專利名稱：雞傳染性法氏囊病病毒ibdv vp2蛋白配體結(jié)合表位多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子病理學(xué)與免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白配體的結(jié)合表位多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
IBD是由IBDV引起的雞和火雞的一種高度接觸性傳染病，病毒在法氏囊的B淋巴細(xì)胞中迅速繁殖，損傷法氏囊的B淋巴細(xì)胞，引起嚴(yán)重的免疫抑制，往往給養(yǎng)雞業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，IBDV超強(qiáng)毒株的不斷產(chǎn)生，增加了對該病的防控難度。在病毒感染細(xì)胞的過程中，病毒吸附細(xì)胞是第一步也是關(guān)鍵步驟，這涉及病毒結(jié)合細(xì)胞的受體與細(xì)胞上的配體與病毒之間的相互作用問題，病毒必須首先結(jié)合到靶細(xì)胞表面，經(jīng)受體的介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，然后才能復(fù)制，引起相關(guān)的病理變化；因此如果找到病毒配體或者病毒受體，以其中任何一個為藥靶都可以阻斷病毒與受體的結(jié)合。初步研究結(jié)果獲得了一些IBDV受體和配體的信息，如受體是糖蛋白，與SIgM陽性B細(xì)胞的表面分子有關(guān)，也可能是雞熱休克蛋白 90 ；結(jié)合IBDV受體的配體蛋白是IBDV VP2，但是IBDV配體蛋白VP2與受體結(jié)合多肽表位未見報道。應(yīng)用生物技術(shù)和蛋白質(zhì)技術(shù)來研究病毒受體和病毒配體，對于探明IBD發(fā)生的分子機(jī)制，阻斷病毒對細(xì)胞的吸附和侵染過程，防止傳染病的發(fā)生有重大意義?？梢灶A(yù)見，發(fā)現(xiàn)病毒配體是最有競爭力和挑戰(zhàn)性的課題之一。而與此相關(guān)的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究必將極大豐富我們對病毒與宿主關(guān)系的認(rèn)識，并對抗病毒疫苗及抗病毒藥物的設(shè)計產(chǎn)生重大影響。 IBDV作為無囊膜的RNA病毒，研究IBDV配體線性多肽表位，揭示該病毒的侵染機(jī)制，具有重要的理論價值和實踐意義，從分子水平上探索IBDV感染細(xì)胞的機(jī)制，將為研究開發(fā)IBDV感染阻斷劑藥物，控制傳染病的發(fā)生提供理論依據(jù)，同時也為其它傳染病致病機(jī)制的研究提供借鑒和參考。本實驗室已經(jīng)成功制備了 30多株IBDV單抗，為IBDV VP2配體結(jié)合表位的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明提供了 IBDV結(jié)合靶細(xì)胞的一條線性配體表位多肽P22的氨基酸序列，該配體表位多肽P22能夠抑制IBDV感染CEF，隨多肽濃度的增加感染率降低，并且得到能夠完全抑制病毒感染靶細(xì)胞的多肽濃度。還提供了細(xì)胞免疫化學(xué)染色鑒定多肽P22與CEF的結(jié)合效率及多肽抑制IBDV感染CEF靶細(xì)胞的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案
本發(fā)明利用生物信息學(xué)技術(shù)，分析了 IBDV的VP2蛋白氨基酸序列的一級結(jié)構(gòu)，設(shè)計并合成了 IBDV VP2蛋白上的1條多肽，P22命名為。以CEF為靶細(xì)胞，通過IBDV的感染、收獲，測定了 IBDV的毒力、半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)和感染比(Μ0Ι )，進(jìn)行合成多肽與靶細(xì)胞的結(jié)合試驗、病毒阻斷試驗和多肽阻斷IBDV感染靶細(xì)胞的試驗，篩選的特異性結(jié)合靶細(xì)胞能夠抑制病毒感染配體表位多肽，并對IBDV的配體表位進(jìn)行了精確定位。雞傳染性法氏囊病病毒IBDV VP2蛋白配體的結(jié)合表位多肽的氨基酸序列為Iqs ngnykfdqmlgtaqnlpasynycrlvsrsltvrsstIpggο所述的結(jié)合表位多肽位于VP2三維結(jié)構(gòu)S區(qū)域的D-E環(huán)。