專利名稱：：間氯苯甲?；〈摎渌w薊賓制備抗病毒藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，本發(fā)明涉及一個23位間氯苯甲?；〈?,3-脫氫水飛薊賓酯類衍生物即化合物間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3,5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯的醫(yī)藥用途。該化合物被發(fā)現(xiàn)具有抑制單純皰疹病毒HSV-1的功效，可以預(yù)期用于制備治療單純皰疹病毒引發(fā)的病毒感染和/或口腔潰瘍疾病的藥物用途。
背景技術(shù)：
：單純皰疹病毒在全球廣泛流行，人類是其唯一宿主。其直徑約為120-150微米，含有DNA的核位于中間，向外依次由包膜、體被、衣殼三種同心結(jié)構(gòu)組成，衣殼表面為162個殼微粒組成的3:3:2軸對稱的20面體，在低溫下可生存數(shù)月，濕熱5(TC及干燥9(TC30分鐘滅活。單純皰疹病毒可分為I型和II型二種，I型皰疹病毒(HSV-1)主要感染腰以上部位的皮膚粘膜和器官，HSV-1主要通過呼吸道、皮膚和粘膜密切接觸傳播，99%的口唇粘膜、鼻前庭、眼結(jié)膜、咽喉部的炎癥及皰疹，口和口周圍發(fā)生的皰疹都是由I型皰疹病毒感染引起的。在發(fā)達國家如美國其感染率分別為兒童期2040°/。、成年期5070%。單純皰疹病毒感染及其導(dǎo)致的口腔潰瘍易反復(fù)發(fā)作，目前尚無特效治療方法，臨床上主要的治療措施包括局部治療和全身^療，西醫(yī)治療以局部用碘甘油及維生素B1、B2和維生素C口服，一般療效不甚明顯。嚴(yán)重、頑固的口腔潰瘍則需內(nèi)服激素類藥品、抗菌素類藥品等，使用此類藥物又存在較大的毒副作用和易使病人產(chǎn)生耐藥性和菌群失調(diào)的不足之處。如目前臨床常用的單純皰疹病毒感染治療藥物無環(huán)鳥苷即阿昔絡(luò)韋，主要適用于病毒復(fù)制的原發(fā)性感染和復(fù)發(fā)性感染，對潛伏感染難以發(fā)揮作用。中藥對抗單純皰疹病毒感染所用之外用藥包括錫類散、冰硼散等外用制劑，但治療效果不十分理想；內(nèi)服藥包括牛黃解毒丸、牛黃上清丸等，又對本病癥無顯著的針對性。近期出現(xiàn)的不少新的口腔含片類藥物制劑如西瓜霜含片、華素片和溶菌酶含片等分別在口感、殺菌、抗炎方面有所進步。但是有些又不適于哺乳期婦女、甲狀腺功能亢進患者和碘過敏者。因此，應(yīng)用現(xiàn)代病毒藥理學(xué)技術(shù)，開發(fā)出新的抗HSV-1感染以及治療口腔潰瘍天然藥物是十分必要的。避開核苷類抗病毒藥物的副作用，尋找創(chuàng)新性的先導(dǎo)化合物骨架，以期開發(fā)出新型抗單純皰疹病毒感染藥物或與己上市之抗HSV-1感染藥物聯(lián)用，是本發(fā)明的目的。隨著世界范圍內(nèi)對傳統(tǒng)植物藥或動物藥等天然醫(yī)藥資源研究開發(fā)的重視，學(xué)者們對天然產(chǎn)物這一毒副作用小的資源越發(fā)青睞，并從中篩選出多種抗單純皰疹病毒感染的活性化合物。如已見報道的原花色素類化合物proanthocyanidindimer對HSV-1的半數(shù)抑制濃度IC5Q為250微克/毫升(A.M.Baldeetal,尸toAera^ie^^cA，4，182);生物堿類天然產(chǎn)物中也發(fā)現(xiàn)了對單純皰疹病毒HSV-1具強效抑制作用的化合物，如N-甲基-crotsparine對HSV-1的半數(shù)抑制濃度ICs。為8.3微克/毫升(A.Nawanietal,Biol.Pharm.Bull.1999,22,268274);近期，我國學(xué)者馮孝章等發(fā)現(xiàn)梔子苷具有抗單純皰疹病毒感染的活性，其對HSV-1的半數(shù)抑制濃度ICso為1120微克/毫升(崔曉蘭，劉發(fā)，馮孝章，ZL200410034038.7);又有云南學(xué)者發(fā)現(xiàn)鼠尾草多糖及其酯類對單純皰瘆病毒有著較強的抑制活性，其對HSV—1的半數(shù)抑制濃度IC5。為85.6微克/毫升，治療指數(shù)110(趙聲蘭，陳朝根，李立，CN200710065989.4)。以上均說明天然產(chǎn)物及其衍生物作為抗單純皰疹病毒HSV-1活性成分的可能性。水飛薊賓是黃酮木脂素化合物，存在于菊科植物水飛薊的種子中。水飛薊已在臨床上廣泛應(yīng)用，在中國商品名為利肝隆。三十多年的臨床實驗證明該藥具有確切的療效和低毒性(參閱K.Flora等人，Am.J.Gastroenterol,1998，93，139—143;R.Saller等人，Drugs,2001,61，2035—2063)。