專利名稱：促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于哺乳動物免疫去勢的去勢疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及促性腺激素釋放激 素脂質(zhì)體的制備方法。
背景技術(shù)：
促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasinghormone，GnRH)，又稱促黃體 素釋放激素(Luteinizing hormone releasing hormone, LHRH)、促性腺激素釋放因子 (Gonadotropin-releasing factor, GnRF)，是由動物下丘腦分泌的一種十肽激素，其主要 生物學(xué)功能是控制腦下垂體前葉細(xì)胞合成和分泌促黃體激素(Luteinizing hormone, LH) 及促卵泡激素(follicle-stimulating hormone, FSH)。促性腺激素釋放激素(GnRH)不但通過影響垂體促黃體激素(LH)和促卵泡激素 (FSH)的分泌，調(diào)節(jié)性腺功能，而且還直接作用于性腺。但促性腺激素釋放激素(GnRH)對 性腺的直接作用是抑制性的。在鼠等動物發(fā)現(xiàn)，在卵巢和睪丸上均存在促性腺激素釋放激 素(GnRH)受體，促性腺激素釋放激素(GnRH)可直接與這些受體結(jié)合，對生殖功能有抑制 作用，所以通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄕ{(diào)控促性腺激素釋放激素(GnRH)的分泌或干擾其功能，就能夠 達(dá)到控制動物生殖器官發(fā)育和生殖功能的目的。促性腺激素釋放激素(GnRH)免疫雄性動 物可以使幼齡雄性動物睪丸停止發(fā)育和成年雄性動物睪丸退化。用促性腺激素釋放激素 (GnRH)免疫動物后，機體產(chǎn)生大量的抗促性腺激素釋放激素(GnRH)的特異性抗體，與內(nèi)源 性的促性腺激素釋放激素(GnRH)結(jié)合使其失去生物活性，從而導(dǎo)致下丘腦-垂體-睪丸 軸功能的破壞，抑制促黃體激素(LH)和促卵泡激素(FSH)的釋放，使被免疫的動物表現(xiàn)睪 丸萎縮和重量減輕、血清睪酮水平下降。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在多種動物上用促性腺激素 釋放激素(GnRH)主動免疫的方法使動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體以中和內(nèi)源的促性腺激素釋放激素 (GnRH)，取得了一定的效果。這種免疫去勢方法簡便，安全性高，可替代傳統(tǒng)手術(shù)去勢，控制 動物性行為和繁殖能力，達(dá)到改善動物肉質(zhì)，促進(jìn)動物生長，提高飼料利用率。目前，國內(nèi)外在促性腺激素釋放激素(GnRH)免疫去勢制劑的研究方面也進(jìn)行了 不少工作，一般是將促性腺激素釋放激素(GnRH)與載體蛋白結(jié)合或者是重組促性腺激素 釋放激素(GnRH)融合蛋白直接注射，其缺點是需要多次注射方可抑制動物的生殖功能，否 則很難得到較好的效果，不得不增加使用劑量或使用頻率，給其使用帶來不便，不易在生 產(chǎn)實際中應(yīng)用。由此可見，延長促性腺激素釋放激素(GnRH)制劑在動物機體內(nèi)的作用時 間，減少免疫次數(shù)顯得尤為重要。因此，其“瓶頸”問題在于如何加強促性腺激素釋放激素 (GnRH)制劑給藥技術(shù)的研究。脂質(zhì)體作為藥物載體具有長效作用。實驗證明，脂質(zhì)體及包 封的藥物以緩釋方式釋放，在血循環(huán)中保留的時間，要比游離藥物長得多。而國內(nèi)外在促性 腺激素釋放激素脂質(zhì)體方面的研究技術(shù)還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種免疫去勢的促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體制劑的制備方法，促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體可作為哺乳動物免疫去勢的藥物制劑，用于各種哺乳動 物的免疫去勢。