所述的結(jié)合表位多肽為線性配體結(jié)合表位。所述的結(jié)合表位多肽用Sulfo-NHS-Biotin標(biāo)記多肽時，多肽與 Sulfo-NHS-Biotin 的摩爾比為 1:1 1 :4。所述多肽能夠抑制IBDV感染CEF的多肽濃度為0. 00625 0. 2mmol/L。所述多肽能夠完全抑制IBDV感染CEF時的多肽濃度為0. 2mmol/L。利用所述的結(jié)合表位多肽鑒定該多肽與CEF結(jié)合效率的方法包括以下步驟 ⑴制備CEF，37°C培養(yǎng)Mh，直至細(xì)胞鋪滿96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；
⑵加多肽，傾去上清液，將培養(yǎng)好的單層細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌3次，在培養(yǎng)板上依次加入濃度為 0. 2mmol/L、0. Immol/L、0. 05mmol/L、0. 025mmol/L 的用 Biotin 標(biāo)記的多月太 Biotin-P22,100 μ 1/孔，每個濃度重復(fù)做3次，在4°C結(jié)合lh，使細(xì)胞與Biotin-P22多肽充分結(jié)合，設(shè)6孔不加Biotin標(biāo)記的多肽P22的正常細(xì)胞做對照實驗，設(shè)6孔加Biotin-BSA 的細(xì)胞做無關(guān)多肽對照實驗；
(3)用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，洗去未結(jié)合的多肽，中止多肽結(jié)合試驗；
(4)固定，加入含0.3%H2O2的甲醇溶液，50μ 1/孔，4°C固定lOmin，傾去上清液，用 PBST洗滌3次；
(5)封閉，加入含5%血清的PBST緩沖液，100μ 1/孔，37°C封閉Ih ；傾去上清液，用 PBST洗滌3次；
(6)加Avidin-HRP，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的抗生物素蛋白，50μ 1/孔，1:500稀釋，稀釋液為含5%血清的PBST緩沖液，37°C作用Ih ；傾去上清液，用PBST洗滌3次；
(7)用AEC顯色試劑盒顯色，根據(jù)試劑盒的說明進(jìn)行操作，在顯微鏡下觀察試驗結(jié)果， 并記錄染色細(xì)胞數(shù)目。利用所述的結(jié)合表位多肽鑒定該多肽抑制IBDV感染CEF靶細(xì)胞的方法包括以下步驟⑴制備CEF，37°C培養(yǎng)Mh，直至細(xì)胞鋪滿96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；
⑵加多肽，傾去細(xì)胞上清液，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞一次，在培養(yǎng)板上依次加入濃度為 0. 00625mmol/L、0. 0125mmol/L、0. 025mmol/L、0. 05mmol/L 0. Immol/L、0. 2mmol/L 的 P22 多肽和BSA，100 μ 1/孔，每個濃度重復(fù)做3次，稀釋液為10%的DMEM，其中BSA作為無關(guān)多肽， 4°C作用Ih ；
(3)加病毒傾去含有多肽的上清液，每孔加入10倍TCID50量的IBDV感染細(xì)胞，其中一組不加病毒只加完全培養(yǎng)基作為陰性對照，4°C作用Ih ；
(4)用新鮮10%的DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，加新培養(yǎng)基于感染的細(xì)胞孔中，100μ 1/ 孔，在含5%ω2的培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)48h ；
(5)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，同時進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)染色，統(tǒng)計感染細(xì)胞數(shù)量， 具體步驟如下
5所述細(xì)胞免疫化學(xué)染色步驟為
①固定，加入含0.3%H2A的甲醇溶液，50μ 1/孔，4°C固定lOmin，傾去上清液，用 PBST洗滌3次；
