專利名稱：一種病毒釋放緩沖液的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸用疫苗領(lǐng)域，具體地，涉及一種病毒釋放緩沖液及用該病毒釋放緩沖液提高胚液病毒滴度和制備多聯(lián)苗的方法。
背景技術(shù)：
禽類疫苗主要通過(guò)雞胚繁殖病毒而生產(chǎn)。該種疫苗具有制備工藝簡(jiǎn)單，免疫效果確實(shí)，免疫持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)等特點(diǎn)，已被許多國(guó)家地區(qū)在家禽中使用，并在預(yù)防和控制禽流感暴發(fā)中起到一定積極作用。但滅活疫苗存在免疫效率低下，免疫劑量較大，監(jiān)測(cè)中難于區(qū)分疫病的疫苗免疫與野度感染，并且還存在散毒的危險(xiǎn)等缺點(diǎn)。另外，采用傳統(tǒng)的滅活疫苗對(duì)禽流感進(jìn)行預(yù)防，往往由于新的禽流感變異株的出現(xiàn)而導(dǎo)致免疫失敗。盡管如此，用疫苗預(yù)防仍是禽病防治的主要措施和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在許多國(guó)家禽病防治中都起到了極其重要的作用。在規(guī)模化生產(chǎn)禽流感油乳劑滅活苗中，通過(guò)對(duì)原輔材料、生產(chǎn)過(guò)程關(guān)鍵技術(shù)地控制和工藝改進(jìn)等措施，生產(chǎn)出高效、穩(wěn)定的產(chǎn)品。生產(chǎn)過(guò)程的關(guān)鍵技術(shù)直接關(guān)系到產(chǎn)品的質(zhì)量，是生產(chǎn)高效優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品的保障。目前，有許多研究致力于從胚液中純化病毒或者生產(chǎn)相應(yīng)產(chǎn)品。有人通過(guò)乙醚等化學(xué)試劑從濃縮的胚液中提取病毒提高病毒產(chǎn)量。提取病毒的目的在于，病毒顆粒與細(xì)胞碎片或者塊狀物質(zhì)分離開(kāi)。有人通過(guò)離子交換層析分離病毒；也有人通過(guò)，通過(guò)中等速度離心去除胚液中的大塊物質(zhì)，然后通過(guò)CaHP04凝膠吸附澄清胚液中的病毒顆粒，達(dá)到純化病毒的目的。也有通過(guò)低速離心去除胚液中的大塊物質(zhì)，然后通過(guò)高速離心回收病毒并且溶于磷酸鹽緩沖液中保存。也有人發(fā)現(xiàn)如果在感染病毒的細(xì)胞或者胚液中加入高濃度的鹽溶液，最終能夠提高病毒的產(chǎn)量和純度。有人研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒液中加入0.3MNaCl降低純化后的流感病毒聚集。雖然有不少人對(duì)采用了不同方法對(duì)禽流感病毒進(jìn)行了分離純化，但是這些方法明顯存在以下缺點(diǎn)處理量小，例如高速離心；價(jià)格貴例如采用離子交換層析； 對(duì)病毒抗原純?cè)谟绊懀缡褂靡颐训然瘜W(xué)試劑從濃縮的胚液中提取病毒。這些因素均不利于產(chǎn)業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)不足之處，提供一種病毒釋放緩沖液及用該病毒釋放緩沖液提高胚液病毒滴度和制備多聯(lián)苗的方法，該方法能夠提高胚液禽類病毒的檢測(cè)病毒滴度，處理病毒后能夠提高病毒顆粒的穩(wěn)定性，對(duì)病毒抗原沒(méi)什么影響，且可大量處理胚液病毒，處理速度快。本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種病毒釋放緩沖液，所含組分及各組分的質(zhì)量含量如下氯化鈉(NaCl):7-25g ；氯化鉀(KCl)0. 00-5. Og ；氯化鎂(MgCl2)0. 5-2. 5g ；
磷酸氫二鈉(Na2HP04):0. 1-3. Og ；乙二胺四乙酸(EDTA)0. 15-1. 5g ；甘氨酸1-6.Og;谷氨酰胺1-5.Og;組氨酸0.5-2. Og ；絲氨酸I-IOg;賴氨酸I-IOg;精氨酸5_8g;吐溫-80:0. 5-2. Og ；曲拉通 X-100 0. l-20g ；甘油2-18g;按配方稱量以上試劑，全部溶解于蒸餾水中，調(diào)整pH為7. 0-7. 5，最終溶液體積定容為1L，即得所述病毒釋放緩沖液。用所述病毒釋放緩沖液提高胚液病毒滴度的方法，包括如下具體步驟步驟A 分別取所述病毒釋放緩沖液和病毒胚液；步驟B 將病毒胚液中速離心，即以6000-9000r/min的速率離心15_60min，分離沉
