專(zhuān)利名稱(chēng)：長(zhǎng)效生長(zhǎng)激素及藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物制劑技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及長(zhǎng)效生長(zhǎng)激素，其制備方法，功能和用途。
背景技術(shù)：
人生長(zhǎng)激素是人腦垂體分泌的蛋白質(zhì)激素，是人體正常生長(zhǎng)發(fā)育所不可缺少的調(diào)節(jié)激素。生長(zhǎng)激素最早的來(lái)源是從人腦垂體提取，但由于來(lái)源有限，且質(zhì)量保證困難，此產(chǎn)品難以廣泛使用。基因工程技術(shù)的出現(xiàn)，使得人生長(zhǎng)激素的大規(guī)模生產(chǎn)成為可能，而重組人生長(zhǎng)激素成為生物工程制藥行業(yè)的第二項(xiàng)產(chǎn)品而得到廣泛應(yīng)用，目前主要用于侏儒癥、大面積創(chuàng)傷恢復(fù)、成人生長(zhǎng)激素缺乏癥、艾滋病人瘦弱恢復(fù)等。
由于人生長(zhǎng)激素是蛋白質(zhì)，其體內(nèi)半衰期低于2小時(shí)，因此用藥手段主要局限于頻繁的注射方法，常規(guī)方法為每天注射，用藥周期在六個(gè)月到一年，這種頻繁的注射，給病人帶來(lái)嚴(yán)重的不便，并且提高了用藥成本。因此，改善生長(zhǎng)激素的用藥方法，減少用藥頻率，降低用藥成本，提高病人醫(yī)從性，增加療效的重要課題。
美國(guó)Genentech公司與Alkermers公司合作開(kāi)發(fā)了用PLGA包埋技術(shù)形成的釋放微粒，可以將用藥頻率由每天注射降低一次到每個(gè)月注射一次，并得到FDA批準(zhǔn)上市。但此產(chǎn)品生產(chǎn)工藝復(fù)雜，療效比原產(chǎn)品稍差。
利用聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)，可以延長(zhǎng)其半衰期，減少免疫原性，增加穩(wěn)定性，是一項(xiàng)已成功得到應(yīng)用的技術(shù)。目前利用此技術(shù)開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品，已經(jīng)上市的包括PEG-門(mén)冬酰胺酶，PEG-ADA(腺苷脫氨酶)，PEG-干擾素和PEG-GCSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)。其中PEG-干擾素由原來(lái)的每2天或每天注射一次降低到每周注射一次，而且療效顯著改善。PEG-GCSF也由每天注射一次改善為每個(gè)化療療程注射一次。
Clark等(J.Biol.Chem.，27121969-21977，1996)對(duì)聚乙二醇修飾生長(zhǎng)激素進(jìn)行了研究，并得到了能夠?qū)⑸L(zhǎng)激素半衰期延長(zhǎng)到超過(guò)15小時(shí)以上的產(chǎn)品，在去除腦垂體的大鼠模型中，注射頻率可以降低到每5天注射一次。此研究采用分子量為5000的聚乙二醇，因此需要多個(gè)聚乙二醇分子修飾才能達(dá)到理想的半衰期延長(zhǎng)效果，但過(guò)度修飾對(duì)生長(zhǎng)激素的活性影響較大，此研究表明，5個(gè)聚乙二醇分子修飾的效果最理想。盡管這種方法證明了用聚乙二醇修飾生長(zhǎng)激素的可行性，但是由于活性的降低，可能需要增加劑量來(lái)補(bǔ)償，而產(chǎn)品的不均一性使得大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)工藝和質(zhì)量控制難以保證，因此，此項(xiàng)研究的實(shí)用性不強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種采用大分子量聚乙二醇修飾生長(zhǎng)激素的方法，從而得到能夠延長(zhǎng)生長(zhǎng)激素半衰期的修飾產(chǎn)物。
本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題的方案是1、聚乙二醇和人生長(zhǎng)激素的偶聯(lián)物及生產(chǎn)方法生長(zhǎng)激素在體內(nèi)的半衰期取決于多方面的因素，如蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、結(jié)合蛋白的結(jié)合和分離、非特異性吸附和降解、抗體的形成、腎臟排除、與受體結(jié)合并內(nèi)吞等等，這些因素決定了生長(zhǎng)激素在體內(nèi)的分布、停留時(shí)間和代謝，同時(shí)也決定了外源性生長(zhǎng)激素的藥物動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。將蛋白質(zhì)與親水性的高分子如聚乙二醇偶聯(lián)，可增加蛋白穩(wěn)定性、減少非特異性吸附和抗原性，達(dá)到一定分子量時(shí)，可大大降低腎臟的排除效率，是延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物體內(nèi)半衰期的有效方法。
人生長(zhǎng)激素的分子量為20kDa，含有10個(gè)一級(jí)氨功能團(tuán)，其中1個(gè)阿拉法氨基，9個(gè)為賴(lài)氨酸側(cè)鏈氨基。阿拉法氨基和140位的賴(lài)氨酸側(cè)鏈均非常活躍，可以與活化的羧基反應(yīng)形成肽鍵。N-羥基琥珀酰胺(NHS)活化聚乙二醇分子是目前大分子偶聯(lián)常用的方法。
