專利名稱：一種熒光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學材料和光功能材料技術領域，具體涉及一種具有光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架的制備方法。
背景技術：
骨組織工程支架材料是指能與成骨細胞結合并能植入生物體的材料，它是組織工程化骨的最基本構架，被認為是在進行骨修復和替代治療的最有前景的一種生物材料。目前，骨組織工程支架材料主要分為生物衍生材料、陶瓷材料和高分子材料三類，但是都存在一些問題而難以應用，如生物衍生材料常常會引起劇烈的免疫排斥反應，羥基磷灰石是等陶瓷材料力學性能較差、降解難控制，高分子材料的力學強度及降解速度難以滿足臨床的要求。因此，為了彌補上述材料的缺點，從骨的成分和結構仿生制備骨組織工程支架材料， 即采用磷灰石與膠原、殼聚糖、明膠等生物高分子制備復合支架材料是該研究領域的一個主要發(fā)展方向。目前磷灰石/生物高分子復合支架的研究通常集中在改善材料的性能和生物學性能，而忽略了支架材料的體外和體內試驗的檢測、診斷等重要評價手段。稀土發(fā)光材料與相應的非稀土發(fā)光材料相比，其發(fā)光效率及光色等性能都更好， 因此近幾年稀土發(fā)光材料得到了廣泛的研究，其用途越來越廣泛，目前已有少量稀土離子摻雜磷灰石發(fā)光材料的相關研究。例如Han Yingchao, Wang Xinyu等,朽1檬酸溶膠凝膠燃燒法合成鋪摻雜的磷酸I丐納米晶[J].溶膠凝膠科學與技術學報，(Synthesis of terbium doped calcium phosphate nanocrystalIine powders by citric acid sol—gel combustion method [J]. Journal of Sol-Gel Science and Technology) 2009,49: 125-129，該文采用檸檬酸溶膠凝膠法燃燒的方法制備了鋱摻雜的磷酸鈣納米晶，主相為羥基磷灰石，次相為beta-TCP,該晶體表現(xiàn)出了鋪的發(fā)光特性。Long, Mei, Hong Fashui等， 尺寸相關微結構及銪位點對Eu3+摻雜的Caltl(PO4)6(OH)2納米晶熒光性能的影響[J].發(fā)光學報，(Size-dependent microstructure and europium site preference influence fluorescent properties of Eu3+_doped Ca10 (PO4) 6 (OH) 2 nanocrystal [J]. Journal of Luminescence) 2008,128: 428-436，該文采用熱分解前軀體的方法制備了銪摻雜具有不同粒度的Caltl(PO4)6(OH)2納米晶，并認為室溫下的光致發(fā)光性依賴于尺寸效應，以及材料中 Eu3+ 占據(jù) Ca(II)或者 Ca(I)位點。Ternane R, Trabelsi-Ayedi M 等,Eu3+ 在輕基磷灰石中的發(fā)光特性[J]·發(fā)光學報，(Luminescent properties of Eu3+ in calcium hydroxyapatite [J]· Journal of Luminescence) 1999,81: 165-170,該文米用沉淀反應制備了 Eu3+時間分辨發(fā)光特性的Ca5(PO4)3OH,其發(fā)光光譜說明發(fā)光性能與材料中Eu3+的不同晶格位點相關。上述方法制備了具有發(fā)光性能的熒光粉用納米磷灰石，并證實了材料的發(fā)光性能與稀土離子在磷灰石晶格中的位置有關。在發(fā)光性能與材料的內部結構相關的基礎上，通過材料發(fā)光性能監(jiān)測及成像技術對材料的位置、結構以及環(huán)境變化等進行監(jiān)控。因此，稀土摻雜的磷灰石發(fā)光材料有望解決現(xiàn)有支架材料難以進行有效的體外和體內試驗的檢測、診斷等問題。目前幾乎沒有將稀土離子摻雜磷灰石用于制備具有光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架材料的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中難以進行有效的體外和體內試驗的檢測、診斷等問題，通過研發(fā)一種形貌和結晶程度可控、高度分散、生物相容性好的稀土離子摻雜的納米磷灰石溶膠，提供一種將上述溶膠與膠原、殼聚糖等生物高分子基體復合得到具有光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架材料的制備方法，通過下列技術方案實現(xiàn)。一種熒光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架的制備方法，其特征在于包括下列各步驟
A.在質量濃度為O.01 10%的聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入含鈣化合物，配成濃度為
