專利名稱：一種尖吻蝮蛇溶栓酶及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種尖吻蝮蛇溶栓酶及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
從六十年代至今的半個(gè)世紀(jì)中世界各國(guó)科學(xué)工作者對(duì)蛇毒的開(kāi)發(fā)利用做了大量研究工作，截止到目前已從蛇毒中分離到了幾十種蛇毒酶。這些酶從功能角度劃分主要為兩大類，一類為類凝血酶(thrombin-like enzyme,簡(jiǎn)稱TLC),其作用為通過(guò)凝血達(dá)到止血；另一類為纖溶酶(fibrinolytic enzymy,簡(jiǎn)稱FE),其能夠水解纖維蛋白原和纖維蛋白，其作用為溶栓和降低血液粘度。在溶栓酶中比較典型的代表產(chǎn)品為日本生產(chǎn)的東菱克拴酶，該酶是從巴西蝮蛇的蛇毒中分離得到，由231個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量36kD。后經(jīng)基因克隆發(fā)酵生產(chǎn)，其主要成分為巴曲酶(Batroxobin)。該藥1994年進(jìn)入我國(guó)，其主要作用為溶栓，臨床用于治療腦梗塞、冠心病、肺心病和下肢靜脈血栓。我國(guó)科研工作者在蛇毒纖溶酶開(kāi)發(fā)領(lǐng)域中也取得一定成果。1979年郝文學(xué)等從蛇島黑眉蝮蛇(Agkistondon chalys saxatilis)提取到一種纖溶酶,取名蛇島腹抗栓酶。1981年陳建智和覃公平等從東北白眉蝮蛇蛇毒中分離到一種纖溶酶，取名清栓酶。1985年郝文學(xué)與陳智遠(yuǎn)等從浙江蝮蛇(Agkistondon chalys pallas)中發(fā)現(xiàn)了一種溶栓酶,命名為抗栓酶一 3號(hào)。之后湯圣希和舒雨雁等從尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)中也精制提取到了溶栓酶。1992年肖昌華從3g從尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)中到380mg祛纖酶組分，收率12.6*%。2004年吳梧桐等在武夷山尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)中分離得到一個(gè)具有溶栓作用的酶，該酶由兩個(gè)相同亞基組成，分子量30298D，并進(jìn)行了 N末端15個(gè)氨基酸序列測(cè)定。2006年孫明忠等 報(bào)道從長(zhǎng)白山白眉蝮蛇(Agkistrodon blomhoffii ussurensis)中分離到一個(gè)約26kD纖溶酶組分，收率4%。本發(fā)明人從我國(guó)的尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus，俗稱五步蛇)蛇毒中分離純化得到一種單組分具有纖溶活性的溶栓酶。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種尖吻蝮蛇溶栓酶，其是從尖吻蝮蛇蛇毒中分離純化得到的一種具有溶解纖維蛋白活性的酶。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種制備上述溶栓酶的方法。本發(fā)明的還一個(gè)目的在于提供上述溶栓酶在制備治療腦梗塞、冠心病、肺心病或下肢靜脈血栓的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的溶栓酶是從中國(guó)尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒凍干粉中分離得到的溶栓酶。該酶具有如下特征:①酶蛋白含197個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示；②分子量為22783D 等電點(diǎn)pi為5.4 ;④體外能夠水解纖維蛋白酶活性可被苯甲基磺酰氟(PMSF)完全抑制，表明其是一種絲氨酸蛋白酶。本發(fā)明還提供上述溶栓酶的制備方法，其包括如下步驟:I)預(yù)處理蛇毒凍干粉；2)洗脫預(yù)處理后的蛇毒溶液，收集NaCl溶液的洗脫液；3)步驟2)中的洗脫液經(jīng)濃縮、透析去除NaCl ；4)再次洗脫步驟3)中透析后的溶液，收集NaCl溶液的洗脫液；5)步驟4)中的洗脫液經(jīng)濃縮、透析去除NaCl ;重復(fù)步驟4)和5) —次以上。其中，步驟I)蛇毒預(yù)處理的方法是將蛇毒用預(yù)冷的0.01MpH7.0 7.5PBS溶解，溶解液經(jīng)離心、透析或超濾濃縮，得蛇毒濃縮液。其中透析袋截留分子量為7，OOOD^IO, 000D ；采用切向流超濾，超濾膜截留分子量為5，000D 10，OOOD0將離心上清液稀釋2_5次、超濾濃縮。通過(guò)預(yù)處理可以去除不溶的雜質(zhì)以及小分子多肽，并降低溶液離子強(qiáng)度。具體地說(shuō)可通過(guò)如下步驟進(jìn)行蛇毒的預(yù)處理:稱取蛇毒若干克，用蛇毒重量5 10倍體積預(yù)冷的0.0lM pH7.0 7.5的PBS于4 8 V的層析柜中攪拌溶解3(Γ60分鐘，于O0C >5, 000 10，OOOg離 心1(Γ20分鐘，將離心上清液傾入透析袋中，離心沉淀再次加入蛇毒重量5 10倍體積預(yù)冷的PBS攪拌懸浮，再次離心。