Clark等人(J.Biol.Chem.，27121969-77，1996)采用了分子量為5000的聚乙二醇與人生長(zhǎng)激素偶聯(lián)，結(jié)果表明多個(gè)聚乙二醇分子可以聯(lián)接到人生長(zhǎng)激素分子上，隨著聯(lián)接聚乙二醇分子數(shù)目增大，分子量增大，偶聯(lián)物半衰期也延長(zhǎng)，但同時(shí)多個(gè)聚乙二醇分子聯(lián)接后對(duì)生長(zhǎng)激素活性造成嚴(yán)重負(fù)面影響，聚乙二醇分子聯(lián)接越多，活性損失就越大。這種半衰期延長(zhǎng)或活性損失的中和結(jié)果使作者得出結(jié)論為每個(gè)生長(zhǎng)激素分子聯(lián)接五個(gè)聚乙二醇分子得到最理想的長(zhǎng)效結(jié)果。
人生長(zhǎng)激素的半衰期取決于多項(xiàng)因素，其中腎臟排除是重要的一項(xiàng)，為了減少腎臟排除，分子量要超過(guò)一定的臨界值(大約70kDa)，因此要偶聯(lián)大分子聚乙二醇。而為了減少活性損失，最好只偶聯(lián)一個(gè)聚乙二醇分子。這種方法在長(zhǎng)效干擾素中已得到成功應(yīng)用(Bailon etal.，Bioconjugate Chem.，12195-202，2001)。要做到只在生長(zhǎng)激素分子偶聯(lián)一個(gè)聚乙二醇分子，較可能的位點(diǎn)是阿拉法氨基，其pKa在7.6-8.0(比賴(lài)氨酸側(cè)鏈氨基的pKa(10.0-10.2)要低)。采用醛基與阿拉法氨基在低pH偶聯(lián)的方法可以特異地將聚乙二醇偶聯(lián)在G-CSF蛋白的N端(Kinstler et al.，US Patent 5985265，1999；Kinstler et al.，Pharm.Res.，13996-1002，1995)。但在同樣條件下，生長(zhǎng)激素的偶聯(lián)效率很低。
本發(fā)明一方面是提供一種生長(zhǎng)激素與高分子聚乙二醇的偶聯(lián)物，二者的摩爾比為1∶1，另一方面是提供其相應(yīng)的偶聯(lián)方法，這種方法是將生長(zhǎng)激素與NHS活化后的聚乙二醇在緩沖液中混合反應(yīng)并形成偶聯(lián)物。
用NHS活化的聚乙二醇分子量可以是20,000到120,000，更理想的是40,000到80,000之間。所有聚乙二醇可以是線(xiàn)性的，也可以是分叉的?；罨?0kDa分叉型聚乙二醇(mPEG2-NHS)購(gòu)自美國(guó)Shearwater公司，80kDa分叉型聚乙二醇(mPEG4-NHS)及活化方法在本發(fā)明中公布。緩沖體系、pH、摩爾比例、反應(yīng)溫度和時(shí)間等是反應(yīng)過(guò)程重要的控制條件。磷酸緩沖液為本發(fā)明首選緩沖體系，其它緩沖液，如碳酸、檸檬酸、琥鉑酸等、只要滿(mǎn)足pH在6至7.5之間有足夠的緩沖能力，并對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)沒(méi)有干擾也可以使用。緩沖液濃度在50-200mM之間。
傳統(tǒng)的NHS偶聯(lián)方法為了增加偶聯(lián)效率，一般選擇偶聯(lián)緩沖液的pH控制在7.5到9.0之間。為了增強(qiáng)選擇性，我們?cè)谂悸?lián)生長(zhǎng)激素時(shí)將pH降低到6.0到7.5之間，更理想的是6.5到7.0之間。在這種條件下，一般認(rèn)為NHS偶聯(lián)方法效率很低。聚乙二醇與生長(zhǎng)激素的摩爾比可以在1∶1到10∶1的范圍內(nèi)，更為適用的范圍是3∶1到7∶1。反應(yīng)pH對(duì)摩爾比有一定影響，pH越高，則需要的聚乙二醇與生長(zhǎng)激素的摩爾比可以降低。反應(yīng)的溫度和時(shí)間有一定關(guān)系，一般在室溫條件下一個(gè)小時(shí)反應(yīng)可以完成，而在4℃下，一般采用過(guò)夜反應(yīng)。在本發(fā)明所采用的低pH條件下，NHS活性基團(tuán)的水溶液穩(wěn)定性大大增加，因此時(shí)間延長(zhǎng)有助于反應(yīng)完全。此外，蛋白質(zhì)在低溫下一般具有更好的穩(wěn)定性。因此，首選的條件是2-8℃過(guò)夜反應(yīng)。滿(mǎn)足上述條件后，聚乙二醇與生長(zhǎng)激素偶聯(lián)反應(yīng)的主要產(chǎn)物是一個(gè)聚乙二醇與一個(gè)生長(zhǎng)激素分子偶聯(lián)。盡管確切的偶聯(lián)位點(diǎn)并沒(méi)有通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)，在這些條件下，最可能的偶聯(lián)位點(diǎn)是N-端的阿拉法氨基。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面是提供了純化聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物的方法。在本發(fā)明條件下需要與偶聯(lián)物分離的主要組份是未偶聯(lián)的生長(zhǎng)激素，兩者之間的差別為一個(gè)聚乙二醇分子，由于聚乙二醇的分子量在20,000以上，采用Superdex 75(Pharmacia Biotech)的分子篩柱將偶聯(lián)物與未偶聯(lián)生長(zhǎng)激素分離，偶聯(lián)物在排空體積出現(xiàn)，而未偶聯(lián)生長(zhǎng)激素具有更長(zhǎng)的滯留時(shí)間。進(jìn)行層析時(shí)對(duì)緩沖液和pH限制不多，可根據(jù)下一步工藝需要進(jìn)行調(diào)整。
本方法可以有效地將偶聯(lián)物與未偶聯(lián)生長(zhǎng)激素分離，但不能將游離的聚乙二醇與偶聯(lián)物分開(kāi)。對(duì)于其他與生長(zhǎng)激素分子量相近的蛋白質(zhì)，如紅細(xì)胞生長(zhǎng)素、G-CSF、干擾素、GM-CSF、白介素等，可以采用同樣的方法。需要滿(mǎn)足的條件是聚乙二醇分子量在20,000以上，蛋白質(zhì)分子量低于40,000。