本發(fā)明具體制備方法包括以下操作步驟(1)將質(zhì)量比為3 1的磷脂酰膽堿75mg、膽固醇25mg放入無菌旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中， 加入6ml混合有機溶劑溶解或6ml無水乙醇溶解，形成磷脂酰膽堿、膽固醇有機溶液；(2)將盛有磷脂酰膽堿、膽固醇有機溶液的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶置于60°C水浴中，在旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)器上旋轉(zhuǎn)預(yù)熱20分鐘后；啟動旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，80°C，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時間為2小時，除去有機溶 劑，直至脂質(zhì)膜均勻的沉積在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶壁上；繼續(xù)負(fù)壓抽吸20分鐘后關(guān)閉旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器， 得磷脂酰膽堿、膽固醇脂質(zhì)膜；(3)將氮氣通入含干燥的磷脂酰膽堿、膽固醇脂質(zhì)膜的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，并將其放入 真空干燥器，室溫真空30分鐘，得干燥的磷脂酰膽堿、膽固醇脂質(zhì)膜；(4)取IOmg促性腺激素釋放激素溶于IOml濃度為0. 01mol/l的磷酸鹽緩沖液中， 得促性腺激素釋放激素溶液；(5)將含有干燥的磷脂酰膽堿、膽固醇脂質(zhì)膜的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶在氮氣流下加入促性 腺激素釋放激素溶液，將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶置于60°C水浴中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上旋轉(zhuǎn)30分鐘，水化 脂質(zhì)膜；振搖容器，使貼壁的所有脂質(zhì)從容器壁上脫落，形成均勻乳白的、無可見顆粒的促 性腺激素釋放激素脂質(zhì)體懸液。(6)將促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體懸液轉(zhuǎn)入IOml試管中，用細(xì)胞破碎儀探頭低溫 超聲分散，超聲時間3秒，間隔3秒，強度100瓦，共進(jìn)行5分鐘，即得白色帶乳光膠體溶液； 或以水浴式超聲儀進(jìn)行低溫超聲分散，溫度20°C以下，超聲效率60%，超聲時間5分鐘，即 得白色帶乳光膠體溶液；(7)將得到的白色帶乳光膠體溶液反復(fù)擠壓通過0. 45 μ m微孔濾膜，反復(fù)擠壓4_5 次，即可制得粒徑小于0. 45 μ m的均勻的促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體，將其充氮密封后放
置于室溫保存。所述混合有機溶劑為氯仿和甲醇的混合物，按體積比氯仿甲醇為1 1。所述步驟(6)中的低溫為0°C _20°C。所述步驟(4)中的濃度0. Olmol/1的磷酸鹽緩沖液的pH值為7. 2-7. 4。量取一定體積的促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體，用等體積的氫氧化鋁佐劑充分乳 化，混勻即得促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體的乳狀液。本發(fā)明的有益技術(shù)效果體現(xiàn)在以下方面1、本發(fā)明制備方法所需儀器少，主要儀器包括旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，真空干燥器和細(xì)胞破 碎儀；2、本發(fā)明制備的促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體包封效果好，包封后形態(tài)均勻，粒 徑均在IOOnm左右，均勻的分布于脂質(zhì)體制劑中，無粘連、聚沉現(xiàn)象，且包封率高，可達(dá)到 63. 5%。3、本發(fā)明的制備方法簡單，對操作環(huán)境沒有特殊要求，在一般的室溫狀態(tài)下即可 操作。4、本發(fā)明制備的促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體免疫去勢動物，注射次數(shù)少，只需注
射一次。