②封閉，加入5%血清PBST，100y1/孔，37°C封閉Ih ；傾去上清液，用PBST洗滌3次；
③加Avidin-HRP，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的抗生物素蛋白，50μ 1/孔，1:500稀釋，稀釋液為含5%血清的PBST緩沖液，37°C作用Ih ；傾去上清液，用PBST洗滌3次；
④用AEC顯色試劑盒顯色，根據(jù)試劑盒的說明操作，在顯微鏡下觀察試驗結(jié)果，并記錄染色細(xì)胞數(shù)目。所述的結(jié)合表位多肽在抑制IBDV感染CEF中的應(yīng)用。本發(fā)明的積極有益效果
1、本發(fā)明提供了 IBDV結(jié)合靶細(xì)胞的一條線性配體表位多肽P22，該表位多肽位于VP2 蛋白上。2、本發(fā)明的配體表位多肽P22能夠抑制IBDV感染CEF，并隨多肽濃度的增加，CEF 的感染率降低，具有劑量依賴性，并得出多肽濃度為0. 2mmol/L時能夠完全抑制IBDV感染 CEF靶細(xì)胞的結(jié)論。3、本發(fā)明采用的細(xì)胞免疫化學(xué)染色鑒定多肽P22與CEF細(xì)胞的結(jié)合效率及多肽抑制IBDV感染CEF靶細(xì)胞的方法，該方法特異、敏感、經(jīng)濟(jì)易操作。4、本發(fā)明為進(jìn)一步從病毒配體和病毒受體相互作用方面進(jìn)行病毒配體表位的研究，為進(jìn)一步揭示IBDV的感染機(jī)制，以及抗病毒藥物篩選和新型疫苗的研制提供了理論依據(jù)。


圖1
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圖12圖。
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實施例2中0. 2mmol/L的Biotin_P22結(jié)合CEF的結(jié)果(100X)。
實施例2中0. lmmol/L的Biotin_P22結(jié)合CEF的結(jié)果(100X)。
實施例 2 中 0. 05mmol/L 的 Biotin_P22 結(jié)合 CEF 的結(jié)果(100X)。
實施例2中Biotin-BSA結(jié)合CEF的結(jié)果(100X)。
實施例2中正常的CEF (100X)。
實施例3中P22-moIgG與CEF結(jié)合的散點圖。
實施例3中P22-moIgG與CEF結(jié)合的集合圖。
實施例3中的Xin-I株IBDV阻斷P22-moIgG與CEF結(jié)合抑制的散點圖。 實施例3中的Xin-I株IBDV阻斷P22-moIgG與CEF結(jié)合抑制的集合圖。 實施例3中的moIgG與CEF結(jié)合的散點圖。 實施例3中的moIgG與CEF結(jié)合的集合圖。
實施例3的結(jié)合試驗和阻斷結(jié)合試驗的流式細(xì)胞儀疊加分析的平面疊加
實施例3中的結(jié)合試驗和阻斷結(jié)合試驗的流式細(xì)胞儀疊加分析的三維圖。 實施例4中0. 2mmol/L P22抑制IBDV感染CEF的結(jié)果Q00X)。 實施例4中0. 15mmol/L P22抑制IBDV感染CEF的結(jié)果(200X)。 實施例4中0. 05mmol/LP22抑制IBDV感染CEF的結(jié)果(200X)。
圖 17圖 18圖 19圖 20圖 21圖 22圖 2具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例來進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明中若沒有特別說明外，其中的百分比均指重量百分比。實施例1 IBDV VP2多肽的設(shè)計、合成、Sulfo-NHS-Biotin標(biāo)記多肽及多肽與小鼠 IgG CmoIgG)偶聯(lián)
1. 1多肽的設(shè)計
利用DNASIS (Ver. 2. 5，Hitachi)軟件將IBDV (P15480)的氨基酸序列進(jìn)行分析， 并參照IBDV VP2的晶體結(jié)構(gòu)(Fass6li Coulibaly等，2005年)，設(shè)計1條IBDV VP2多肽 P22，位于S區(qū)的D-E環(huán)，且多肽N端均添加Cys，用于載體蛋白偶聯(lián)。多肽的合成
利用Symphony 12通道多肽合成儀在Fmoc-氨基酸-王樹脂(Fmoc-Amino Acids attached to Wang Resin,RrZK ) ± ISIffi^lin-) ' (solid-phase peptide
