rhEGF在制備預(yù)防、治療缺血性腦卒中的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了rhEGF的一種新的醫(yī)藥用途，具體而言，是將rhEGF用于制備預(yù)防治療缺血性腦卒中的藥物或保健品中的新用途。rhEGF藥物能保護(hù)和改善缺血性腦卒中，可以促進(jìn)神經(jīng)再生，對缺血性腦卒中大鼠有治療作用，為臨床上治療缺血性腦卒中提供了新的思路和方法。
【專利說明】rhEGF在制備預(yù)防、治療缺血性腦卒中的藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及rhEGF的新用途，尤其涉及rhEGF在制備預(yù)防、治療缺血性腦卒中的藥 物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 腦血管疾病是當(dāng)今世界嚴(yán)重危害人類生命健康的主要疾病之一，是我國的常見 病、多發(fā)病。腦卒中是多種腦血管疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)形式，是一組突然起病、以局灶性神經(jīng)功 能缺失為特征的腦血液循環(huán)障礙性疾病，其病因主要是各種因素引起腦內(nèi)動脈狹窄、閉塞 或破裂，從而導(dǎo)致急性腦血液循環(huán)障礙，臨床上表現(xiàn)為一過性或永久性神經(jīng)功能障礙的癥 狀和體征，具有極高的致殘率和較高的致死率，它不僅嚴(yán)重威脅病人的生命，影響其生活質(zhì) 量，還給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前腦血管疾病的致死率仍然很高，有大約75% 的卒中患者會留下神經(jīng)功能或認(rèn)知功能異常的后遺癥。在歐美國家，腦卒中是繼腫瘤、心 臟疾病之后的的第三大死亡原因，目前臨床除了早期溶栓措施，急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS)的臨床治療依然缺乏有效手段，而溶栓治療的時(shí)間窗極短且不能打 斷AIS所致的繼發(fā)性損害及其引起的惡性循環(huán)。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)動物制備中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷模 型的研究發(fā)現(xiàn)，由缺血誘導(dǎo)的一系列瀑布樣延遲性生化反應(yīng)是導(dǎo)致腦卒中組織損傷及長期 行為學(xué)障礙的關(guān)鍵原因，其病理機(jī)制包括興奮性毒性、離子失衡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和再 生障礙等，深入研究腦卒中神經(jīng)損傷及神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，開拓有效治療腦卒中的藥物已成為 不容忽視的社會性問題，故研發(fā)理想的缺血性腦卒中神經(jīng)保護(hù)劑和治療策略顯得十分緊迫 和必要。
[0003] 基因重組人表皮生長因子（recombinant human Epidermal Growth Factor, rhEGF)在醫(yī)學(xué)上有顯著的創(chuàng)傷修復(fù)、愈合傷口等功效。近年來發(fā)現(xiàn)，rhEGF在美容 產(chǎn)品領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景，具有促進(jìn)皮膚細(xì)胞更新、防止皮膚衰老等功能。本發(fā)明研 究發(fā)現(xiàn)，rhEGF對缺血性腦卒中大鼠有治療作用，從而為缺血性腦卒的治療提供了新思路， 其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供rhEGF的一種新的醫(yī)藥用途，具體而言，是將rhEGF用于制 備預(yù)防治療腦血管疾病的藥物或保健品中的新用途，更進(jìn)一步的，所述腦血管疾病為缺血 性腦卒中。
[0005] 本發(fā)明還提供rhEGF作為BDNF表達(dá)調(diào)節(jié)劑的用途，可使內(nèi)源性BDNF表達(dá)增加。
[0006] 本發(fā)明的目的還在用提供一種用于治療缺血性腦卒的藥物組合物，其中包括活性 成分rhEGF和藥學(xué)可接受載體。
[0007] 本發(fā)明的藥物組合物，其中，所述藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于：甘露醇、山 梨醇、山梨酸或鉀鹽、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨 酸、維生素 A、維生素 C、維生素 E、維生素 D、氮酮、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價(jià)堿金屬的碳 酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸 鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生 物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、丙二醇、乙醇、土溫60-80、司 班-80、蜂蠟、羊毛脂、液體石蠟、十六醇、沒食子酸酯類、瓊脂、三乙醇胺、堿性氨基酸、尿 素、尿囊素、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、磷脂類材料、高 嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂，植物油：大豆油、中鏈油、橄欖油、茶油、棕櫚油、當(dāng)歸 油、沙棘油、莪術(shù)油、川芎油、薏米仁油、紅花油、花椒油、大蒜油；磷脂：蛋黃卵磷脂、大豆磷 月旨、氫化蛋黃卵磷脂、氫化大豆磷脂、人工合成磷脂；聚乙二醇磷脂或其衍生物，選自：聚 乙二醇-腦磷脂或其衍生物、聚乙二醇-膽固醇或其衍生物、聚乙二醇-二-脂肪酸甘油 酯或其衍生物、聚乙二醇-脂肪酸酯或其衍生物、聚乙二醇-脂肪胺或其衍生物、聚乙二 醇-脂肪醇或其衍生物、以及含有脂溶性高分子片段的聚乙二醇磷脂衍生物；油酸或油酸 鹽，選自：油酸、油酸鉀鹽、油酸鈉鹽；抗氧化劑：維生素 E ;亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、維生素 C ;控制陽離子濃度的絡(luò)合劑，選自：EDTA或其它離子絡(luò)合劑。
[0008] 本發(fā)明所述的藥物組合物，可以以藥物制劑的形式存在，可以是任何一種可服用 的藥物制劑形式，如：片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊 齊U、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、溶液劑、注射劑、栓劑、 軟膏劑、硬膏劑、霜?jiǎng)?、噴霧劑、滴劑、滴丸或貼劑。