圖1為本發(fā)明促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體的粒徑、分布及形態(tài)照片，圖2為促性腺激素釋放激素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，圖3為促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體免疫后的公豬與對照組公豬的睪丸照片，圖4為促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體免疫后的公豬與對照組公豬的睪丸組織學(xué)圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖，通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地描述。以下實施例所用原料為市場采購產(chǎn)品磷脂酰膽堿和促性腺激素釋放激素 (GnRH)購自美國西格瑪(Sigma)公司；膽固醇購自上海源聚生物科技有限公司；甲醇、氯 仿、無水乙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實施例1 促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體的制備方法包括以下操作步驟(1)將質(zhì)量比為3 1的磷脂酰膽堿75mg、膽固醇25mg放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，加入 6ml混合有機溶劑溶解，形成磷脂酰膽堿、膽固醇有機溶液；混合有機溶劑為氯仿和甲醇的混合物，按體積比氯仿甲醇為1 1。(2)將盛有磷脂酰膽堿、膽固醇有機溶液的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶置于60°C水浴中，在旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)器上旋轉(zhuǎn)預(yù)熱20分鐘后；啟動旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，80°C，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時間為2h，除去有機溶劑， 直至脂質(zhì)膜均勻的沉積在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶壁上；繼續(xù)負(fù)壓抽吸20分鐘后關(guān)閉旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，得磷 脂酰膽堿、膽固醇脂質(zhì)膜；(3)將氮氣通入含干燥的磷脂酰膽堿、膽固醇脂質(zhì)膜的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，并將其放入 真空干燥器，室溫真空30分鐘，得干燥的磷脂酰膽堿、膽固醇脂質(zhì)膜；(4)取IOmg促性腺激素釋放激素(GnRH)溶于IOml濃度0. 01mol/l的磷酸鹽緩沖 液(Phosphate Buffered Saline, PBS) (pH7. 2-7. 4)中，得促性腺激素釋放激素(GnRH)溶 液；(5)將含有干燥的磷脂酰膽堿、膽固醇脂質(zhì)膜的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶在氮氣流下加入促性 腺激素釋放激素(GnRH)溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶置于60°C水浴中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上旋轉(zhuǎn)30min， 水化脂質(zhì)膜；振搖旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，使貼壁的幾乎所有脂質(zhì)從圓底燒瓶壁上脫落，形成均勻乳白 的、無可見顆粒的促性腺激素釋放激素(GnRH)脂質(zhì)體懸液。(6)將促性腺激素釋放激素(GnRH)脂質(zhì)體懸液轉(zhuǎn)入IOml試管中，以細(xì)胞破碎儀探 頭低溫(20°C以下)超聲分散，超聲時間3s，間隔3s，強度100w，共進(jìn)行5min，即得白色帶乳 光膠體溶液；或以水浴式超聲儀進(jìn)行低溫超聲分散，溫度20°C以下，超聲效率60%，超聲時 間5min，即得白色帶乳光膠體溶液；(7)將得到的白色帶乳光膠體溶液反復(fù)擠壓通過0. 45 μ m微孔濾膜，反復(fù)擠壓4_5 次，即可制得粒徑小于0.45 μ m的均勻的促性腺激素釋放激素(GnRH)脂質(zhì)體，將其充氮密
封后放置于室溫保存。最后，將制得促性腺激素釋放激素(GnRH)脂質(zhì)體與等體積的氫氧化鋁(Al (OH) 3) 佐劑充分乳化、混勻，即得促性腺激素釋放激素(GnRH)脂質(zhì)體乳狀液。
