專利名稱：黃芩提取物在制備抗食道癌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及黃芩提取物的用途，特別是黃芩提取物在制備抗食道癌藥物中的應用。
食道癌的放療不同于其它部位的腫瘤治療，由于腫瘤始終與食管于一體，在規(guī)劃靶區(qū)時，管腔和病變一起被劃入，如果和照射其它部位的腫瘤一樣，一次大劑量照射勢必會引起食管粘膜的損傷，甚至穿孔，有發(fā)現(xiàn)在肺部腫瘤的定向放射時，食管接受24-30Gy量，即可出現(xiàn)放射性損傷，后期表現(xiàn)食管局部性狹窄。又由于食道癌患者就癥時絕大多數(shù)已屬晚期，不僅局部病變已廣泛浸潤，而且已有亞臨床病灶的遠處播散或淋巴結轉移，尸檢發(fā)現(xiàn)，許多臨床認為局部早期的病例死亡時，已有半數(shù)以上伴遠處轉移，70％以上有廣泛的淋巴結受侵，真正能根治性切除的病例不足1/3，常規(guī)放療5年生存率僅為13％，局部復發(fā)也是食道癌手術和放療失敗的主要原因，占80％以上，由此可以看出，食道癌的治療僅靠手術和放療是遠遠不夠的。
由于在化療過程中，伴有極大的副反應及并發(fā)癥，即使通過放療結合化學治療，其5年生存率也僅13％左右。生存5年以上者，對于后期的生活質(zhì)量也大受影響，不能從根本上有效地來治療食道癌，更不能做到防患于未然。
中藥黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，又名黃文、無芩等。根據(jù)現(xiàn)有文獻的報道，黃芩的藥理功效味苦，性寒，功能泄實火，除濕熱，解毒，止血，安胎，對多種細菌均有抑制作用，對流感病毒，皮膚真菌也有抑制作用，并有除熱，解毒，鎮(zhèn)靜，降壓，利膽，利尿，解除平滑肌痙攣，抑制腸管蠕動等作用。黃芩的丙酮提取物還可望成為保存加工食品的天然抗氧化劑。黃芩的根、葉提取物有抗?jié)兓钚浴?br> 黃芩提取物中的黃芩素和黃芩甙，現(xiàn)有文獻報道其藥理作用為抗炎、抗變態(tài)反應作用；保肝利膽作用；降壓、利尿、鎮(zhèn)靜、解熱作用；醛糖還原酶抑制作用。臨床應用主要用于傳染性肝炎、急性膽道感染、鉛中毒、清熱解毒、胸悶嘔惡、肺熱咳嗽、胎動不安及瘡毒等。就黃芩甙，也有局限于針對乳腺癌細胞的體外研究報告。但這些研究都還處在非常前期，對于黃芩提取物的抗癌作用機理也不甚明了。
為了達到上述目的，本發(fā)明提供一種黃芩提取物在制備抗食道癌藥物中的應用，應用黃芩提取物所制備的藥物用于治療或預防食道癌。黃芩提取物特別指具有黃酮母體結構的提取物，可以是黃芩素，也可以是黃芩甙，還可以是兩者的混合物，混合物中兩者的配比可以是任意配比來進行混合。所述的黃芩提取物，可以是黃芩提取物制成的藥學上可接受的鹽，如用以下的酸馬來酸、富馬酸、琥珀酸、酒石酸、乙酸、鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸等類似酸加成鹽；需要時可加合適的溶劑，如水、甲醇、乙醇、乙醚、四氫呋喃等類似物。黃芩提取物及藥學上可接受的鹽可以口服、注射給藥，如粉劑、顆粒劑、片劑、小丸、膠囊、乳劑、糖漿劑、注射劑等。所述的制劑可用常規(guī)方法來制備。所述的具有黃酮母體結構的黃芩提取物，其黃酮母體結構如下圖所示 所述黃芩素，又叫黃芩甙元，黃酮類化合物，是黃芩的主要活性成分之一。分子量270.25，可由黃芩甙水解得到。
黃芩素的結構黃酮母體結構上4′，5，6，7四個氫基-H被羥基-OH取代。
黃芩甙的結構是黃酮母體結構上4′，5，6三個氫基-H被羥基-OH取代，7位的羥基-OH與葡萄糖醛酸縮合，即黃芩素-7-O-葡萄糖醛酸。
本發(fā)明所述的黃芩提取物在制備食道癌藥物中的應用，公開了黃芩提取物在制藥中的新用途。黃芩提取物，特別是黃芩素對食道癌細胞有明顯的抑殺作用。