synthesis)合成多肽，多肽合成按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行?；竞铣蛇^程為執(zhí)行^(1_1程序進(jìn)行C末端氨基酸王樹脂溶漲一執(zhí)行Std程序(或Md_db程序)*加20%的piperidine 脫Fmoc保護(hù)一用DMF洗樹脂一*加下一位Fmoc保護(hù)氨基酸和活化劑HBTU進(jìn)行酰化反應(yīng)一*用Kaiser法或TNBS法檢測?；磻?yīng)的完成情況一*DMF洗樹脂一重復(fù)執(zhí)行 Std程序(或Md_db程序)，在樹脂上連接下一位氨基酸(重復(fù)帶*步驟)，直到該多肽序列合成完成。根據(jù)組成肽鏈氨基酸不同選取適當(dāng)?shù)牧呀庠噭?，?zhí)行乂(1_(31￥程序，用TFA法裂解肽鏈與樹脂的連接一冷乙醚離心沉淀法回收TFA裂解多肽一Sephadex G_25脫鹽純化一MS和HPLC分析鑒定和純化多肽。其中，多肽裂解反應(yīng)完成后，應(yīng)用冷乙醚離心沉淀法從TFA裂解多肽收集液中回收合成肽產(chǎn)物。將收集管中的收集液蒸發(fā)30 60min，過濾除掉雜質(zhì)。向收集液中加入3倍收集液體積的冷乙醚(4°C )，蓋好收集管蓋，顛倒混勻，冰浴 10分鐘，3000r/m，離心lOmin，棄上清，留沉淀。重新用新鮮的冷乙醚重懸沉淀(旋渦震蕩)， 重復(fù)以上操作3次。收集沉淀物，即為粗品合成肽。粗品合成肽經(jīng)過G25脫鹽純化，再經(jīng)制備型HPLC純化后，冷凍干燥，-20°C保存?zhèn)溆?。合成IBDV VP2的多肽P22其氨基酸序列如 SEQ ID N0:1，其分子量為 4. 80kDa。標(biāo)記多肽
(1)將Sulfo-NHS-Biotin和多肽從_20°C取出，放置室內(nèi)使之恢復(fù)至室溫；
(2)稱量2.2mg的Sulfo-NHS-Biotin，溶于0. 5mL的雙蒸水中，充分混勻，配制成 IOmmol/L 的 Sulfo-NHS-Biotin 溶液；
實施例4中0. 025mmol/L P22抑制IBDV感染CEF的結(jié)果(200X)。 實施例4中0. 0125mmol/L P22抑制IBDV感染CEF的結(jié)果(200X)。 實施例4中0. 00625mmol/L P22抑制IBDV感染CEF的結(jié)果Q00X)。 實施例4中未加P22直接用10TCID50的IBDV感染CEF的結(jié)果Q00X)。 實施例4中BSA抑制IBDV感染CEF的結(jié)果Q00X)。 實施例4中正常的CEF (200 X).
實施例4中不同濃度P22多肽抑制IBDV感染CEF的感染抑制曲線。⑶稱量2mg多肽，溶于50μ DMSO溶劑中，配制成400mg/ml的儲存液；
(4)取出80μ Sulfo-NHS-Biotin與50μ 的多肽溶液充分混合(連接時多肽與 Sulfo-NHS-Biotin摩爾比是1:2)，室溫作用30min，4°C過夜孵育，獲得Biotin_P22多肽；
(5)以10%的DMEM調(diào)整Biotin-P22多肽濃度至lmg/ml，混勻后，小劑量分裝用于CEF
結(jié)合試驗。小鼠IgG CmoIgG)的提純
以飽和硫酸銨鹽析法粗提純鼠血清IgG。(1)取一定量血清，3000r/m、4°C離心30min ；取上清液加入等量PBS，對0. Olmol/ LpH 5.4 PB液透析Mh，沉淀優(yōu)球蛋白，3000r/m，4°C離心30min;
(2)取上清，加SAS使終濃度達(dá)50%，室溫作用2h，不斷攪拌，3000r/m,室溫離心30min， 棄去上清液；
⑶沉淀用雙蒸水溶解，加入SAS使終濃度達(dá)35%，室溫作用池，期間不斷攪拌，3000r/ m，室溫離心30min，棄去上清液；
⑷沉淀用雙蒸水溶解，再加入SAS使終濃度達(dá)33%，室溫作用lh，期間不斷攪拌， 3000r/m，室溫離心30min，棄去上清液；
(5)加入相當(dāng)于原血清量的雙蒸水溶解沉淀；于4°C對PBS攪拌透析96h，期間換液4 6次；收集蛋白液即為血清IgG。測定蛋白含量后分裝，-20°C保存(或加入終濃度0. 1%疊氮鈉，4°C保存)備用。. 5多肽與moIgG偶聯(lián)