O.01 3mol/L的含鈣化合物與聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液I ;
B.在質量濃度為O.01 10%的聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入磷酸鹽或磷酸，配成濃度為O. 006 I. 8mol/L的磷酸鹽或磷酸與聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液II ；
C.將步驟A和B所得混合溶液I和混合溶液II在攪拌速度為100 8000轉/分下以超聲處理進行混合，并用堿液控制PH值為10 12，形成納米羥基磷灰石溶膠III ;此時納米羥基磷灰石溶膠III中鈣磷摩爾比達I. 6 I. 7 I ；
D.在步驟C所得溶膠中，用濃度為O.5 I. 5mol/L的鹽酸調節(jié)pH值至6 7，再按稀土離子(稀土離子+鈣離子)的摩爾比=0.5 10 100，滴加濃度為O. 005 O. lmol/L 的稀土鹽溶液；
E.將步驟D所得溶液在20 200°C下，經常規(guī)陳化24 48小時，再用去離子水洗滌， 然后經離心處理，得到納米磷灰石溶膠；
F.用質量濃度為2%的醋酸溶液加入生物高分子，配成生物高分子溶液；
G.按納米磷灰石溶膠生物高分子溶液溶質的質量比為O.I O. 9 1，將生物高分子溶液與步驟E所得的納米磷灰石溶膠進行混合，得到納米磷灰石與生物高分子的混合液 IV；
H.將步驟G所得的混合液IV靜置去除氣泡，再注入模型，置于-5 -80°C下冷凍24 48小時，然后冷凍干燥24 48小時，即得到納米磷灰石/生物高分子支架；
I.將納米磷灰石/生物高分子支架用堿液或者緩沖溶液浸泡3 4小時，然后再用去離子水浸泡3 5小時，每半小時換一次水；
J.將步驟I所得納米磷灰石/生物高分子支架置于-5 _80°C下冷凍24 48小時， 再冷凍干燥24 48小時，即得到熒光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架。所述步驟A中聚乙烯吡咯烷酮的類型為K15、K30、K60或K90。所述步驟A的含鈣化合物為硝酸鈣、氯化鈣或氫氧化鈣。所述步驟B的磷酸鹽為磷酸氫二銨、磷酸氫二鈉或磷酸氫二鉀。所述步驟C的堿液為氨水、氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液。所述步驟D的稀土鹽為硝酸銪、硝酸鋱、硝酸銩、硝酸釔或硝酸鏑。所述步驟E的常規(guī)陳化是將溶液自然陳化或者置于高壓釜陳化或蒸發(fā)回流裝置中陳化。
所述步驟F的生物高分子為殼聚糖或膠原。所述步驟F配成的生物高分子溶液，是殼聚糖溶液時質量濃度為I 4%，是膠原溶液時濃度為3 20mg/mL。所述步驟I的堿液是氨水、氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液；緩沖溶液是磷酸氫二鈉或碳酸氫鈉溶液。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下突出的優(yōu)點
(1)本發(fā)明制備的具有光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架，是稀土離子摻雜的納米磷灰石以溶膠狀態(tài)與生物高分子溶液充分混合分散，注模成型的，使得磷灰石顆粒在生物高分子基體中分散良好且與基體之間能形成穩(wěn)定的鍵合，并具有光學穩(wěn)定性和良好發(fā)光性能的光標記特性。本發(fā)明彌補了現(xiàn)有技術中沒有光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架制備方法的空白，解決了現(xiàn)有支架材料難以進行有效的體外和體內試驗的檢測、診斷等問題，實現(xiàn)了通過材料發(fā)光性能監(jiān)測及成像技術對材料的位置、結構變化以及環(huán)境變化等進行監(jiān)控；
(2)本發(fā)明改進并優(yōu)化了工藝，制備過程中磷灰石的形貌和結晶程度可控，進而實現(xiàn)發(fā)光性能的可控，具有光學穩(wěn)定性和良好的發(fā)光性能，因此用途廣泛，特別適用于生物醫(yī)學材料及其臨床的診斷和監(jiān)測領域；
(3)本發(fā)明制備工藝簡單，操作簡捷，易于推廣應用。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發(fā)明作進一步地詳細說明，但實施方式并不僅限于此。實施例I
A.在質量濃度為O.01%的K15型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入氫氧化鈣，配成濃度為
O.01mol/L的氫氧化鈣與聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液I ;
B.在質量濃度為O.01%的K15型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入磷酸，配成濃度為
O.006mol/L的磷酸與聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液II ；