細胞凋亡是普遍存在于細胞生物體內(nèi)的一種自發(fā)、主動的細胞死亡過程，是生物體維持細胞數(shù)量相對穩(wěn)定的固有機制，這一機制若有障礙或發(fā)生異常，就有可能引發(fā)腫瘤或其它病變，腫瘤是一種細胞凋亡過慢而增殖過多的疾病，如能抑制腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡，就能有效地控制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。另外，當腫瘤直徑在1-2平方毫米大小時，由于瘤體中心部缺氧，腫瘤細胞會產(chǎn)生血管生成因子，這樣，腫瘤可得到其自生生長所需的營養(yǎng)和氧氣，通過對該新血管增殖的抑制，有助于抑制腫瘤細胞的繼續(xù)生長，因此，抑制腫瘤細胞的生長，需要尋找能抑制腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡及其具有血管生成抑制活性的物質(zhì)。
而本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，黃芩提取物中黃芩素，其特殊的作用機制是，直接抑制食道癌細胞的分裂和增生，并具有強烈誘導癌細胞凋亡的作用，而對正常細胞生長周期和凋亡無明顯作用；另一主要作用是抑制食道癌內(nèi)部血管生成，特別是在缺氧環(huán)境下的的血管再生，從而有效地切斷腫瘤的血液供應使其變性壞死。特別是在離體細胞培養(yǎng)實驗中，表現(xiàn)為對食道癌細胞釋放血管生長因子的抑制及誘導血管內(nèi)皮細胞的凋亡。此外，在活體動物(裸鼠)實驗中，發(fā)現(xiàn)能夠顯著地抑殺移植腫瘤的生長，最高有效達95％，且無任何毒副作用。
本發(fā)明黃芩提取物在制藥中的應用發(fā)掘了黃芩提取物，特別是黃芩素和黃芩甙在食道癌治療和預防藥物的生產(chǎn)領域中的新用途。本發(fā)明的黃芩提取物，特別是黃芩素、黃芩甙制備的藥物毒性低，對人體無副作用。本發(fā)明的黃芩提取物、特別是黃芩素、黃芩甙原料來源廣泛，成本較低。本發(fā)明對于食道癌治療和預防這一難題的早日攻克具有深遠的現(xiàn)實意義。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，以下結合對比藥理實驗以及結果對本發(fā)明加以進一步的描述。實驗結果1如圖1所示，該圖片是黃芩提取物中的黃芩素(baicalein)誘導癌細胞核裂解，細胞凋亡始于細胞核的裂解。圖中顯示食道癌細胞經(jīng)黃芩素處理2天后出現(xiàn)明顯的細胞核裂解(右圖中箭頭所指)。黃芩素對正常細胞無此作用(左圖)。此實驗采用DAPI免疫染色法(特殊細胞核染色法)。Control是未經(jīng)處理的對照組細胞。實驗結果2如圖2所示，該照片是黃芩素誘導食道癌細胞的凋亡情況。該實驗采用特殊的免疫組化染色方法(tunel Stain)。此方法是目前世界范圍內(nèi)公認的最佳細胞凋亡鑒定手段，凋亡或正在凋亡的細胞經(jīng)染色后呈顯黃色或橘黃色，而正常細胞則呈顯紅色。照片顯示食道癌細胞經(jīng)黃芩素(baicalein)處理3天后誘導了這些細胞的凋亡，而經(jīng)同樣處理的正常細胞則不受影響。實驗結果3如圖3所示，該照片是黃芩素誘導血管內(nèi)皮細胞的凋亡情況。該實驗采用特殊的免疫組化染色方法(tunel stain).凋亡或正在凋亡的細胞經(jīng)染色后呈現(xiàn)黃色，而正常細胞則呈現(xiàn)紅色。圖片中顯示了兩種血管內(nèi)皮，即人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)和人動脈內(nèi)批皮細胞(HAEC)，經(jīng)黃芩素(baicalein)處理3天后誘導了這些細胞的凋亡，control為未經(jīng)處理的對照組細胞。實驗結果4如圖4所示，該表是黃芩素抑制食道癌細胞釋放血管生長因子的實驗狀況。
實驗方法1×105食道癌細胞被種植在直徑為15mm的培養(yǎng)盤上，培養(yǎng)液含有10％小牛血清。24小時待細胞貼壁后，將培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)液。換液后24小時開始加藥。經(jīng)不同時間處理后，將培養(yǎng)液收集起來，用ELISA測定培養(yǎng)液中血管生長因子的含量，所測得含量需經(jīng)實際細胞數(shù)校正。食道癌細胞經(jīng)黃芩素處理2天后，血管生長因子釋放明顯減少。在缺氧的環(huán)境中(1％O2)，黃芩素抑制作用尤其顯著。實驗結果5如圖5所示，該照片顯示黃芩素抑制裸鼠上移植食道癌內(nèi)的血管生成狀況。