本發(fā)明的另一方面是提供了同時(shí)將聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物與未偶聯(lián)生長(zhǎng)激素和聚乙二醇分離的方法。這種方法是將偶聯(lián)反應(yīng)后的產(chǎn)物首先置換到最低離子強(qiáng)度的陽(yáng)離子性緩沖液中，如Tris，然后將反應(yīng)產(chǎn)物在陰離子交換柱中分離并用不同離子強(qiáng)度的緩沖液洗脫。在此條件下，游離聚乙二醇結(jié)合能力很低，首先被分離，聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物與陰離子柱的結(jié)合能力與游離生長(zhǎng)激素相比降低，因此在較低的離子強(qiáng)度條件下洗脫，而游離的生長(zhǎng)激素在較高的離子強(qiáng)度下洗脫。更為具體地說(shuō)，偶聯(lián)反應(yīng)混合物在反應(yīng)完成后首先用脫鹽層析，如Sephadex G25，進(jìn)行緩沖液交換，適用的緩沖液體系為陽(yáng)離子緩沖液，如Tris。緩沖液pH值應(yīng)該高于6.5，一般采用pH7.4，濃度通常為20mM。將緩沖液置換后的反應(yīng)混合物在Q陰離子交換柱(如Mono-Q或Q-Sepharose，Pharmacia Biotech)上進(jìn)行純化，游離聚乙二醇在上樣和用平衡液洗滌時(shí)便被分離，而聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物和游離生長(zhǎng)激素則結(jié)合在柱上。上樣后，用與上樣相同的平衡液(20mM Tris，PH7.4)洗滌，然后用同樣的緩沖體系，逐步增加離子強(qiáng)度來(lái)洗脫。聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物與陰離子柱結(jié)合的能力被減弱，因此在含有50mM氯化鈉的洗脫液(50mM氯化鈉，20mM Tris，PH7.4)中洗脫聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物。未偶聯(lián)生長(zhǎng)激素在超過(guò)65mM氯化鈉的洗脫液(并含有20mM Tris，PH7.4)中洗脫。本方法可以在同一步有效地將游離聚乙二醇和生長(zhǎng)激素從需要的偶聯(lián)產(chǎn)物中分離出來(lái)，得到高純度的適于藥用的聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物。
1.藥物組合物去除大鼠腦垂體造成人為的生長(zhǎng)激素缺乏癥。如果不給外源性生長(zhǎng)激素，去除腦垂體的大鼠體重將保持不變，此模型是檢測(cè)生長(zhǎng)激素生物活性的標(biāo)準(zhǔn)方法。人生長(zhǎng)激素在大鼠中的半衰期小于30分鐘(Jorgensen et al.Pharmacol.Toxicol.，63129-134，1988)，要觀(guān)察人生長(zhǎng)激素的活性需要給每天大鼠注射人生長(zhǎng)激素。長(zhǎng)效效果是指延長(zhǎng)了生長(zhǎng)激素的生物學(xué)活性，這種長(zhǎng)效結(jié)果不能通過(guò)簡(jiǎn)單的劑量增加來(lái)獲得。例如，在腦垂體去除大鼠中，增加生長(zhǎng)激素的劑量可以相應(yīng)增加體重增加的程度，但無(wú)論劑量如何，其增重效應(yīng)不超過(guò)24小時(shí)。長(zhǎng)效的生長(zhǎng)激素則應(yīng)該在同樣或更少的劑量下，在單位時(shí)間內(nèi)用藥次數(shù)減少的條件下，達(dá)到同樣的體重增加的目的。
本發(fā)明提供了治療哺乳動(dòng)物各種疾病的方法。方法包括給需要治療的哺乳動(dòng)物提供本發(fā)明中有效劑量的聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物。這種偶聯(lián)物可以用于治療生長(zhǎng)激素缺乏癥或者使用生長(zhǎng)激素后可以產(chǎn)生有利效果的病癥。用于治療上述病癥所需聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物的劑量一般取決于偶聯(lián)物所含生長(zhǎng)激素的活性。這種劑量的要求是能夠產(chǎn)生有效的和有利的臨床反應(yīng)，其最大劑量取決于藥物不產(chǎn)生臨床上重要的副作用。一般來(lái)講，所用偶聯(lián)物的劑量可以單位時(shí)間內(nèi)累計(jì)用常規(guī)生長(zhǎng)激素的劑量為參考。這種參考劑量只是用于說(shuō)明目的，最佳劑量的選定要根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)和治療適應(yīng)癥具體確定。本發(fā)明的高純度的聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物可以用于生產(chǎn)可用于治療哺乳動(dòng)物的藥物組合物。這種藥物組合物可以是溶液、懸浮液、凍干粉劑、片劑、膠囊等等常規(guī)的藥物劑型，用藥方法主要采用非腸胃給藥方法，但口服或呼吸劑型也可使用。
2.高分子量分叉型聚乙二醇的合成本發(fā)明的另外一個(gè)方面是提供一種合成高分子量分叉型的聚乙二醇分子的方法。這種聚乙二醇的分子定義為下列結(jié)構(gòu)代表Rx-B-R1其中R是接在分叉連接物B上的聚乙二醇支鏈，可以是直線(xiàn)型分子，也可以是分叉型分子。X為在分叉連接物上的聚乙二醇支鏈數(shù)目，可以是在2-4之間。聚乙二醇支鏈可以是同樣大小或形狀，也可以是不同大小或形狀，分子量可以在2000到20,000之間。