C.將步驟A和B所得混合溶液I和混合溶液II在攪拌速度為100轉/分下以超聲處理進行混合，并用氨水控制pH值為10，形成納米羥基磷灰石溶膠III ;此時納米羥基磷灰石溶膠III中鈣磷摩爾比達I. 6 I ；
D.在步驟C所得溶膠中，用濃度為O.5mol/L的鹽酸調節(jié)pH值至6，再按銪離子(銪離子+鈣離子)的摩爾比=0. 5 100，滴加濃度為O. 005mol/L的硝酸銪溶液；
E.將步驟D所得溶液在20°C下，經自然陳化24小時，再用去離子水洗滌，然后經離心處理，得到納米磷灰石溶膠；
F.用質量濃度為2%的醋酸溶液加入殼聚糖，配成質量濃度為1%的殼聚糖溶液；
G.按納米磷灰石溶膠殼聚糖溶液溶質的質量比為O.I 1，將殼聚糖溶液與步驟E 所得的納米磷灰石溶膠進行混合，得到納米磷灰石與殼聚糖的混合液IV ；
H.將步驟G所得的混合液IV靜置去除氣泡，再注入模型，置于_5°C下冷凍24小時，然后冷凍干燥24小時，即得到納米磷灰石/生物高分子支架；
I.將納米磷灰石/生物高分子支架用質量百分比濃度為O.5%的氨水浸泡3小時，然后再用去離子水浸泡3小時,每半小時換一次水；J.將步驟I所得納米磷灰石/生物高分子支架置于_5°C下冷凍48小時，再冷凍干燥 36小時，即得到熒光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架。實施例2
A.在質量濃度為O.5%的K30型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入硝酸鈣，配成濃度為 O. lmol/L的硝酸鈣與聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液I ;
B.在質量濃度為O.5%的K30型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入磷酸氫二鈉，配成濃度為 O. 06mol/L的磷酸氫二鈉與聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液II ；
C.將步驟A和B所得混合溶液I和混合溶液II在攪拌速度為2000轉/分下以超聲處理進行混合，并用氫氧化鈉控制pH值為11，形成納米羥基磷灰石溶膠III ;此時納米羥基磷灰石溶膠III中鈣磷摩爾比達1.65 I ；
D.在步驟C所得溶膠中，用濃度為O.8mol/L的鹽酸調節(jié)pH值至6. 2，再按鋱離子
(鋪離子+鈣離子)的摩爾比=1 : 100，滴加濃度為O. 01mol/L的硝酸鋱溶液；
E.將步驟D所得溶液在80°C下，置于蒸發(fā)回流裝置中陳化36小時，再用去離子水洗滌，然后經離心處理，得到納米磷灰石溶膠；
F.用質量濃度為2%的醋酸溶液加入殼聚糖，配成質量濃度為2%的殼聚糖溶液；
G.按納米磷灰石溶膠殼聚糖溶液溶質的質量比為O.5 1，將殼聚糖溶液與步驟E 所得的納米磷灰石溶膠進行混合，得到納米磷灰石與生物高分子的混合液IV ；
H.將步驟G所得的混合液IV靜置去除氣泡，再注入模型，置于_20°C下冷凍24小時，然后冷凍干燥24小時，即得到納米磷灰石/生物高分子支架；
I.將納米磷灰石/生物高分子支架用濃度為O.05mol/L的磷酸氫二鈉溶液浸泡3小時，然后再用去離子水浸泡5小時,每半小時換一次水；
J.將步驟I所得納米磷灰石/生物高分子支架置于_20°C下冷凍24小時，再冷凍干燥 36小時，即得到熒光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架。實施例3
A.在質量濃度為2%的K60型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入硝酸鈣，配成濃度為O.5mol/ L的硝酸鈣與聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液I;
B.在質量濃度為2%的K60型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入磷酸氫二鉀，配成濃度為
O.03mol/L的磷酸氫二鉀與聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液II ；
C.將步驟A和B所得混合溶液I和混合溶液II在攪拌速度為5000轉/分下以超聲處理進行混合，并用氫氧化鉀溶液控制pH值為11. 5，形成納米羥基磷灰石溶膠III ;此時納米羥基磷灰石溶膠III中鈣磷摩爾比達I. 67 I ；
D.在步驟C所得溶膠中，用濃度為lmol/L的鹽酸調節(jié)pH值至6.5，再按銩離子(銩離子+鈣離子)的摩爾比=3 100，滴加濃度為O. 05mol/L的硝酸銩溶液；
E.將步驟D所得溶液在100°C下，置于高壓釜陳化中陳化48小時，再用去離子水洗滌， 然后經離心處理，得到納米磷灰石溶膠；
F.用質量濃度為2%的醋酸溶液加入殼聚糖，配成質量濃度為4%的殼聚糖溶液；
G.按納米磷灰石溶膠殼聚糖溶液溶質的質量比為0.9 1，將殼聚糖溶液與步驟E 所得的納米磷灰石溶膠進行混合，得到納米磷灰石與殼聚糖的混合液IV ；