水飛薊賓具有抗自由基活性，增強肝細胞膜對于多種損害因素的抵抗力，促進肝細胞的修復(fù)和再生，它還是一個抗菌耐藥抑制劑(Maitrejean等，BioorganicMedinicalChemitryLetters,2000，10，157-160;Guz等，JournalofMedinicalChemitry，2001，44，261-268)。因此，以水飛薊賓為代表的黃酮木脂素類化合物引起了越來越多的關(guān)注，如楊雷香，趙昱等人的論文指出其制備出的一系列水飛薊賓類衍生物也具有強效的抗氧化活性(JournalofEnzymeInhibitionandMedicinalChemistry,2006,21,399-404.)。水飛薊賓類化合物具有以上所述之確切的多種療效，然而其于抗病毒方面尤其是抑制單純皰疹病毒的新用途方面尚未得到有效開發(fā)，故此我們設(shè)計并制備了23位間氯苯甲?；〈?，3-脫氫水飛薊賓酯類衍生物，并測試了其抑制I型單純皰疹病毒HSV-1的藥理活性。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3,5,7-三羥基-4_氧代_苯并吡喃_2)-2,3-二氫-1,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯對HSV-1病毒具有較強的抑制活性，且治療指數(shù)較高，可以作為抗HSV-1病毒先導(dǎo)化合物繼續(xù)開發(fā)，從而完成本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種具有抑制單純皰疹病毒感染、防治口腔潰瘍的活性化合物。具體而言，本發(fā)明提供了一種下式所示的23位間氯苯甲?；〈?,3-脫氫水飛薊賓酯類衍生物及其可藥用鹽用于制備抑制單純皰疹病毒和/或治療口腔潰瘍藥物的用途"o其中，式(I)化合物的名稱為間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3,5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯。本發(fā)明的再一個目的是提供了一種用于防治由單純皰瘆病毒HSV-1引發(fā)的病毒感染和/或口腔潰瘍的藥物或藥物組合物，^含有治療有效量的作為活性成分的式(I)化合物或其可藥用鹽和可藥用輔料。根據(jù)本發(fā)明，該藥物組合物中可加入各種藥學(xué)上可接受的藥用賦形劑，添加劑及載體。本發(fā)明的有益之處在于合成方法制備了23位間氯苯甲?；〈?，3_脫氫水飛薊賓酯，并首次發(fā)現(xiàn)了其在開發(fā)防治HSV-1病毒感染藥物領(lǐng)域中的潛力，對于開發(fā)抑制單純皰疹病毒或治療口腔潰瘍創(chuàng)新型藥物提供了新的物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明再一特點為該化合物來源于天然藥物的半合成改造，原料來源方便易得，制備步驟簡便，成本低，污染小，利于節(jié)能減排條件下的大規(guī)模開發(fā)，具有潛在的社會效益和經(jīng)濟效益。具體實施方案'為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面通過實施例進一步說明本發(fā)明。實施例給出了間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3,5,7-三輕基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯的制備和純化方法及其相關(guān)結(jié)構(gòu)鑒定的數(shù)據(jù)。必須說明，實施例中所述的制備方法以及分離純化方法是用于對本發(fā)明的說明而不是對本發(fā)明的限制。除非另有說明，本發(fā)明中的百分?jǐn)?shù)是重量百分?jǐn)?shù)。實施例1:式(I)化合物間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯萄-6-(3,5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯的制備1.12，3-脫氫水飛薊賓的制備在干燥的反應(yīng)瓶中加入1.02克水飛薊賓，10克醋酸鉀，再加入50毫升冰醋酸，冰浴下再加入溶有1克碘的冰醋酸50毫升。加熱回流5小時。降溫后加入50毫升冰水，醋酸乙酯提取(20毫升x4次)，提取液有機層合并，水洗，無水硫酸鈉干燥。過濾，濾液濃縮，得紅棕色固體，加入含有6毫升鹽酸的乙醇溶液50毫升。