B是含有至少兩個(gè)親核功能團(tuán)的分叉連接物，并通過(guò)親核基團(tuán)的反應(yīng)與聚乙二醇支鏈相鄰。B并與另外一個(gè)聚乙二醇支鏈R1相連。親核基團(tuán)可以是氨基，另一基團(tuán)可以是羧基或羥基。賴(lài)氨酸是連接物B的典型代表。
R1是一個(gè)線(xiàn)性的具有不同功能團(tuán)的聚乙二醇，其中一頭連接在B連接物上，另一頭為可后繼活化的集團(tuán)，如羧酸或羥基。R1的分子量在200到20,000之間。合成時(shí)，首先將R1支鏈與活化的B反應(yīng)，形成分叉，反應(yīng)物B的親核基團(tuán)采用同樣或不同的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。以賴(lài)氨酸為例，如采用同樣的保護(hù)基團(tuán)，如Fmoc-Lys(Fmoc)或者Boc-Lys(Boc)，在保護(hù)基團(tuán)去除后，可以連接相同大小或形狀的聚乙二醇分子。如采用不同的保護(hù)基團(tuán)，如Fmoc-Lys(Boc)或相反的保護(hù)，可連接不同大小或形狀的聚乙二醇分子。B的活化采用形成對(duì)硝基苯基(p-nitrophenyl)或琥珀酸亞胺基(succinimidyl)功能團(tuán)，并與R1的親核基團(tuán)反應(yīng)。
在反應(yīng)完成并將保護(hù)基團(tuán)去除后，所得產(chǎn)物B-R1的結(jié)構(gòu)為一頭具有兩個(gè)親核基團(tuán)(氨基)，另一頭帶有羧酸或羥基以便最終活化。
聚乙二醇支鏈R一般為甲氧基-聚乙二醇，可以用常規(guī)方法活化，活化的聚乙二醇也可以從Shearwater公司購(gòu)買(mǎi)商業(yè)產(chǎn)品。對(duì)硝基苯基或NHS活化后的聚乙二醇可以與B-R1上的親核基團(tuán)(氨基)反應(yīng)，形成共價(jià)鍵相連接的穩(wěn)定的終產(chǎn)物Rx-B-R1。
本發(fā)明與文獻(xiàn)中其它形成分叉聚乙二醇的方法相比(Monfardiniet al.，Bioconjugate Chem.，662-69，1995；Nathan et al.，Macromolecules，254476-84，1992)，優(yōu)點(diǎn)在于所有的反應(yīng)都在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，以利反應(yīng)效率的提高。反應(yīng)產(chǎn)物在與蛋白質(zhì)連接時(shí)，在蛋白質(zhì)反應(yīng)位點(diǎn)和大分子之間擁有空間，利于反應(yīng)完成，同時(shí)側(cè)鏈的數(shù)目、大小和形狀可以自由選擇。
本發(fā)明公開(kāi)了一種采用大分子量聚乙二醇修飾生長(zhǎng)激素的方法，得到了能夠顯著延長(zhǎng)在大鼠中療效的修飾產(chǎn)物，此修飾產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)單一，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，可進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制，具有強(qiáng)的實(shí)用性。


圖1人生長(zhǎng)激素及聚乙二醇偶聯(lián)物在腦垂體去除大鼠中的增重效果腦垂體去除大鼠用溶媒(AQ緩沖液，實(shí)心正方)、每天10微克人生長(zhǎng)激素(空心正方)、每7天70微克PEG40-hGH偶聯(lián)物(實(shí)心圓圈)和每7天70微克PEG80-hGH偶聯(lián)物(空心圓圈)治療。圖中顯示為治療后每天體重增加的平均值，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差。
圖2人生長(zhǎng)激素聚乙二醇偶聯(lián)物在腦垂體去除大鼠中的增重效果的量效關(guān)系腦垂體去除大鼠用溶媒(AQ緩沖液，實(shí)心正方)，每天10微克人生長(zhǎng)激素(空心正方)，每7天30微克PEG80-hGH偶聯(lián)物(實(shí)心圓圈)和每7天70微克PEG80-hGH偶聯(lián)物(空心圓圈)治療。圖中顯示為治療后每天體重增加的平均值，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差。
圖3人生長(zhǎng)激素聚乙二醇偶聯(lián)物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳4-20％SDS-聚丙烯酰胺凝膠預(yù)制膠在電泳完成后用考馬斯亮藍(lán)染色后照相，本圖為染色后膠的照片。
第1道，人生長(zhǎng)激素；第2道，比例為1∶3的人生長(zhǎng)激素∶聚乙二醇反應(yīng)產(chǎn)物；第3道，比例為1∶5的人生長(zhǎng)激素∶聚乙二醇反應(yīng)產(chǎn)物；第4道，比例為1∶7.5的人生長(zhǎng)激素∶聚乙二醇反應(yīng)產(chǎn)物；
第5道，比例為1∶10的人生長(zhǎng)激素∶聚乙二醇反應(yīng)產(chǎn)物；第6道，低蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；第7道，Mono-Q柱50mM氯化鈉洗脫峰(人生長(zhǎng)激素∶聚乙二醇比例1∶3)；第8道，Mono-Q柱65mM氯化鈉洗脫峰(人生長(zhǎng)激素∶聚乙二醇比例1∶3)；第9道，Mono-Q柱500mM氯化鈉洗脫峰(人生長(zhǎng)激素∶聚乙二醇比例1∶3)。