實施例2 促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體的制備方法包括以下操作步驟(1)將質(zhì)量比為3 1的磷脂酰膽堿75mg、膽固醇25mg放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，加入 6ml無水乙醇溶解，形成磷脂酰膽堿、膽固醇有機溶液；其它步驟同實施例1。實施例3 促性腺激素釋放激素(GnRH)脂質(zhì)體的質(zhì)量檢查1、脂質(zhì)體的粒徑、分布及形態(tài)觀察將制備的脂質(zhì)體用負(fù)染法染色，透射電鏡觀察，拍照，見圖1，白色圓點為脂質(zhì)體， 其形態(tài)相對均勻，粒徑在IOOnm左右，均勻的分布于脂質(zhì)體制劑中，無粘連、聚沉現(xiàn)象。2、包封率的測定準(zhǔn)確稱量促性腺激素釋放激素(GnRH)標(biāo)準(zhǔn)品lmg，以雙蒸水稀釋，分別配置成 0. 02mg/ml、0. 04mg/ml,0. 06mg/ml,0. 08mg/ml,0. lmg/ml 的促性腺激素釋放激素(GnRH)標(biāo) 準(zhǔn)品溶液，應(yīng)用分光光度儀在280nm波長下測定各濃度的OD值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2，此 標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0. 9994，說明促性腺激素釋放激素標(biāo)準(zhǔn)品與其濃度呈良好的線性 關(guān)系，其線性關(guān)系的方程為y = 0. 6x-0. 0068。將IOmg促性腺激素釋放激素(GnRH)溶于 IOml雙蒸水中，配成lmg/ml的促性腺激素釋放激素(GnRH)溶液，以促性腺激素釋放激素 (GnRH)脂質(zhì)體制備工藝流程制備促性腺激素釋放激素(GnRH)脂質(zhì)體。將促性腺激素釋放 激素(GnRH)脂質(zhì)體以4°C，12000r/min離心60min，取上清液，上清液經(jīng)0. 22 μ m濾膜濾過 后，取Iml加入雙蒸水4ml，混勻后得促性腺激素釋放激素(GnRH)脂質(zhì)體上清液稀釋液，測 得該稀釋液的OD值為0. 037。代入線性關(guān)系的方程計算得濃度C = O. 073mg/ml，乘以稀釋 度得上清液濃度為0. 365mg/ml。因脂質(zhì)體制劑中藥液濃度為lmg/ml，故，包封率(％ )=藥液濃度-上清液濃度= (1-0. 365)/1Χ100%= 63. 5%03、促性腺激素釋放激素(GnRH)脂質(zhì)體免疫去勢效果監(jiān)測18頭初生公豬隨機分為對照組和脂質(zhì)體組。脂質(zhì)體組12周齡免疫，頸部肌肉注射 2ml促性腺激素釋放激素(GnRH)脂質(zhì)體乳狀液；對照組不做任何處理。所有公豬相同飼養(yǎng) 管理，24周齡屠宰。結(jié)果表明，脂質(zhì)體免疫的公豬在20周齡和24周齡時，血清睪酮水平則分別顯著(P <0. 05，0. 82 士0. 33ng/ml vs. 1. 35 士0. 37ng/ml)低于和極顯著(P < 0. 01，0. 55 士0. 36ng/ ml vs. 1.69士0.48ng/ml)低于對照組。在24周齡時，脂質(zhì)體組公豬睪丸小，見圖3，睪 丸重量(61. 5士 12. Ig vs. 179. 7士47. 3g)、直徑(6. 85士.04cm vs. 9. 78士0. 82cm)、橫徑 (4. 29士0. 35cm vs. 6. 45士0. 49cm)均顯著(P < 0. 05)低于對照組。睪丸組織學(xué)的結(jié)果見 圖4，圖4中A、C、E為對照組公豬睪丸切片，其生精小管內(nèi)的精原細(xì)胞逐漸向管腔方向發(fā)育， 明顯分化成精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子，并且細(xì)胞排列緊密；圖4中B、D、F為脂質(zhì)體組公豬 睪丸切片，生精小管空腔化嚴(yán)重，除個別生精小管內(nèi)零星分布有幾個初級精母細(xì)胞外，極少 出現(xiàn)支持細(xì)胞、精原細(xì)胞、精子細(xì)胞，沒有精子，圖4中a為間質(zhì)細(xì)胞，b為支持細(xì)胞，c為精 原細(xì)胞，d為初級精母細(xì)胞，e為精子細(xì)胞，f為精子。這些結(jié)果表明脂質(zhì)體免疫公豬抑制公 豬睪丸的生長發(fā)育，降低睪酮的合成與分泌，以及抑制精子的發(fā)生，使睪丸萎縮，具有明顯的去勢效果。
權(quán)利要求
促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于包括以下操作步驟(1)將質(zhì)量比為3∶1的磷脂酰膽堿75mg、膽固醇25mg放入無菌旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，加入6ml混合有機溶劑溶解或6ml無水乙醇溶解，形成磷脂酰膽堿、膽固醇有機溶液；(2)將盛有磷脂酰膽堿、膽固醇有機溶液的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶置于60℃水浴中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上旋轉(zhuǎn)預(yù)熱20分鐘后；啟動旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