合并兩次離心上清液于透析袋(截留分子量為7, 000D 10，000D)中，在4 8°C層析柜中對(duì)0.01MpH7.0 7.5的PBS透析12 24小時(shí)，期間換液2 4次，以去除小分子多肽和降低溶液離子強(qiáng)度。如上所述，各透析步驟均可采用切向流超濾(超濾膜截留分子量為5，OOO^IOOOOD)方法代替，通過(guò)PBS稀釋、超濾濃縮，再稀釋、再超濾濃縮的方式以去除小分子多肽和脫鹽降低溶液離子強(qiáng)度。其中，步驟2)和步驟4)采用0.0lM ρΗ7.0 7.5的PBS預(yù)平衡DEAE — SephroseFF層析柱，用含(TlM NaCl的0.0lM ρΗ7.0 7.5的PBS分段洗脫。步驟2)中的所述NaCl溶液為洗脫峰為0.06Μ的NaCl溶液。其中，步驟3)和步驟5)的目的均是去除溶液中存在的NaCl。洗脫液濃縮方式為超濾濃縮。小體積濃縮液可直接進(jìn)行透析；也可通過(guò)PBS稀釋、超濾濃縮，再稀釋、再超濾濃縮的方式以濃縮蛋白，脫去NaCl。最終被純化的酶濃縮液可直接采用S印hadex_G25柱脫鹽。步驟4)中的所述NaCl溶液為洗脫峰為0.085M的NaCl溶液。本發(fā)明還包括步驟6)冷凍干燥。本發(fā)明的溶栓酶具有體外溶解纖維蛋白的活性。本發(fā)明還提供了上述溶栓酶在制備治療腦梗塞、冠心病、肺心病或下肢靜脈血栓的藥物中的應(yīng)用。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了一種治療血栓的藥物，其含有上述溶栓酶。經(jīng)本發(fā)明方法純化的溶栓酶比活力為2IU/mg。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 一條帶，還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(還原SDS-PAGE) —條帶；HPLC分析純度97%以上。以蛇毒原料重量計(jì)，本法純化收率為5% - 6%。本發(fā)明提供的溶栓酶具有良好的抗血栓活性，同時(shí)由于其不具有溶栓酶常見(jiàn)的出血毒性，因此該溶栓酶有望作為一種潛在抗血栓藥物進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明純化后的溶栓酶經(jīng)還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(還原SDS-PAGE)為一條帶。SDS-PAGE:左列標(biāo)準(zhǔn)蛋白，右列:蛇毒溶栓酶。
圖2為本發(fā)明純化后的溶栓酶HPLC分析結(jié)果。圖3為本發(fā)明溶栓酶在由1%牛纖維蛋白原制成的纖維蛋白平板上的水解作用。圖中編號(hào)廣5:分別代表每毫升中含尿激酶2114118111611321認(rèn)6 8:811^/1111分離到的蛇毒溶栓酶。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明中涉及到的百分號(hào)“％”，若未特別說(shuō)明，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分t匕，除另有規(guī)定外，是指溶液IOOml中含有溶質(zhì)若干克；液體之間的百分比，是指在20°C時(shí)容量的比例。本發(fā)明中類似“用蛇毒重量10倍體積預(yù)冷的”表述，其中的重量和體積的單位分別是g和ml。實(shí)施例1蛇毒溶栓酶的制備I取IOg尖吻蝮蛇蛇毒干粉(購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所)，用蛇毒重量10倍體積預(yù)冷的0.0lM pH7.4的PBS于4°C的層析柜中攪拌溶解30分鐘，于4°C、IOOOOg離心10分鐘，將離心上清液傾入透析袋中，離心沉淀再次加入蛇毒重量10倍體積預(yù)冷的PBS攪拌懸浮，再次離心。合并兩次離心上清液于透析袋(截留分子量為7000D)中，在4°C層析柜中對(duì)0.0lM pH7.4的PBS透析24小時(shí)，期間換液3次。將DEAE-S^hrose FF 填料裝至 0 3.5cmX30cm 柱中，用 0.0lM 的 PBS (pH7.4)平
衡柱后待用。將預(yù)處理后的蛇毒溶液上經(jīng)0.0lM pH7.4的PBS預(yù)平衡的DEAE — Sepharose FastFlow陰離子交換層析柱，用0.0lM pH7.4PBS洗柱，再分別用含0.02M、0.06M和1.0M NaCl的0.0lM pH7.4的PBS分段洗脫，收集0.06M NaCl溶液的洗脫峰753ml ;經(jīng)酶活測(cè)定、SDS-PAGE和HPLC檢測(cè)，目的物出現(xiàn)在0.06M NaCl溶液的洗脫峰中。采用Millipore Pellicon2切向流超濾器(0.1M2CUt off5k膜)超濾濃縮至102ml，將該收集液傾入透析袋(7000D)中，用5000ml0.01MpH7.4的PBS于4°C透析24小時(shí)，期間更換溶液3次。將透析后的酶溶液第二次上到經(jīng)預(yù)平衡的DEAE — Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱，用0.0lM pH7.4的PBS洗柱，再分別用含0.02M、0.04M、0.06M、0.085M和1.0MNaCl的0.0lM pH7.4的PBS分段洗脫，收集0.085M NaCl溶液洗脫峰，得洗脫液413ml。經(jīng)酶活測(cè)定、SDS - PAGE分析和HPLC檢測(cè)，目的物出現(xiàn)在0.085MNaCl溶液洗脫峰中。