實驗方法先將食道癌細胞株接種在裸鼠皮下。自第2周開始，黃芩素經(jīng)皮下給藥，每周3次。實驗持續(xù)至第12周，每周測量一次腫瘤的表面積。實驗結束后，將腫瘤自裸鼠上分離下來，經(jīng)化學固定和冰凍切片后，用八因子作抗體進行免疫組化染色。圖片中棕色片段即為腫瘤血管斷面。左圖樣本取自未用藥組，右圖樣本取自用藥組，用藥劑量1mg/kg體重，可見血管數(shù)量明顯減少。實驗結果6如圖6所示，該表是黃芩素(baicalein)抑制食道癌細胞的DNA分裂情況。圖中可見食道癌細胞經(jīng)黃芩素處理后，處于DNA合成期(S phase)的細胞數(shù)明顯減少，而合成前期(G0/G1)的細胞數(shù)則明顯增加。由于這些細胞在合成前期G0/G1積累，從而有效地抑制了該細胞的增生。實驗方法食道癌細胞經(jīng)黃芩素處理后，再經(jīng)熒光標記，最后用細胞周期分析法對處于各個不同分裂期內(nèi)的細胞數(shù)進行定量測定，對所測得的數(shù)值占總細胞數(shù)的比值進行比較而得到上圖表。實驗結果7如圖7所示，該圖表是黃芩素(baicalein)、黃芩甙(baicalin)和對照組用苡仁提取物(wogonin)抑殺食道癌細胞的療效比較。在離體性別培養(yǎng)實驗中，黃芩素、黃芩甙和苡仁提取物均有抑殺食道癌細胞的作用，但作用強度略有差異。相對強度黃芩素＞黃芩甙＞苡仁提取物。結果實驗8如圖8、圖9所示，圖表是黃芩素(baicalein)抑制了Cyclooxygenase(COX-2)的表達(圖8)和前列腺素的合成(圖9)。COX-2是一種催化前列腺素生成的酶，該酶以及它的產(chǎn)物前列腺素在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起了非常重要的作用。黃芩素主要作用機制之一是通過它的這些抑制作用而起到抑殺癌細胞的作用。實驗方法圖8采用West Blot Analysia法測定COX-2蛋白質(zhì)的表達水平，右邊數(shù)字指出COX-2蛋白質(zhì)的分子量。圖9采用ELISA法測定由食道癌細胞釋放至培養(yǎng)液中的前列腺素的含量，并用實際細胞數(shù)作校整后作統(tǒng)計學處理。實驗結果9如圖10所示，該表是黃芩素抑殺體外細胞培養(yǎng)實驗中食道癌細胞生長的劑量曲線。曲線1表示正常細胞，曲線2表示乳腺癌細胞，曲線3表示食道癌細胞。
實驗方法三種實驗細胞株均采用相同的培養(yǎng)條件。1×105細胞被種植在直徑為15mm的培養(yǎng)盤上，培養(yǎng)液含有10％小牛血清。24小時待細胞貼壁后，將培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)液以避免血清中存在的生長因子對細胞生長的影響。換液后24小時開始加藥。加藥5天后作細胞計數(shù)。計數(shù)前先用臺潘蘭將細胞染色以排除已死亡細胞對實驗結果的影響。曲線中每一點為3次實驗的平均值。
從曲線中可見，用藥濃度為0.1開始起效果(20％抑制)，濃度為0.5μg/ml時，食道癌細胞生長的抑制為50％。而當濃度達到10μg/ml時，抑制可達95％。黃芩素對正常細胞無明顯作用?？梢婞S芩素可以有效地抑殺體外培養(yǎng)的食道癌細胞的生長。實驗結果10如圖11、圖12所示，是黃芩素抑殺活體動物上移植食道癌的生長。實驗方法先將食道癌細胞株接種在裸鼠皮下，經(jīng)1-2周后腫瘤開始生長。黃芩素皮下注射自第二周開始，每周3次。實驗動物被隨機分成3個實驗劑量組合一個對照組，每組10個裸鼠。實驗持續(xù)至第12周，每周測量一次食道癌腫瘤的表面積。實驗結束后，將食道癌腫瘤自裸鼠上分離下來，并做保存處理以備用作藥理，免疫組化及生化檢查。圖11顯示黃芩素抑殺移植腫瘤的計量曲線。圖12顯示黃芩素對移植腫瘤有明顯抑殺效果。實驗結果11下述實驗是黃芩素(baicalein)和黃芩甙(baicalin)單獨用藥或混合用藥時對離體培養(yǎng)的食道癌細胞和乳腺癌細胞的作用比較。