H.將步驟G所得的混合液IV靜置去除氣泡，再注入模型，置于_40°C下冷凍36時，然后
7冷凍干燥24小時，即得到納米磷灰石/生物高分子支架；
I.將納米磷灰石/生物高分子支架用濃度為lmol/L碳酸氫鈉溶液浸泡4小時，然后再用去離子水浸泡3小時，每半小時換一次水；
J.將步驟I所得納米磷灰石/生物高分子支架置于_40°C下冷凍36小時，再冷凍干燥 48小時，即得到熒光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架。實施例4
A.在質量濃度為5%的K90型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入氯化鈣，配成濃度為lmol/L 的氯化鈣與聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液I;
B.在質量濃度為5%的K90型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入磷酸氫二銨，配成濃度為
0.6mol/L的磷酸氫二銨與聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液II ；
C.將步驟A和B所得混合溶液I和混合溶液II在攪拌速度為5000轉/分下以超聲處理進行混合，并用氫氧化鉀溶液控制pH值為11. 5 ，形成納米羥基磷灰石溶膠III ;此時納米羥基磷灰石溶膠III中鈣磷摩爾比達I. 67 I ；
D.在步驟C所得溶膠中，用濃度為lmol/L的鹽酸調節(jié)pH值至6.8，再按釔離子(釔離子+鈣離子)的摩爾比=5 100，滴加濃度為O. lmol/L的硝酸釔溶液；
E.將步驟D所得溶液在150°C下，自然陳化48小時，再用去離子水洗滌，然后經離心處理，得到納米磷灰石溶膠；
F.用質量濃度為2%的醋酸溶液加入膠原，配成濃度為3mg/mL的膠原溶液；
G.按納米磷灰石溶膠膠原溶液溶質的質量比為O.I 1，將膠原溶液與步驟E所得的納米磷灰石溶膠進行混合，得到納米磷灰石與膠原的混合液IV ；
H.將步驟G所得的混合液IV靜置去除氣泡，再注入模型，置于_20°C下冷凍36小時，然后冷凍干燥36小時，即得到納米磷灰石/生物高分子支架；
I.將納米磷灰石/生物高分子支架用氫氧化鈉溶液浸泡3小時，然后再用去離子水浸泡3小時，每半小時換一次水；
J.將步驟I所得納米磷灰石/生物高分子支架置于_20°C下冷凍24小時，再冷凍干燥 48小時，即得到熒光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架。實施例5
A.在質量濃度為10%的K90型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入氯化鈣，配成濃度為3mol/ L的氯化鈣與聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液I;
B.在質量濃度為10%的K90型聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入磷酸氫二鉀，配成濃度為
1.8mol/L的磷酸氫二鉀與聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液II ；
C.將步驟A和B所得混合溶液I和混合溶液II在攪拌速度為8000轉/分下以超聲處理進行混合，并用氫氧化鈉控制PH值為12，形成納米羥基磷灰石溶膠III ;此時納米羥基磷灰石溶膠III中鈣磷摩爾比達I. 7 I ；
D.在步驟C所得溶膠中，用濃度為I.5mol/L的鹽酸調節(jié)pH值至7，再按鏑離子(鏑離子+鈣離子)的摩爾比=10 100，滴加濃度為O. lmol/L的硝酸鏑溶液；
E.將步驟D所得溶液在200°C下，自然陳化48小時，再用去離子水洗滌，然后經離心處理，得到納米磷灰石溶膠；
F.用質量濃度為2%的醋酸溶液加入膠原，配成濃度為20mg/mL為膠原溶液；G.按納米磷灰石溶膠生物高分子溶液溶質的質量比為O.9 1，將生物高分子溶液與步驟E所得的納米磷灰石溶膠進行混合，得到納米磷灰石與生物高分子的混合液IV ；
H.將步驟G所得的混合液IV靜置去除氣泡，再注入模型，置于_80°C下冷凍48小時，然后冷凍干燥48小時，即得到納米磷灰石/生物高分子支架；
I.將納米磷灰石/生物高分子支架用氫氧化鉀溶液浸泡3小時，然后再用去離子水浸泡3小時，每半小時換一次水；
J.將步驟I所得納米磷灰石/生物高分子支架置于_80°C下冷凍24小時，再冷凍干燥 24小時，即得到熒光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架。
權利要求