圖4人生長(zhǎng)激素聚乙二醇偶聯(lián)物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳4-20％SDS-聚丙烯酰胺凝膠預(yù)制膠在電泳完成后用考馬斯亮藍(lán)染色后照相，本圖為染色后膠的照片。
第1道，Mono-Q柱50mM氯化鈉洗脫峰(人生長(zhǎng)激素∶聚乙二醇比例1∶5)；第2道，Mono-Q柱65mM氯化鈉洗脫峰(人生長(zhǎng)激素∶聚乙二醇比例1∶5)；第3道，Mono-Q柱500mM氯化鈉洗脫峰(人生長(zhǎng)激素∶聚乙二醇比例1∶5)；第4道，Mono-Q柱50mM氯化鈉洗脫峰(人生長(zhǎng)激素∶聚乙二醇比例1∶7.5)；第5道，Mono-Q柱65mM氯化鈉洗脫峰(人生長(zhǎng)激素∶聚乙二醇比例1∶7.5)；第6道，Mono-Q柱500mM氯化鈉洗脫峰(人生長(zhǎng)激素∶聚乙二醇比例1∶7.5)；第7道，Mono-Q柱50mM氯化鈉洗脫峰(人生長(zhǎng)激素∶聚乙二醇比例1∶10)；第8道，Mono-Q柱65mM氯化鈉洗脫峰(人生長(zhǎng)激素∶聚乙二醇比例1∶10)；第9道，Mono-Q柱500mM氯化鈉洗脫峰(人生長(zhǎng)激素∶聚乙二醇比例1∶10)；第10道，低蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖5人生長(zhǎng)激素及40KDA聚乙二醇人生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物在腦垂體去除大鼠中的增重效果腦垂體去除大鼠用溶媒(AQ緩沖液，實(shí)心正方)，每天20微克人生長(zhǎng)激素(空心圓圈)，每7天70微克PEG40-hGH偶聯(lián)物(實(shí)心圓圈)和每7天140微克PEG80-hGH偶聯(lián)物(空心正方)治療。圖中顯示為治療后每天體重增加的平均值，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差。
圖6人生長(zhǎng)激素及聚乙二醇偶聯(lián)物同劑量一次注射在腦垂體去除大鼠中的增重效果腦垂體去除大鼠每天用140微克人生長(zhǎng)激素(實(shí)心圓圈)和每7天用140微克PEG40-hGH偶聯(lián)物(空心圓圈)注射一次治療。圖中顯示為治療后每天體重增加的平均值，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1高分子量分叉型聚乙二醇的制備為延長(zhǎng)生長(zhǎng)激素的半衰期，高分子量分叉型聚乙二醇較為適用。以下敘述了一種合成多分叉分子量為80,000的聚乙二醇的方法，而這個(gè)方法同樣可用于合成其他不同分子量或形狀的聚乙二醇。
將11.8mg Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(MW590，20μmol，AdvancedChemTech)溶解在120μl含有24μmol NHS(Sigma)的二甲基甲酰胺(DMF)中，加入3.8μl二異丙基碳二亞胺(DIC，MW126，d＝0.8，24μmol，Advanced ChemTech)，反應(yīng)在室溫下振蕩兩小時(shí)。將68mgNH2-PEG-COOH(MW3400，20μmol，Shearwater)溶解在100μl二氯甲烷(DCM)中，加入6.9μl二異丙基乙胺(DIPEA，MW129，d＝0.74，40μmol，Sigma)，并與前部反應(yīng)混合，室溫下振蕩一小時(shí)后，加入10％六氫吡啶，室溫下振蕩5分鐘，將反應(yīng)產(chǎn)物以超過(guò)體積比1∶10(混合物∶乙醚)的比例沉淀在乙醚中并真空干燥。得到78mg(NH2)2-PEG-COOH終產(chǎn)品。
將8.8mg(NH2)2-PEG-COOH(5μmol氨基)溶于100μl DCM，然后加入200mg mPEG2-40K-NHS(MW42500，5μmol，Shearwater)和1.7μlDIPEA(10μmol)，反應(yīng)在室溫下振蕩一夜。產(chǎn)物在乙醚中沉淀并真空干燥。
合成的80kDa聚乙二醇在Superdex 200層析柱上純化(2.6×40cm)，將柱用水平衡，并將要純化的產(chǎn)物溶于5ml水中。上樣后用水洗脫，并在214nm觀(guān)察，并將第一個(gè)峰混合，真空干燥。
純化后的80kDa聚乙二醇采用DIC進(jìn)行活化。將100mg 80kDamPEG4-COOH(1.25μmol)溶于0.5ml干燥DCM中，加入1.3μmol NHS和0.25μl DIC(1.5μmol)。反應(yīng)在室溫下振蕩過(guò)夜。將產(chǎn)物用乙醚沉淀并真空干燥。回收產(chǎn)物103mg，干燥保存在-20℃。
實(shí)施例2生長(zhǎng)激素與80kDa和40kDa聚乙二醇偶聯(lián)將234mg生長(zhǎng)激素凍干粉劑溶于4ml 0.1M磷酸鈉，pH7.0。將HiTrap Sephadex G25脫鹽柱(2.5×15cm，Pharmacia Biotech)用人0.1M磷酸鈉(pH7.0)平衡，并將生長(zhǎng)激素樣品上樣，在280nm觀(guān)察，收集第一個(gè)峰(18ml)。測(cè)定280nm光密度并用消光系數(shù)0.68計(jì)算生長(zhǎng)激素濃度，結(jié)果為280nm光密度1.2，蛋白質(zhì)濃度1.76mg/ml，總蛋白32mg。
與80kDa聚乙二醇偶聯(lián)時(shí)，稱(chēng)取60mg活化后的80kDamPEG4-NHS(0.7μmol)，加入到1.1ml含6mg生長(zhǎng)激素(0.3μmol)的磷酸鈉(pH7.0)溶液中，反應(yīng)在4℃過(guò)夜振蕩。
與40kDa聚乙二醇偶聯(lián)時(shí)，稱(chēng)取60mg活化后的40kDamPEG2-NHS(1.5μmol)，加入到2ml含10mg生長(zhǎng)激素(0.3μmol)的磷酸鈉(pH7.0)溶液中，反應(yīng)在4℃過(guò)夜振蕩。
