酮及其類似物從水中析出，至不再沉出物質(zhì)為止，離心分離得到黃芪總黃酮，所得產(chǎn)物水洗后，將其真空干燥研磨成粉，即得到黃芪總黃酮富集物。上述實(shí)施例提取的結(jié)果為干燥后濾渣稱重為22. 93 g ;黃芪粗多糖6. 474 g，得率為16. 18%，純度為48. 7% ;黃芪總皂苷6. 789 g，得率為16. 97%，純度為41. 3% ;黃芪總黃酮3. 243 g，得率為8. 11%，純度為42. 4%。
權(quán)利要求
1.從黃芪中同時(shí)提取和分離黃酮富集物、皂苷富集物和多糖的方法，其特征在于包括有以下步驟 1)將黃芪根莖原料粉碎過(guò)20-60目篩后放入容器，加入乙醇提取，在5(T90°C下回流提取1飛小時(shí)，反復(fù)提取2-3次，過(guò)濾藥渣后，合并得到乙醇提取液； 2)乙醇提取液冷卻至室溫，靜置2 I天，有沉淀物A析出，過(guò)濾得到沉淀物A和乙醇提取液過(guò)濾液； 3)待步驟I)所得藥渣揮去溶劑之后用水提取I飛小時(shí)，反復(fù)提取2-3次，過(guò)濾藥渣后，合并得到水提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，得到水提濃縮液； 4)步驟3)所得水提濃縮液用乙醇醇沉，過(guò)濾得到的沉淀物B與沉淀物A合并，真空干燥研磨成粉，即得到黃芪多糖富集物； 5)將步驟2)的乙醇提取液過(guò)濾液和步驟4)過(guò)濾所得的過(guò)濾液合并，攪拌下加入堿液，離心分離，得到黃色粘稠沉淀C ； 6)將步驟5)離心分離得到的清液進(jìn)行蒸餾回收有機(jī)溶劑，濃縮后的母液室溫放置沉降，離心得到淡黃色沉淀D，通過(guò)蒸餾水水洗該沉淀3-5次后，將其真空干燥研磨成粉，得到黃芪總皂苷富集物； 7)將步驟5)所得黃色粘稠沉淀C加酸液酸化，至不再沉出物質(zhì)為止，離心分離，所得沉淀物經(jīng)水洗后，將其真空干燥研磨成粉，即得到黃芪總黃酮富集物。
2.按照權(quán)利要求I所述的從黃芪中提取和分離黃酮富集物、皂苷富集物和多糖的方法，其特征在于步驟I)所述的乙醇濃度是5(T95. wt%。
3.按照權(quán)利要求I所述的從黃芪中提取和分離黃酮富集物、皂苷富集物和多糖的方法，其特征在于步驟I)所述的黃芪根莖與乙醇的投料比為Ig 5 30ml，步驟3)所述的揮去溶劑之后的藥渣與水的投料比為Ig 5 30ml。
4.按照權(quán)利要求I所述的從黃芪中提取和分離黃酮富集物、皂苷富集物和多糖的方法，其特征在于步驟4)所述的乙醇濃度為5(Tl00. wt%0
5.按照權(quán)利要求I所述的從黃芪中提取和分離黃酮富集物、皂苷富集物和多糖的方法，其特征在于步驟3)所述的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮蒸發(fā)后體積為水提取液原體積的1/2 1/10，步驟6)所述的濃縮后母液體積為清液原體積的1/2 1/10。
6.按照權(quán)利要求I所述的從黃芪中提取和分離黃酮富集物、皂苷富集物和多糖的方法，其特征在于步驟5)所述的堿液為NaOH、Ca(OH)2或KOH以控制pH為8 10。
7.按照權(quán)利要求I所述的從黃芪中提取和分離黃酮富集物、皂苷富集物和多糖的方法，其特征在于步驟7)所述的酸液為鹽酸、硫酸或醋酸以控制pH為3 5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從黃芪中同時(shí)提取和分離黃酮富集物、皂苷富集物和多糖的方法，其利用黃芪為原料，先用乙醇提取，再用水提。乙醇提取得到的提取液靜置，水提取得到的提取液用乙醇沉淀，與乙醇提取靜置后的下層沉淀合并，可獲得黃芪多糖；將乙醇提取液靜置后的上層清液與水提后醇沉的上層清液合并得到醇提液，醇提液使用堿沉淀法后，分離得黃芪黃酮富集物和黃芪皂苷富集物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明利用不同極性的溶劑將黃芪中黃酮、皂苷和多糖從其中同時(shí)提取出來(lái)，利用酸堿沉淀法將黃酮和皂苷進(jìn)行分離，工藝簡(jiǎn)單，易操作，達(dá)到三種目標(biāo)物質(zhì)的分離和富集。
文檔編號(hào)A61P19/02GK102697838SQ201210178208
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月1日
發(fā)明者余軍霞, 張?jiān)椒? 徐志高, 池汝安, 肖春橋, 鐘玲 申請(qǐng)人:武漢工程大學(xué)