1. 一種熒光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架的制備方法，其特征在于包括下列各步驟A.在質量濃度為O.01 10%的聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入含鈣化合物，配成濃度為O.01 3mol/L的含鈣化合物與聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液I ;B.在質量濃度為O.01 10%的聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入磷酸鹽或磷酸，配成濃度為O. 006 I. 8mol/L的磷酸鹽或磷酸與聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液II ；C.將步驟A和B所得混合溶液I和混合溶液II在攪拌速度為100 8000轉/分下以超聲處理進行混合，并用堿液控制pH值為10 12，形成納米羥基磷灰石溶膠III ；D.在步驟C所得溶膠中，用濃度為O.5 I. 5mol/L的鹽酸調節(jié)pH值至6 7，再按稀土離子(稀土離子+鈣離子)的摩爾比=0.5 10 100，滴加濃度為O. 005 O. lmol/L 的稀土鹽溶液；E.將步驟D所得溶液在20 200°C下，經常規(guī)陳化24 48小時，再用去離子水洗滌， 然后經離心處理，得到納米磷灰石溶膠；F.用質量濃度為2%的醋酸溶液加入生物高分子，配成生物高分子溶液；G.按納米磷灰石溶膠生物高分子溶液溶質的質量比為O.I O. 9 1，將生物高分子溶液與步驟E所得的納米磷灰石溶膠進行混合，得到納米磷灰石與生物高分子的混合液 IV ；H.將步驟G所得的混合液IV靜置去除氣泡，再注入模型，置于-5 -80°C下冷凍24 48小時，然后冷凍干燥24 48小時，即得到納米磷灰石/生物高分子支架；I.將納米磷灰石/生物高分子支架用堿液或者緩沖溶液浸泡3 4小時，然后再用去離子水浸泡3 5小時，每半小時換一次水；J.將步驟I所得納米磷灰石/生物高分子支架置于-5 _80°C下冷凍24 48小時， 再冷凍干燥24 48小時，即得到熒光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架。
2.根據(jù)權利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟A中聚乙烯吡咯烷酮的類型為 K15、K30、K60 或 K90。
3.根據(jù)權利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟A的含鈣化合物為硝酸鈣、 氯化鈣或氫氧化鈣。
4.根據(jù)權利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟B的磷酸鹽為磷酸氫二銨、 磷酸氫二鈉或磷酸氫二鉀。
5.根據(jù)權利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟C的堿液為氨水、氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液。
6.根據(jù)權利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟D的稀土鹽為硝酸銪、硝酸鋱、硝酸銩、硝酸釔或硝酸鏑。
7.根據(jù)權利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟E的常規(guī)陳化是將溶液自然陳化或者置于高壓釜陳化或蒸發(fā)回流裝置中陳化。
8.根據(jù)權利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟F的生物高分子為殼聚糖或膠原。
9.根據(jù)權利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟F配成的生物高分子溶液， 是殼聚糖溶液時質量濃度為I 4%，是膠原溶液時濃度為3 20mg/mL。
10.根據(jù)權利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟I的堿液是氨水、氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液；緩沖溶液是磷酸氫二鈉或碳酸氫鈉溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開一種熒光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架的制備方法，通過制備稀土離子摻雜的納米磷灰石溶膠、并進行后處理，然后制備納米磷灰石/生物高分子支架，最終得到熒光標記特性的納米磷灰石/生物高分子復合支架。該支架中的磷灰石顆粒在生物高分子基體中分散良好，且具有光學穩(wěn)定性和良好發(fā)光性能的光標記特性，解決了現(xiàn)有支架材料難以進行有效的體外和體內試驗的檢測、診斷等問題。本法工藝簡單，操作簡捷，易于推廣應用。
文檔編號A61L27/46GK102580158SQ20121005618
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月6日 優(yōu)先權日2012年3月6日
發(fā)明者余雪, 周大成, 宋志國, 尹兆益, 徐圓圓, 楊正文, 邱建備 申請人:昆明理工大學