，80℃，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時間為2小時，除去有機溶劑，直至脂質(zhì)膜均勻的沉積在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶壁上；繼續(xù)負(fù)壓抽吸20分鐘后關(guān)閉旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，得磷脂酰膽堿、膽固醇脂質(zhì)膜；(3)將氮氣通入含干燥的磷脂酰膽堿、膽固醇脂質(zhì)膜的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，并將其放入真空干燥器，室溫真空30分鐘，得干燥的磷脂酰膽堿、膽固醇脂質(zhì)膜；(4)取10mg促性腺激素釋放激素溶于10ml濃度為0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，得促性腺激素釋放激素溶液；(5)將含有干燥的磷脂酰膽堿、膽固醇脂質(zhì)膜的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶在氮氣流下加入促性腺激素釋放激素溶液，將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶置于60℃水浴中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上旋轉(zhuǎn)30分鐘，水化脂質(zhì)膜；振搖容器，使貼壁的所有脂質(zhì)從容器壁上脫落，形成均勻乳白的、無可見顆粒的促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體懸液；(6)將促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體懸液轉(zhuǎn)入10ml試管中，用細(xì)胞破碎儀探頭低溫超聲分散，超聲時間3秒，間隔3秒，強度100瓦，共進(jìn)行5分鐘，即得白色帶乳光膠體溶液；或以水浴式超聲儀進(jìn)行低溫超聲分散，溫度20℃以下，超聲效率60％，超聲時間5分鐘，即得白色帶乳光膠體溶液；(7)將得到的白色帶乳光膠體溶液反復(fù)擠壓通過0.45μm微孔濾膜，反復(fù)擠壓4 5次，即可制得粒徑小于0.45μm的均勻的促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體，將其充氮密封后放置于室溫保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于所述 混合有機溶劑為氯仿和甲醇的混合物，按體積比氯仿甲醇為1 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于所述 步驟(6)中的低溫為0°C -20°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于所述 步驟(4)中的濃度0. Olmol/1的磷酸鹽緩沖液的pH值為7. 2-7. 4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于量取 一定體積的促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體，用等體積的氫氧化鋁佐劑充分乳化，混勻即得促 性腺激素釋放激素脂質(zhì)體的乳狀液。
全文摘要
本發(fā)明涉及促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體的制備方法。該方法的具體操作步驟是將磷脂酰膽堿和膽固醇按照3∶1(w/w)，加入6ml混合有機溶劑(氯仿∶甲醇1∶1，V/V)溶解或6ml無水乙醇溶解，在氮氣流下加入促性腺激素釋放激素(GnRH)溶液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)預(yù)熱30min，然后在水浴式超聲儀中進(jìn)行低溫超聲分散后，將得到的脂質(zhì)體懸液進(jìn)行濾菌處理，即可制得促性腺激素釋放激素(GnRH)脂質(zhì)體。本發(fā)明制得的促性腺激素釋放激素脂質(zhì)體可作為哺乳動物免疫去勢的藥物制劑，用于各種哺乳動物的免疫去勢。本發(fā)明制劑使用方便，效果顯著，安全可靠，穩(wěn)定性好，易于保存。
文檔編號A61K9/127GK101940550SQ201010273948
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月2日
發(fā)明者孫志輝, 張運海, 方富貴, 李運生, 王琳, 章孝榮, 蒲勇 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);合肥博大牧業(yè)科技開發(fā)有限責(zé)任公司