加熱回流3小時。降溫，析出黃色固體，用醋酸乙酯重結(jié)晶得粗品2，3-脫氫水飛薊賓黃色粉末0.95克，直接用于下一步反應(yīng)。1.2式(I)化合物的制備在干燥的反應(yīng)瓶中加入0，95克上述2，3-脫氫水飛薊賓粗品，0.616克間氯苯甲酸，1.571克三苯基磷，用20毫升無水四氫呋喃溶解后加入1.04克(0.8毫升)偶氮二羧酸乙酯DEAD，室溫攪拌6小時。減壓蒸除溶劑，加入少量氯仿，濾去不溶物，母液濃縮后用6克200-300目硅膠拌樣，用40克200-300目硅膠柱層析，石油醚/醋酸乙酯=2:l洗脫，薄層TLC檢測合并，純化得到式(I)化合物1.082克。Rf(石油醚/醋酸乙酯=1:1):0.31;核磁共振氫譜&NMR(400MHz，氖代丙酮)5:4.63(多重峰，1H),4.85(多重峰，2H)，5.02(多重峰，m),6.28(雙峰，J=2.0Hz，1H),6.47~6.58(多重峰，3H,芳香環(huán)Ar-H)，6.62(雙峰，J=2,0Hz,1H),6.81(雙峰，J=8.4Hz,1H),7,28~7.89(多重峰，4H,芳香環(huán)Ar-H)，7.96(雙峰，J=2.0Hz,1H)，8.01(雙雙峰，J=8.4，2.0Hz，1H)，1U5(單峰，1H，5-OH);電噴霧質(zhì)譜ESI-MS:617(M—1)+。本發(fā)明的又一特點是，經(jīng)藥理實驗證明全合成得到的23位間氯苯甲?；〈?,3-脫氫水飛薊賓新的酯類衍生物即式(I)化合物對單純皰疹病毒HSV-1有強效抑制作用，其IC5o值為44.78微克/毫升。說明該化合物有望開發(fā)成為抑制由單純皰疹病毒HSV-1引發(fā)的病毒感染和/或治療口腔潰瘍藥物。本發(fā)明中制備得到的水飛薊賓類新的23-酯類衍生物即式(I)化合物或其可藥用鹽用制藥領(lǐng)域中的常規(guī)方法，結(jié)合中、西藥制藥中常規(guī)的可藥用輔料，可以制成各種藥物組合物，如注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑，或控釋或緩釋劑型或納米制劑。這些藥物組合物可以用于預(yù)防或/和治療由單純皰疹病毒HSV-1引發(fā)的病毒感染和/或口腔潰瘍。本發(fā)明所涉及的的式(I)化合物或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的治療單純皰疹病毒感染、口腔潰瘍的常用藥物聯(lián)合或S叉使用，制備得到具有治療單純皰瘆病毒感染、口腔潰瘍的組合物或復(fù)方制劑?？山M合的藥劑例子包括阿昔絡(luò)韋(ACV)、萬乃洛韋(VCV)、泛昔絡(luò)韋(FCV)、噴昔洛韋(PCV)、阿糖腺苷(ara-T)、溴乙烯去氧鳥苷(BVDU)、膦甲酸(PFA)、更昔絡(luò)韋(GCV)等。此外，其還可以與神經(jīng)痛鎮(zhèn)痛藥物以及解熱鎮(zhèn)痛藥物合并用藥。下面本發(fā)明通過藥理相關(guān)實施例的方式說明式(I)化合物對單純皰疹病毒抑制作用的藥理實驗結(jié)果。實驗結(jié)果說明式(I)化合物在抗單純皰疹病毒、抑制口腔潰瘍的藥物研究領(lǐng)域中的用途；本發(fā)明人還測試了其對Vero細胞的半數(shù)細胞毒活性數(shù)據(jù)(TD5())，用以說明該化合物的毒性，從而評價其治療指數(shù)(TI)。，實施例2:采用MTT法測定式(I)化合物對Vero細胞的細胞毒性，以及用微量細胞病變抑制(CPE)法研究式(I)化合物對HSV-1的抑制作用試驗2,1.實驗材料與樣品2丄1病毒單純皰疹病毒-I型(Herpessimplexvirus-l，HSV-l)，浙江大學(xué)中藥與天然藥物研究室提供。2丄2細胞Vero細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫。細胞用含10%小牛血清得RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，維持液為含1.0%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。2丄3試劑2.1.3.1RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；.11.3.2MTT:Amresco公司產(chǎn)品，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司分裝；2丄3.3小牛血清杭州四季青生物工程有限公司；2.1.3.4青霉素石家莊制藥集團有限公司；2.1.3.5鏈霉素石家莊制藥集團有限公司；2丄3.6細胞消化液含0.25%胰蛋白酶，0.02。