(1)用異型雙功能試劑SMCC將多肽N端Cys的-SH與載體蛋白moIgG上的NH2相連， 形成人工結(jié)合的moIgG偶聯(lián)多肽P22- moIgG。(2)在 50ml DMSO 中溶解 Img Sulfo-SMCC (MW 436.37，Spacer arm length: 11.6 A, Pierce)，加入moIgG溶液560ml，充分混勻，室溫反應(yīng)1 h或37°C作用30 min，并不時混勻。(3) 4°C 下對偶聯(lián)緩沖液(0. lmol/L PB pH 7.2，0. 15 mol/L NaCl, Immo 1/ L EDTA)過夜透析，換液3次，去除多余偶聯(lián)劑。該溶液即為SMCC活化moIgG載體蛋白 (SMCC-moIgG)，用偶聯(lián)緩沖液調(diào)整蛋白濃度為5mg/ml，分裝、凍存。(4)稱取ang P22多肽，以50ml 二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解，加入150ml含5 mmol/L EDTA 的 0. 01 mol/L PB (pH 7. 2)，制備多肽儲存液，濃度為 10 mg/ml，_20°C凍存。(5)偶聯(lián)時，取IOml多肽儲存液(IOOmg)，加入等體積含5 mmol/L EDTA的 0. 01mol/L PB (pH 7.2)；與 60ml SMCC-MoIgG 溶液(300mg)充分混合，室溫反應(yīng) 4 h，4°C 過夜孵育，獲得偶聯(lián)多肽P22- moIgG。(6)以 0.01 mol/L PB (pH 7. 2)調(diào)整偶聯(lián)多肽P22_moIgG濃度至 0. 5 mg/ml，用于 P22的結(jié)合試驗。實施例2細(xì)胞免疫化學(xué)染色方法檢測Biotin-P22與CEF結(jié)合試驗 (1)制備CEF，37°C培養(yǎng)24h后，待到細(xì)胞鋪滿96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；
⑵傾去上清，培養(yǎng)好的單層細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌3次，在培養(yǎng)板上分別依次加入濃度從 0. 2mmol/L、0. Immol/L、0. 05mmol/L 至 0. 025mmol/L 的 Biotin 標(biāo)記的多肽 Biotin-P22，100y 1/孔，每一個稀釋濃度做3個重復(fù)孔，4°C結(jié)合lh，使細(xì)胞與Biotin_P22多肽充分結(jié)合，設(shè)6孔不加Biotin標(biāo)記的多肽P22的正常細(xì)胞做對照，設(shè)6孔加Biotin-BSA 的細(xì)胞為對照。(3)用預(yù)冷的PBS輕柔的洗滌細(xì)胞3次，洗去未結(jié)合的多肽，中止多肽結(jié)合試驗；
(4)固定，加入0.3%H2O2甲醇溶液50μ 1/孔，4°C固定lOmin，傾去上清，PBST洗滌3
次；
(5)封閉，加入5%血清PBST100 μ 1/孔，37°C封閉Ih;傾去上清，PBST洗滌3次；
(6)加Avidin-HRP，加入辣根過氧化酶標(biāo)記抗生物素蛋白50μ 1/孔，1 500稀釋，稀釋液為5%血清PBST，37°C作用Ih ；傾去上清，PBST洗滌3次；
(7)AEC顯色，按照試劑盒說明，依次將試劑盒中的A溶液、B溶液和C溶液各取一滴于 Iml雙蒸水中，充分混勻防止結(jié)晶出現(xiàn)，加以上溶液于96孔細(xì)胞板上，50 μ 1/孔，室溫作用 lOmin，顯微鏡下觀察試驗結(jié)果，并將染色細(xì)胞計數(shù)，整理記錄結(jié)果。參見圖1 圖5。圖1 圖5表明Biotin-P22多肽能與CEF結(jié)合，并且P22多肽主要結(jié)合到CEF的細(xì)胞膜上，結(jié)合效率隨P22濃度的增加而提高，而BSA不能結(jié)合CEF。圖中箭頭所指為染色細(xì)胞。實施例3流式細(xì)胞術(shù)分析多肽結(jié)合試驗和病毒阻斷試驗
用CEF分別同時進(jìn)行以下試驗。試驗分為三組，試驗A組P22- moIgG結(jié)合CEF試驗； 試驗B組moIgG結(jié)合CEF試驗，作為陰性對照；試驗C組IBDV封閉CEF結(jié)合位點后，然后進(jìn)行P22- moIgG結(jié)合CEF試驗，作為陽性對照。具體試驗步驟如下