實驗方法1×105食道癌細胞被種植在直徑為15mm的培養(yǎng)盤上，培養(yǎng)液含有10％小牛血清。待細胞貼壁后(約24小時)，將培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)液以避免血清中存在的生長因子對細胞生長的影響。換液后24小時開始加藥。加藥5天后作細胞計數(shù)。計數(shù)前先用臺潘蘭將細胞染色以排除已死亡細胞對實驗結果的影響。如圖13中每一點為三次實驗的平均值。實驗結果如圖13、圖14所示，單獨用藥時，黃芩素的作用強度高于黃芩甙。黃芩素和黃芩甙混合用藥時(1∶1)，其對食道癌細胞生長的抑制作用在小劑量時有輕度增加，但劑量增大后，其作用大于黃芩甙(單獨用藥)，但小于黃芩素(單獨用藥)。對照組增加了離體培養(yǎng)的食道癌細胞的生長，無任何抑制作用。如圖14顯示，黃芩素(baicalein)和黃芩甙(baicalin)及其混合用藥時對離體培養(yǎng)的食道癌細胞和乳腺癌細胞的作用。
上述實驗結果可以看出黃芩提取物用于制備抗食道癌藥物，可明顯抑制食道癌細胞的分裂，并具有強烈誘導癌細胞凋亡的作用，而對正常細胞生長周期和凋亡無明顯作用；并且還具抑制食道癌內(nèi)部血管生成，特別是在缺氧環(huán)境下的血管再生，從而有效地切斷腫瘤的血液供應使其變性壞死。特別是黃芩素用于制備治療或預防食道癌的藥物具有十分積極的現(xiàn)實意義。


圖1是黃芩素(baicalein)誘導食道癌細胞核裂解實驗照片；圖2是黃芩素誘導食道癌細胞的凋亡情況實驗照片；圖3是黃芩素誘導血管內(nèi)皮細胞的凋亡情況實驗照片；圖4是黃芩素抑制食道癌細胞釋放血管生長因子的實驗狀況照片；圖5是黃芩素抑制裸鼠上移植食道癌內(nèi)的血管生成狀況；圖6是黃芩素(baicalein)抑制食道癌細胞的DNA分裂情況；圖7是抑殺食道癌細胞的療效比較；圖8是黃芩素(baicalein)抑制了Cyclooxygenase(COX-2)的表達；圖9是黃芩素(baicalein)抑制了前列腺素的合成情況；圖10是黃芩素抑殺活體動物上移植食道癌的生長；圖11是黃芩素抑殺移植腫瘤的計量曲線；圖12是黃芩素對移植腫瘤的抑殺效果；圖13是黃芩素(baicalein)和黃芩甙(baicalin)單獨用藥或混合用藥時對離體培養(yǎng)的食道癌細胞的作用比較；圖14是黃芩提取物對食道癌細胞和乳房癌細胞作用比較。
加入乳糖66g，預膠化淀粉64g，微晶纖維素66g，硬脂酸鎂3g，按常規(guī)制片工藝制得片劑1000片，相當于每片含黃芩素100毫克，作為抗食道癌藥。
權利要求
1.黃芩提取物在制備抗食道癌藥物中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的黃芩提取物在制備抗食道癌藥物中的應用，其特征是所述的黃芩提取物具有黃酮類母體結構，所述母體結構如下所示
3.根據(jù)權利要求1所述的黃芩提取物在制備抗食道癌藥物中的應用，其特征是所述的黃芩提取物為黃芩素。
4.根據(jù)權利要求1所述的黃芩提取物在制備抗食道癌藥物中的應用，其特征是所述的黃芩提取物為黃芩甙。
5.根據(jù)權利要求1所述的黃芩提取物在制備抗食道癌藥物中的應用，其特征是所述的黃芩提取物為黃芩素以及黃芩甙的混合物。
6.根據(jù)權利要求1或2或3或4或5所述的黃芩提取物在制備抗食道癌藥物中的應用，其特征是所述的黃芩提取物是黃芩提取物制成的藥學上可接受的鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃芩提取物在制備抗食道癌藥物中的應用，黃芩提取物特別指具有黃酮母體結構的提取物，可以是黃芩素，也可以是黃芩甙，還可以是兩者的混合物及其黃芩提取物制成的藥學上可接受的鹽。利用黃芩提取物制備的抗食道癌藥，能直接抑制癌細胞的分裂，并具有強烈誘導癌細胞凋亡的作用，而對正常細胞生長周期和凋亡無明顯作用；并且它還具有抑制食道癌內(nèi)部血管生成，特別是在缺氧環(huán)境下的血管再生，從而有效地切斷食道癌的血液供應，使其變性壞死，顯著地抑殺移植食道癌的生長，且無任何毒副作用，它對治療或預防食道癌的藥物的制備具有十分積極的現(xiàn)實意義。
文檔編號A61K31/7048GK1442134SQ0310993
公開日2003年9月17日 申請日期2003年4月8日 優(yōu)先權日2003年4月8日
發(fā)明者劉新華, 潘福生, 胡祖耀 申請人:杭州華東醫(yī)藥集團生物工程研究所有限公司