/oEDTA-Na2,用Hank，s液配制；2丄3.7阿昔絡(luò)韋湖北科益藥業(yè)股份有限公司，0.25g/支；2.1.4儀器2丄4.1二氧化碳(C02)培養(yǎng)箱2306-2型，Shdlab公司;2丄4.2倒置顯微鏡XD-2型，重慶光電儀器有限公司；2丄4.3生物安全柜A/B3型，Labconco公司；2丄4.4酶標(biāo)儀Synergy-HT型，BIO-TEK公司；2丄4.5立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠；2丄4.6紫外分光光度計UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；2丄4.7除菌過濾器Sterifil500型，Millipore公司;2丄4.S超純水系統(tǒng)UPWS-I-60D型，杭州永潔達凈化科技有限公司。2.2.細胞培養(yǎng)和病毒傳代將Vero細胞培養(yǎng)于含10%滅活小牛血清，100U/毫升青霉素和100微克/毫升的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37。C，5%二氧化碳，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將HSV-1加入長有單層Vero細胞的細胞瓶中，置37。C，5%二氧化碳，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清，置低溫下保存。2.3.實驗方法2.3.1采用MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽]法測定間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3,5,7-三羥基-4-氧，-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-1,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯對Vero細胞生長的抑制f^用(1)測試藥物實施例1制備得到的間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3,5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯；阿昔洛韋(ACV)為陽性對照藥物。(2)取對數(shù)生長期的Vera細胞，用培養(yǎng)基將細胞稀釋成1X10V毫升，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100微升，在37"，5%二氧化碳，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后加入用培養(yǎng)基稀釋的間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3,5，7_三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯，濃度分別為400微克/毫升，200微克/毫升，40微克/毫升和8微克/毫升，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72小時后，每孔加入MTT試劑IO微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄去培養(yǎng)基，每孔加入二甲亞砜200微升，用振蕩器振蕩20分鐘，在570nm波長下用酶標(biāo)儀測定OD值。以只加培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔為對照孔。實驗重復(fù)三次。根據(jù)不同濃度下對細胞生長的抑制率，計算對細胞生長的半數(shù)抑制濃度(TD50)。抑制率(％)=(對照孔OD值—實驗組OD值)/對照孔OD值X100。/。。2.3.2用微量細胞病變抑制法測定樣品對病毒生長^P制作用取對數(shù)生長期的Vero細胞，用培養(yǎng)基將細胞稀釋成lxl0S個/毫升，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，37°C，5%二氧化碳，100%相對濕度培養(yǎng)24小時，加入lOOTCIDso的病毒IOO微升，傾出病毒，分別加入不同濃度的間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l,4-苯并二氧六環(huán)_2]-甲基酯，同時設(shè)正常細胞對照和病毒感染對照，37°C，5%二氧化碳，100%相對濕度培養(yǎng)48小時后在倒置顯微鏡下觀察細胞病變。