[0009] 本發(fā)明的藥物組合物在使用時(shí)根據(jù)病人的情況確定用法用量，如一日2-3次。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 實(shí)施例1 缺血性腦卒中動物模型 1實(shí)驗(yàn)材料與方法 1. 1實(shí)驗(yàn)材料 1. 1. 1動物與分組 SD大鼠140只，雌雄各半，體重220-300g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。適 應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為4組，即空白組（n=8)，假手術(shù)組（n=8)，安慰劑組（n=8)，rhEGF 藥物組（n=8)，安慰劑組和rhEGF藥物組又隨機(jī)分為5小組。
[0011] 1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 rhEGF藥物，由桂林華諾威基因藥業(yè)有限公司提供。
[0012] 1.2 方法 1. 2. 1造模 參照Zea-Longa線栓法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)制成MCAO模型。造模后大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能 缺損癥狀證明造模成功?？瞻捉M大鼠不做任何處理。
[0013] 1.2.2實(shí)驗(yàn)給藥 術(shù)后24h所有造模成功的大鼠麻醉清醒后即開始給藥，具體方法如下：空白組、假手術(shù) 組不做任何處理；安慰劑組給予生理鹽水，每只靜脈滴注lmL/kg，每日1次；rhEGF藥物，每 只100 μ g/kg靜脈滴注，每日1次。
[0014] L 2. 3神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損評定 采用Longa及Bederson的5分制法進(jìn)行評分。O分：提起鼠尾，可伸展雙上肢，無神經(jīng)功 能缺損；1分：不能完全伸展左側(cè)前爪，輕度神經(jīng)功能缺損；2分：提起鼠尾，左側(cè)前肢內(nèi)旋， 肩內(nèi)收，行走時(shí)，大鼠向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分：行走時(shí)，大鼠向左側(cè)傾倒，重度 神經(jīng)功能缺損；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。評分為0分和4分者剔除。
[0015] 1.3標(biāo)本采集與切片制備 大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg體重）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)板上：立即 打開胸腔，暴露心臟，將灌注穿刺針自心尖部穿入左心室至升主動脈根部，用止血鉗固定 心尖部穿刺針，并夾閉腹主動脈；剪開右心房放血，用生理鹽水250mL左右快速沖洗灌注， 使輸液器液管內(nèi)呈一條直線，待右心房流出的液體變得清亮?xí)r，再灌注預(yù)冷的4%多聚甲 醛（0. Olmmol/LPBS配制，pH7. 2-7. 4)約400mL，灌入速度先快后慢，直至頸部僵硬；迅速 取出大腦組織，置4°C 4%多聚甲醛固定液中后固定約6-8h，然后將組織塊依次放入20%、 30%的蔗糖溶液直至組織塊下沉，將下沉后的腦組織從蔗糖溶液取出后放_80°C冰箱備用； 從-80°C冰箱取出腦組織，將所切部位用OCT固定后在-20°C恒冷箱切片機(jī)中連續(xù)做冠狀切 片（片厚14um)隔三取一，將切下的腦組織貼于多聚賴氨酸處理過的載玻片上；然后入4°C 的丙酮固定IOmin，后依次入0· OlM PBS洗5minX 3次；室溫自然晾干后，存儲于-80°C冰箱 備用。
[0016] 1.4免疫熒光染色 切片從_80°C冰箱取出，室溫自然晾干；PBS液洗3次，每次2min ;切片微晾干后滴加5% 正常山羊血清封閉液和0. 3%TritonX-100破膜劑，室溫下Ih ;PBS液洗3次，每次2min ;滴加 一抗(一抗的比例為1 :1〇〇,用5%正常山羊血清稀釋)，置4°C冰箱內(nèi)13h ;切片從冰箱取出 后PBS液洗3次，每次2min ;滴加熒光素標(biāo)記的羊抗兔IgG (二抗的比例為1 :50,用5%正 常山羊血清稀釋)，室溫下Ih ;PBS液洗3次，每次2min ;用濾紙將切片上的殘液吸凈，緩沖 甘油（甘油9份，0. OlMPBS液1份）封片。熒光鏡下觀察拍照。陰性對照試驗(yàn)：用0. OlMPBS 液代替一抗，以排除二抗的非特異性染色，與實(shí)驗(yàn)片同步進(jìn)行染色。從滴加二抗開始以后操 作均應(yīng)避光進(jìn)行。2結(jié)果判斷與數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用JD-801形態(tài)學(xué)圖像處理和分析軟件對免疫組織化學(xué)反應(yīng)的強(qiáng)度進(jìn)行灰度測量， 進(jìn)行半定量分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組間進(jìn)行方差分析，兩組比 較用t檢驗(yàn)，采用SPSS17. 0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析，以P〈0. 05判斷差異顯著性。
[0017] 3試驗(yàn)結(jié)果 BDNF免疫熒光染色灰度值測定結(jié)果)

【權(quán)利要求】
1. rhEGF用于制備預(yù)防、治療缺血性腦卒中的藥物或保健品中的應(yīng)用。 2. rhEGF作為BDNF表達(dá)調(diào)節(jié)劑的用途，可使內(nèi)源性BDNF表達(dá)增加。 3. rhEGF在制備BDNF調(diào)節(jié)劑中的用途。
4. 一種用于治療缺血性腦卒的藥物組合物，其中包括活性成分rhEGF和藥學(xué)可接受載 體。
【文檔編號】A61P9/10GK104491841SQ201510023294
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月19日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月19日
【發(fā)明者】梁青, 梁蘭, 鄒慶薇, 郝瑞雪, 聞家興, 王菁, 于琪, 顧久瑩, 田雪, 李姣, 劉建強(qiáng) 申請人:天津冠勤生物科技有限公司