實(shí)施例380kDa和40kDa聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物用Superdex75純化80kDa和40kDa聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物用Superdex 75層析柱(1.5×40cm，Pharmacia Biotech)純化。將層析柱用150mM氯化鈉，10mM檸檬酸鈉，0.2％吐溫20，pH6.0的溶液平衡后上樣，上樣體積低于柱體積的5％，用280nm觀(guān)察蛋白峰，并收集第一個(gè)洗脫峰。共收集了35ml濃度為0.16mg/ml的40kDa聚乙二醇人生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物，總蛋白量5.6mg。共收集了28ml濃度為0.08mg/ml 80kDa聚乙二醇人生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物，總蛋白量2.6mg。
實(shí)施例440kDa和80kDa聚乙二醇人生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物在腦垂體去除大鼠中的長(zhǎng)效效應(yīng)六十只八周齡腦垂體去除的雌性Sprague Dawley大鼠購(gòu)買(mǎi)于Taconic Farms公司，四只大鼠因健康不佳剔除。分組前10天，觀(guān)察每個(gè)大鼠體重變化，并將體重增加超過(guò)所有小鼠平均值一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方差的大鼠剔除。其余大鼠(53只)隨機(jī)分為以下5組溶媒組，10只大鼠，連續(xù)14天每天皮注1毫升AQ緩沖液(0.2％吐溫-20，150mM氯化鈉，10mM檸檬酸鈉，pH6.0)；生長(zhǎng)激素組，10只大鼠，連續(xù)14天每天皮注1毫升含10微克人生長(zhǎng)激素的AQ緩沖液；80N-70組，11只大鼠，第0天和第8天皮注1毫升含70微克80kDa聚乙二醇人生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物的AQ緩沖液；80N-30組，11只大鼠，第0天和第8天皮注1毫升含30微克80kDa聚乙二醇人生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物的AQ緩沖液；40N-70組，11只大鼠，第0天和第8天皮注1毫升含70微克40kDa聚乙二醇人生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物的AQ緩沖液。
每天測(cè)定大鼠體重，圖1和圖2顯示了各組大鼠在治療過(guò)程中體重變化的曲線(xiàn)，第7天和第14天各組大鼠體重變化的平均值及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析列在表1和表2中。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用EXCEL軟件的t檢驗(yàn)功能，指標(biāo)為雙尾和不等方差。
表1 治療后第7天腦垂體去除大鼠的平均體重增加

表2 治療后第14天腦垂體去除大鼠的平均體重增加

結(jié)果表明，40N-70和80N-70組大鼠的平均體重增加與陽(yáng)性對(duì)照生長(zhǎng)激素組沒(méi)有區(qū)別，即高分子量分叉型聚乙二醇生長(zhǎng)激素的偶聯(lián)物每7天一針，起到了常規(guī)生長(zhǎng)激素每日注射同樣的增重效果。這種增重效果與所用偶聯(lián)物的劑量有量效關(guān)系。
實(shí)施例5聚乙二醇與生長(zhǎng)激素偶聯(lián)及偶聯(lián)物的純化將43.5mg人生長(zhǎng)激素凍干粉劑溶于1.0ml水中，上樣到HiTrapG25脫鹽柱將緩沖液置換到50mM磷酸鈉，pH6.5。測(cè)定280nm的光密度，并用0.68的消光系數(shù)計(jì)算蛋白濃度?；厥盏目偵L(zhǎng)激素量為5.7毫克，將其分為四份，每份含1.4mg蛋白，體積0.75ml。
按下表稱(chēng)取四份適量的mPEG2-NHS(MW40,000，Shearwater)，并分別加入到生長(zhǎng)激素樣品中，反應(yīng)在4℃過(guò)夜進(jìn)行。

以上反應(yīng)完成后，分別采用HiTrap G25脫鹽柱將緩沖液置換為20mM Tris，pH7.4。每個(gè)樣品分別上樣到已用20mM Tris，pH7.4緩沖液平衡的Mono-Q HR5/5層析柱(Pharmacia Biotech)，并用階梯增加離子強(qiáng)度的方式進(jìn)行洗脫，洗脫峰在280nm觀(guān)察，洗脫液為洗脫液150mM氯化鈉，20mM Tris，pH7.4；洗脫液265mM氯化鈉，20mM Tris，pH7.4；
洗脫液1500mM氯化鈉，20mM Tris，pH7.4。
將洗脫后的各洗脫峰收集，每個(gè)樣品取80微升，加入5微升5倍的SDS-聚丙烯酰胺凝膠樣品處理緩沖液，在100℃加熱到總體積低于30微升，將所有樣品上到4-20％的預(yù)制的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完成后用考馬斯亮藍(lán)染色并照相。圖3和圖4是電泳后的照片。
結(jié)果表明，生長(zhǎng)激素和40kDa分叉型聚乙二醇(mPEG2-NHS)可有效形成一個(gè)聚乙二醇與一個(gè)生長(zhǎng)激素分子結(jié)合的偶聯(lián)物。生長(zhǎng)激素和聚乙二醇二者的摩爾數(shù)比例在1∶5-1∶7.5時(shí)偶聯(lián)效率較高，而且有較少的多個(gè)聚乙二醇分子與生長(zhǎng)激素偶聯(lián)的現(xiàn)象，效果最佳。