以五級標(biāo)準(zhǔn)作為判斷細胞病變的標(biāo)準(zhǔn)一細胞無變化，分值為8分；+:25%以下細胞出現(xiàn)病變，分值為6分；++:25%50%細胞出現(xiàn)病變，分值為4分；+++:50%75%細胞出現(xiàn)病變，分值為2分；++++:75%以上細胞出現(xiàn)病變，分值為0分。計算半數(shù)抑制濃度(IC5())。同時甩阿昔洛韋作為陽性對照藥。計算樣品治療指數(shù)TI二半數(shù)中毒濃度(TD5())/半數(shù)抑制濃度(IC5o)。2.4.實驗結(jié)果結(jié)果如表一顯示，間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3,5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-l，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯能顯著抑制HSV-1的復(fù)制，其對HSV-1的半數(shù)抑制濃度和治療指數(shù)如表所示。表一.式(I)化合物對HSV-1的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注TD5o指樣品對細胞生長的半數(shù)抑制濃度(微克/毫升)；ICs。為樣品對病毒復(fù)制的半數(shù)抑制濃度(微克/毫升)；TI(治療指數(shù))=TD5C/IC50。2.5.結(jié)論上述試驗結(jié)果說明，間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5,7-三羥基-4-氧代-苯并吡口南-2)-2,3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯對I型單純皰疹病毒有著較為強效的抑制作用，其抑制強度雖然低于陽性對照藥(阿昔洛韋)及文獻報道中的N-甲基-crotsparine(IC5。為8.3微克/毫升)，但是其抑制強度大大強于文獻報道中的原花色素類化合物proanthocyanidindimer(IC5Q為250微克/毫升)、梔子苷(IC5o為U20微克廣升)、鼠尾草多糖及其酯類(IC5Q為85.6微克/毫升)等，從而可以預(yù)期進一步開發(fā)成為抑制HSV-1感染疾病如口腔病毒性皰疹和口腔潰瘍的藥物。在上述說明書闡述本發(fā)明時，同時提供了實啤例的目的是舉例說明本發(fā)明的實際操作過程和本發(fā)明的意義。在進入本發(fā)明權(quán)利要求和其等同物范圍內(nèi)時，本發(fā)明的實際應(yīng)用包括所有一般變化、配合，或改進。權(quán)利要求1.一種如式(I)所示的間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯或其可藥用鹽用于制備抑制單純皰疹病毒和/或治療口腔潰瘍的藥物的用途。式(I)2.—種用于防治由單純皰疹病毒HSV-1引發(fā)的病毒感染和/或口腔潰瘍的藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的式(I)化合物或其可藥用鹽和可藥用輔料。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物或藥物組合物，其劑型是注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑，或控釋或緩釋劑型或納米制劑。全文摘要本發(fā)明涉及間氯苯甲?；〈摎渌w薊賓制備抗病毒藥物的用途。具體而言，本發(fā)明涉及一個23位間氯苯甲?；〈?，3-脫氫水飛薊賓酯類衍生物，即化合物間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯或其可藥用鹽在制備防治由單純皰疹病毒HSV-1引發(fā)的病毒感染和/或口腔潰瘍藥物的藥物用途。該化合物由化學(xué)方法半合成制備而得，經(jīng)藥理實驗證明，該化合物對單純皰疹病毒HSV-1有確切的抑制作用，其半數(shù)抑制濃度IC₅₀值為44.78微克/毫升。文檔編號A61P1/02GK101543491SQ200910097710公開日2009年9月30日申請日期2009年4月20日優(yōu)先權(quán)日2009年4月20日發(fā)明者巫秀美,蘇曾,李校堃,李海波,峰汪,佳瞿,昱趙,黃可新,龔景旭申請人:溫州醫(yī)學(xué)院;李校堃