采用Millipore Pellicon2切向流超濾器(0.1M2CUt off 5k膜)超濾濃縮至105ml,將該收集液傾入透析袋(7000D)中，用5000ml0.0lM pH7.4的PBS于4°C透析24小時(shí)，期間更換溶液3次。將透析后的酶溶液第三次上到經(jīng)預(yù)平衡的DEAE — Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱，用0.0lM ρΗ7.4的PBS洗柱，再分別用含0.04Μ、0.06Μ、0.085Μ和1.0M NaCl的0.0lM ρΗ7.4的PBS分段洗脫，收集0.085Μ NaCl溶液洗脫液的洗脫峰，得洗脫液330ml。經(jīng)酶活測(cè)定、SDS - PAGE分析和HPLC檢測(cè)，確認(rèn)目的物出現(xiàn)在0.085M NaCl溶液的洗脫峰中。測(cè)定該溶液中總蛋白質(zhì)含量為512mg，最終收率5.12%。還原SDS — PAGE和SDS —PAGE均為一條帶(見(jiàn)圖1)。HPLC分析純度98% (見(jiàn)圖2和表1)，Waters HPLC，分析柱:300mmX7.8mm、粒徑5 μ m ;流動(dòng)相:0.2M的磷酸緩沖液,流速lml/min,柱溫30°C。等電聚焦電泳測(cè)定該酶等電點(diǎn)Pl為5.4。溶栓酶比活力測(cè)定2IU/mg (見(jiàn)圖3)。該純化得到的樣品經(jīng)DENOVO法氨基酸測(cè)序，該蛋白由197個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。僅按氨基酸計(jì)算分子量為22783Dalton (不排除酶分子上存在糖基化修飾)。表IHPLC分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種尖吻蝮蛇溶栓酶，其氨基酸序列是: 1)SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列；或 2)SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有同等活性的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述溶栓酶的基因。
3.權(quán)利要求1所述溶栓酶的制備方法，其包括如下步驟: 1)預(yù)處理蛇毒凍干粉； 2)洗脫預(yù)處理后的蛇毒溶液，收集NaCl溶液的洗脫液； 3)步驟2)中的洗脫液經(jīng)濃縮、透析去除NaCl； 4)再次洗脫步驟3)中透析后的溶液，收集NaCl溶液的洗脫液； 5)步驟4)中的洗脫液經(jīng)濃縮、透析去除NaCl;重復(fù)步驟4)和5) —次以上。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟I)蛇毒預(yù)處理的方法是將蛇毒用預(yù)冷的0.0lM pH7.0 7.5PBS溶解，溶解液經(jīng)離心、透析或超濾濃縮，得蛇毒濃縮液。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)和步驟4)采用0.0lM pH7.0 7.5的 PBS 預(yù)平衡 DEAE - Sephrose FF 層析柱，用含(TlM NaCl 的 0.0lM ρΗ7.0 7.5 的 PBS分段洗脫。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)中的所述NaCl溶液為洗脫峰為0.06Μ 的 NaCl 溶液。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟4)中的所述NaCl溶液為洗脫峰為0.085Μ 的 NaCl 溶液。
8.如權(quán)利要求2 7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，還包括步驟6)冷凍干燥。
9.權(quán)利要求1所述溶栓酶在制備治療腦梗塞、冠心病、肺心病或下肢靜脈血栓的藥物中的應(yīng)用。
10.一種治療血栓的藥物，其特征在于，其含有權(quán)利要求1所述的溶栓酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種尖吻蝮蛇溶栓酶，其氨基酸序列是1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有同等活性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了該酶的制備方法，包括通過(guò)預(yù)處理去除不溶物，再通過(guò)三次陰離子交換柱層析，收集活性洗脫峰，經(jīng)透析、超濾濃縮及脫鹽后即得高純度蛇毒溶栓酶，其比活力為2IU/mg蛋白，HPLC純度不低于97%，以蛇毒原料重量計(jì)純化收率為5%－6%。本發(fā)明提供的溶栓酶具有良好的抗血栓活性，同時(shí)由于其不具有溶栓酶常見(jiàn)的出血毒性，因此該溶栓酶有望作為一種潛在抗血栓藥物進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P9/10GK103184207SQ20121022942
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者王錫娟, 孫狄 申請(qǐng)人:北京康辰藥業(yè)有限公司