淀一和上清液一；步驟C:按沉淀質(zhì)量病毒釋放緩沖液質(zhì)量1 10-100向所得沉淀中加入所述病毒釋放緩沖液，混合均勻后，在2-8°C以1000-5000r/min的攪拌速率，攪拌10-30min，然后再次中速離心，分離沉淀二和上清液二，沉淀一中80%以上的病毒已經(jīng)進(jìn)入上清液二 ；步驟D 所得上清液二和所得上清液一混合后橫向切流濃縮；或?qū)⑺蒙锨逡憾退蒙锨逡阂环謩e橫向切流濃縮后混合；橫向切流濃縮所用的濾膜的孔徑為 10-500KDa，胚液濃縮倍數(shù)為濃縮2_10倍；得到病毒胚液的濃縮液?？紤]到過(guò)濾速度和病毒損失率，較佳地，采用為30_150KDa孔徑的濾膜，更佳地， 采用為50-100KDa孔徑的濾膜最好。用所述病毒釋放緩沖液制備多聯(lián)苗的方法，包括如下具體步驟步驟A 分別取所述病毒釋放緩沖液和病毒胚液；步驟B 將病毒胚液中速離心，即以6000-9000r/min的速率離心15_60min，分離沉
淀一和上清液一；步驟C:按沉淀質(zhì)量病毒釋放緩沖液質(zhì)量1 10-100向所得沉淀中加入所述病毒釋放緩沖液，混合均勻后，在2-8°C以1000-5000r/min的攪拌速率，攪拌10-30min，然后再次中速離心，分離沉淀二和上清液二，沉淀一中80%以上的病毒已經(jīng)進(jìn)入上清液二 ；步驟D 所得上清液二和所得上清液一混合后橫向切流濃縮；或?qū)⑺蒙锨逡憾退蒙锨逡阂环謩e橫向切流濃縮后混合；橫向切流濃縮所用的濾膜的孔徑為 10-500KDa，胚液濃縮倍數(shù)為濃縮2_10倍；得到病毒胚液的濃縮液。步驟E 將按步驟A、B、C和D制備的多個(gè)不同病毒胚液的濃縮液混合，即得多聯(lián)
田ο本發(fā)明提供了一種病毒釋放緩沖液病毒釋放緩沖液及用該病毒釋放緩沖液提高胚液病毒滴度和制備多聯(lián)苗的方法。通過(guò)中速離心的方式使胚液澄清，然后通過(guò)病毒釋放緩沖液把胚液病毒與細(xì)胞碎片等大塊物質(zhì)分離，離心回收釋放的病毒，并與首次離心獲得澄清胚液混合在一起；然后進(jìn)行濃縮。也可以把首次獲得的澄清胚液，先進(jìn)濃縮，最后和病毒釋放緩沖液釋放沉淀獲得的病毒液混合，就可以用于生產(chǎn)聯(lián)苗了。制備方法簡(jiǎn)單，能夠提高胚液禽類病毒的檢測(cè)病毒滴度，處理病毒后能夠提高病毒顆粒的穩(wěn)定性，對(duì)病毒抗原沒(méi)什么影響，且可大量處理胚液病毒，處理速度快。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例所用試劑及方法說(shuō)明如下所述病毒釋放緩沖液，所含組分及各組分的質(zhì)量含量如下氯化鈉(NaCl):15. Og;氯化鉀(KCl)5. 0g；氯化鎂(MgCl2)2. 5g ；磷酸氫二鈉(Na2HP04)2. Og ；乙二胺四乙酸(EDTA)1. 0g；甘氨酸5.0g;谷氨酰胺4. Og ；組氨酸1.5g;絲氨酸IOg；賴氨酸8g；精氨酸5g；吐溫-80:2.Og;曲拉通 X-100 :10. Og ；甘油15.Og;共計(jì)86g按配方稱量以上試劑，全部溶解于蒸餾水中，調(diào)整pH為7. 0-7. 5，最終溶液體積定容為1L，即得所述病毒釋放緩沖液。6.1胚液離心后很多病毒都存在于沉淀中。實(shí)驗(yàn)一驗(yàn)證胚液中病毒顆粒多數(shù)與細(xì)胞碎片等發(fā)塊物質(zhì)相互結(jié)合在一起的實(shí)驗(yàn)材料H5，禽流感病毒，H5毒株為H5(Re_4)株；H9，是禽流感病毒，H9毒株為 H9(SS)株；ND是雞新城疫病毒，上述毒株均為國(guó)家禽類疫苗生產(chǎn)用毒株。分別取2毫升的H5病毒胚液，H9病毒胚液和ND病毒胚液各兩份，離心前檢測(cè)各樣品病毒HA價(jià)，并記錄入表1。然后將其中一份H5病毒胚液，H9病毒胚液和ND病毒胚液以 8000rpm/min的速率離心20分鐘，另一份以8000rpm/min的速率離心30分鐘，離心后分離上上清液和沉淀，沉淀用2毫升的PBS溶解；分別檢測(cè)各樣品的離心后上清液中病毒HA價(jià)和離心后沉淀用2毫升的PBS溶解后病毒的HA價(jià)，并記錄入表1表1 H5病毒胚液，H9病毒胚液和ND病毒胚液離心前，離心后上清液和離心后沉淀HA價(jià)檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種病毒釋放緩沖液，其特征在于，所含組分及各組分的質(zhì)量含量如下 氯化鈉(NaCl) 7-25g ；氯化鉀(KCl) 0. 