陰離子交換柱Mono-Q可以有效地將聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物與游離人生長(zhǎng)激素和游離聚乙二醇分離。游離聚乙二醇在上樣和平衡液洗脫時(shí)就被分開(kāi)，而聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物在50mM氯化鈉的洗脫液中洗脫，游離的生長(zhǎng)激素在65mM以上的氯化鈉洗脫液中洗脫。
將從Mono-Q柱洗脫的所有50mM氯化鈉洗脫峰混合，并用HiTrap G25脫鹽柱將緩沖液交換到AQ緩沖液中(150mM氯化鈉，0.2％吐溫-20，10mM檸檬酸鈉，pH6.0)。置換緩沖液后的樣品用0.22μm濾器除菌過(guò)濾(CAMEO 25AS)并保存在2-8℃用于動(dòng)物活性試驗(yàn)。
實(shí)施例6用陰離子交換柱制備聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物將88.4mg人生長(zhǎng)激素凍干粉劑溶于1.0ml水中，上樣到兩個(gè)連接的HiTrap G25脫鹽柱將緩沖液置換到50mM磷酸鈉，pH6.5。測(cè)定280nm的光密度，并用0.68的消光系數(shù)計(jì)算蛋白濃度?；厥盏目偵L(zhǎng)激素量為14毫克，體積5.5毫升，將體積用50mM磷酸鈉，pH6.5溶液調(diào)整到8毫升，分為八份，每份含1.75mg蛋白，體積1ml。按下表稱(chēng)取八份26.25毫克的mPEG2-NHS(MW40,000，Shearwater)，并分別加入到生長(zhǎng)激素樣品中，反應(yīng)在4℃過(guò)夜進(jìn)行。

以上反應(yīng)完成后，采用HiTrap G25脫鹽柱將緩沖液置換為20mMTris，pH7.4，并將樣品上樣到已用20mM Tris，pH7.4緩沖液平衡的Mono-Q HR5/5層析柱(Pharmacia Biotech)，并用階梯增加離子強(qiáng)度的方式進(jìn)行洗脫，洗脫峰在280nm觀(guān)察，洗脫液為洗脫液150mM氯化鈉，20mM Tris，pH7.4；洗脫液265mM氯化鈉，20mM Tris，pH7.4；洗脫液1500mM氯化鈉，20mM Tris，pH7.4。
將洗脫后的各洗脫峰收集，每個(gè)樣品取80微升，加入5微升5倍的SDS-聚丙烯酰胺凝膠樣品處理緩沖液，在100℃加熱到總體積低于30微升，將所有樣品上到4-20％的預(yù)制的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完成后用考馬斯亮藍(lán)染色并照相。
結(jié)果表明，陰離子交換柱Q-Sepharose Fast Flow與Mono-Q柱的分離效果相同，聚乙二醇生長(zhǎng)激素的偶聯(lián)物在含50mM氯化鈉的洗脫液中洗脫。
將從Q-Sepharose柱洗脫的所有50mM氯化鈉洗脫峰混合，并用HiTrap G25脫鹽柱將緩沖液交換到AQ緩沖液中(150mM氯化鈉，0.2％吐溫-20，10mM檸檬酸鈉，pH6.0)。置換緩沖液后的樣品用0.22μm濾器除菌過(guò)濾(CAMEO 25AS)并保存在2-8℃用于動(dòng)物活性試驗(yàn)。
實(shí)施例7聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物在腦垂體去除大鼠中的活性四十只8周齡腦垂體去除雌性Sprague Dawley大鼠購(gòu)買(mǎi)于Taconic Farms公司，兩只大鼠因健康不佳剔除。分組前12天，觀(guān)察每個(gè)大鼠體重變化，并將體重增加超過(guò)所有小鼠平均值一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方差的三只大鼠剔除。其余大鼠(35只)隨機(jī)分為以下5組溶媒組，9只大鼠，連續(xù)14天每天皮注1毫升AQ緩沖液(0.2％吐溫-20，150mM氯化鈉，10mM檸檬酸鈉，pH6.0)；生長(zhǎng)激素組，6只大鼠，連續(xù)14天每天皮注1毫升含20微克人生長(zhǎng)激素的AQ緩沖液；PEGhGH-70組，10只大鼠，第0天和第7天皮注1毫升含70微克40kDa聚乙二醇人生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物的AQ緩沖液；PEGhGH-140組，10只大鼠，第0天和第7天皮注1毫升含30微克80kDa聚乙二醇人生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物的AQ緩沖液。
每天測(cè)定大鼠體重，圖5顯示了各組大鼠在治療過(guò)程中體重變化的曲線(xiàn)，第7天和第14天各組大鼠體重變化的平均值及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析列在表3和表4中。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用EXCEL軟件的t檢驗(yàn)功能，指標(biāo)為雙尾和不等方差。
表3 治療后第7天腦垂體去除大鼠體重增加的平均值

表4 治療后第14天腦垂體去除大鼠體重增加的平均值

結(jié)果表明，經(jīng)140微克聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物(PEGhGH-140組)每7天用藥一次的增重效果與每天注射20微克常規(guī)生長(zhǎng)激素相當(dāng)，并且大鼠的增重與所用偶聯(lián)物劑量呈量效關(guān)系。