00-5. Og ；氯化鎂(MgC12):0. 5-2. 5g ；磷酸氫二鈉(Na2HP04) 0. 1-3. Og ；乙二胺四乙酸(EDTA) 0. 15-1. 5g ；甘氨酸1-6. Og ；谷氨酰胺1-5. Og ；組氨酸0. 5-2. Og ；絲氨酸I-IOg ；賴氨酸I-IOg ；精氨酸5-8g ；吐溫-80 0. 5-2. 0 g ；曲拉通 X-100 0. l-20g ；甘油2-18g;按配方稱量以上試劑，全部溶解于蒸餾水中，調(diào)整PH為7. 0-7. 5，最終溶液體積定容為 1L，即得所述病毒釋放緩沖液。
2.用權(quán)利要求1所述的病毒釋放緩沖液提高胚液病毒滴度的方法，其特征在于，包括如下具體步驟步驟A 分別取所述病毒釋放緩沖液和病毒胚液；步驟B 將病毒胚液中速離心，即以6000-9000r/min的速率離心15_60min，分離沉淀一和上清液一；步驟C 按沉淀質(zhì)量病毒釋放緩沖液質(zhì)量1 :10-100向所得沉淀中加入所述病毒釋放緩沖液，混合均勻后，在2-8°C以1000-5000r/min的攪拌速率，攪拌10-30min，然后再次中速離心，分離沉淀二和上清液二 ；步驟D:所得上清液二和所得上清液一混合后橫向切流濃縮；或?qū)⑺蒙锨逡憾退蒙锨逡阂环謩e橫向切流濃縮后混合；橫向切流濃縮所用的濾膜的孔徑為10-500KDa，胚液濃縮倍數(shù)為濃縮2-10倍；得到病毒胚液的濃縮液。
3.如權(quán)利要求2所述的提高胚液病毒滴度的方法，其特征在于，橫向切流濃縮所用的濾膜的孔徑為30-150KDa。
4.如權(quán)利要求2所述的提高胚液病毒滴度的方法，其特征在于，橫向切流濃縮所用的濾膜的孔徑為50-100KDa。
5.用權(quán)利要求1所述的病毒釋放緩沖液所述病毒釋放緩沖液制備多聯(lián)苗的方法，包括如下具體步驟步驟A 分別取所述病毒釋放緩沖液和病毒胚液；步驟B 將病毒胚液中速離心，即以6000-9000r/min的速率離心15_60min，分離沉淀一和上清液一；步驟C 按沉淀質(zhì)量病毒釋放緩沖液質(zhì)量1 :10-100向所得沉淀中加入所述病毒釋放緩沖液，混合均勻后，在2-8°C以1000-5000r/min的攪拌速率，攪拌10-30min，然后再次中速離心，分離沉淀二和上清液二 ；步驟D:所得上清液二和所得上清液一混合后橫向切流濃縮；或?qū)⑺蒙锨逡憾退蒙锨逡阂环謩e橫向切流濃縮后混合；橫向切流濃縮所用的濾膜的孔徑為10-500KDa，胚液濃縮倍數(shù)為濃縮2-10倍；得到病毒胚液的濃縮液。
6.步驟E:將按步驟A、B、C和D制備的多個(gè)不同病毒胚液的濃縮液混合，即得多聯(lián)苗。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種病毒釋放緩沖液及用所述病毒釋放緩沖液提高胚液病毒滴度的方法，分別取所述病毒釋放緩沖液和病毒胚液；將病毒胚液中速離心，分離沉淀一和上清液一；向所得沉淀中加入所述病毒釋放緩沖液，混合均勻后，在2-8℃以1000-5000r/min的攪拌速率，攪拌10-30min，然后再次中速離心，分離沉淀二和上清液二；所得上清液二和所得上清液一混合后橫向切流濃縮；或?qū)⑺蒙锨逡憾退蒙锨逡阂环謩e橫向切流濃縮后混合；橫向切流濃縮所用的濾膜的孔徑為10-500KDa，胚液濃縮倍數(shù)為濃縮2-10倍；得到病毒胚液的濃縮液。該方法能夠提高胚液禽類病毒的檢測(cè)病毒滴度，處理病毒后能夠提高病毒顆粒的穩(wěn)定性，對(duì)病毒抗原沒(méi)什么影響，且可大量處理胚液病毒，處理速度快。
文檔編號(hào)A61K39/295GK102533679SQ20121004909
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者張東霞, 徐家華, 施維松, 湯欽, 陳瑞愛(ài) 申請(qǐng)人:廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司, 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司