實(shí)施例8在腦垂體去除大鼠中同劑量一次用藥的生長(zhǎng)激素和聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物藥效比較九只11周齡雌性腦垂體去除的Sprague Dawley大鼠購(gòu)自TaconicFarms公司，并隨機(jī)分為以下兩組生長(zhǎng)激素組，4只大鼠，一次皮注1ml含140μg/ml人生長(zhǎng)激素的AQ緩沖液；PEG-hGH組，5只大鼠，一次皮注1ml含140μg/ml聚乙二醇人生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物的AQ緩沖液；各組大鼠每天體重增加的變化曲線(xiàn)顯示在圖6中，第7天各組大鼠體重增加的平均值列在表5中。
表5.治療后第7天腦垂體去除大鼠體重增加的平均值

結(jié)果表明，采用140微克聚乙二醇人生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物治療的大鼠體重增加顯著高于用140微克常規(guī)人生長(zhǎng)激素組，即聚乙二醇人生長(zhǎng)激素達(dá)到的長(zhǎng)效目標(biāo)，單純?cè)黾由L(zhǎng)激素劑量無(wú)法達(dá)到同樣效果。
權(quán)利要求
1.高純度的聚乙二醇生長(zhǎng)激素偶聯(lián)物，其中聚乙二醇和生長(zhǎng)激素的摩爾比是1∶1；
2.權(quán)利要求1中的偶聯(lián)物，其中聚乙二醇的分子量在20,000到120,000之間；
3.權(quán)利要求2中的偶聯(lián)物，其中聚乙二醇的分子量在40,000到80,000之間；
4.權(quán)利要求1中的偶聯(lián)物，其中聚乙二醇含有兩個(gè)到四個(gè)分叉支鏈；
5.權(quán)利要求4中的偶聯(lián)物，其中每個(gè)聚乙二醇支鏈的分子量在5,000到20,000之間；
6.權(quán)利要求1中的偶聯(lián)物，其中偶聯(lián)物的純度大于95％；
7.權(quán)利要求1中的偶聯(lián)物，其中偶聯(lián)物能起到長(zhǎng)效作用；
8.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-7偶聯(lián)物的方法，其特點(diǎn)是單功能團(tuán)活化的聚乙二醇與生長(zhǎng)激素在pH值5.5到7.5之間的水溶液進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)；
9.一種生產(chǎn)權(quán)利要求8偶聯(lián)物的方法，其特點(diǎn)是單功能團(tuán)活化的聚乙二醇與生長(zhǎng)激素在pH值6.5到7.0之間的水溶液進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)；
10.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-7中偶聯(lián)物的方法，其特點(diǎn)是將偶聯(lián)混合物用Superdex 75分子篩層析進(jìn)行分離純化；
11.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-7中偶聯(lián)物的方法，其特點(diǎn)是將偶聯(lián)混合物用陰離子交換層析柱進(jìn)行分離純化；
12.一種根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中陰離子交換柱是Q；
13.一種根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中權(quán)利要求1-6的偶聯(lián)物在含50毫摩爾氯化鈉的緩沖液中洗脫；
14.一種含有權(quán)利要求1-7中偶聯(lián)物的有效劑量的藥物組合物，以及藥物接受的稀釋劑、穩(wěn)定劑或其它輔料；
15.一種根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物，其特點(diǎn)是此藥物組合物具有長(zhǎng)效的功能；
16.一種高分子的分叉型聚乙二醇分子，結(jié)構(gòu)式表達(dá)為Rx-B-R1其中R為連在連接物B上的聚乙二醇支鏈，x為此支鏈的數(shù)目，在2-4之間，R1是個(gè)雙功能聚乙二醇分子，一頭連接在連接物B上，另一頭具有游離的羧基或羥基；
17.一種根據(jù)權(quán)利要求16的高分子的分叉型聚乙二醇分子，其分子量在20,000到120,000之間；
18.一種根據(jù)權(quán)利要求17的高分子的分叉型聚乙二醇分子，其分子量在40,000到80,000之間；
19.一種聚乙二醇偶聯(lián)物，其特點(diǎn)是權(quán)利要求16到18的聚乙二醇分子與蛋白質(zhì)或其他分子形成偶聯(lián)物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種采用大分子量聚乙二醇修飾生長(zhǎng)激素的方法，得到了能夠顯著延長(zhǎng)生長(zhǎng)激素半衰期的修飾產(chǎn)物，此修飾產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)單一，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，可進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制，具有強(qiáng)的實(shí)用性。
文檔編號(hào)A61P5/00GK1477126SQ03133278
公開(kāi)日2004年2月25日 申請(qǐng)日期2003年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月22日
發(fā)明者李偉華, 董建, 王紹白 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司, 李偉華, 董建, 王紹白