(1)按照常規(guī)方法制備CEF將細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24h后，待細(xì)胞長成單層； ⑵預(yù)冷的PBS洗滌3次，用胰酶消化細(xì)胞lOmin，用IOml移液器將細(xì)胞從細(xì)胞瓶中吹下，混勻，減少細(xì)胞大團(tuán)塊，1500r/m離心5min，棄去細(xì)胞上清。(3)加入新的預(yù)冷的PBS，將細(xì)胞重懸，并使細(xì)胞的濃度在IO6個/ml ；
⑷加病毒(僅試驗C需此步驟，試驗A和試驗B不進(jìn)行此步驟)，加入200 μ 1 IBDV (20070630分裝保存，TCID50為10 4. 5)，混勻，0°C結(jié)合Ih ；
(5)1500r/m，4°C離心離心5min，棄上清，加入Iml的洗液(10ml預(yù)冷PBS加0. 5ml胎牛血清與200 μ 1 10%NaN3)，用預(yù)冷洗液洗滌細(xì)胞，1500r/m，4°C離心5min，沉淀細(xì)胞，棄去上清；
(6)在試驗A組中加入P22-moIgG50 μ 1，試驗B組中加入moIgG 200μ1，與CEF 0°C結(jié)合 30min ；
(7)1500r/m，4°C離心5min，將未結(jié)合的P22-moIgG和moIgG移除，棄去上清，加入Iml 的洗液，洗滌吹勻細(xì)胞，1500r/m，4°C離心5min，沉淀細(xì)胞，棄去上清；
(8)加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，l:10稀釋后，分別向試驗A、B和C組中加入 100 μ 1 ,0°C 結(jié)合 30min ；
(9)1500r/m，4°C離心5min，將未結(jié)合的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG移除，棄去上清，加入Iml洗液，洗滌吹勻細(xì)胞，1500r/m，4°C離心5min，沉淀細(xì)胞，棄去上清；
(10)用0.5ml預(yù)冷的PBS將CEF重新懸浮，混勻，400目尼龍網(wǎng)過濾，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)合情況，每組試驗樣品計數(shù)10000個細(xì)胞。參見圖6 圖13。圖6和圖7表明P22-moIgG結(jié)合CEF的陽性細(xì)胞數(shù)為63. 7%，平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity, Μ. F. I)為 113. 89。圖 10 和圖 11 表明moIgG 結(jié)合 CEF 的陽性細(xì)胞數(shù)為11. 5%，平均熒光強(qiáng)度為35. 75。圖6與圖7、圖10與圖11共同說明P22-moIgG 多肽能夠結(jié)合CEF，而試驗中設(shè)置的陰性對照moIgG則不能與CEF結(jié)合。圖8和圖9為IBDV阻斷P22_moIgG結(jié)合CEF試驗，結(jié)果顯示經(jīng)IBDV阻斷后 P22-moIgG結(jié)合CEF的陽性細(xì)胞數(shù)為37. 2%，平均熒光強(qiáng)度為87. 23，與P22-moIgG直接結(jié)合CEF相比，陽性細(xì)胞數(shù)下降了沈.5%，平均熒光強(qiáng)度下降了沈.66。說明IBDV能阻斷 P22-moIgG結(jié)合CEF，P22多肽為IBDV VP2的配體結(jié)合表位。圖12和圖13是同時利用流式細(xì)胞術(shù)將實施例3中的三個樣品疊加分析，進(jìn)一步表明P22與CEF的有效結(jié)合，并且IBDV成功阻斷P22-moIgG結(jié)合CEF。其中，圖6 圖13中的A是陰性對照，P22 IBDV單抗上清與細(xì)胞作用后，加入 FITC-Iabeled goat anti-moIgG. ；B 是 P22_moIgG 與 CEF 作用后，加入 FITC 標(biāo)記的羊抗體；C是IBDV先與細(xì)胞作用，然后加入P22-moIgG，最后加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG.
實施例4細(xì)胞免疫化學(xué)染色方法鑒定多肽P22抑制IBDV感染CEF試驗 (1)制備CEF，37°C培養(yǎng)24h后，待到細(xì)胞鋪滿96孔細(xì)胞培養(yǎng)板； ⑵加多肽傾去細(xì)胞上清，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞一次，在培養(yǎng)板上依次加入濃度從 0. 00625mmol/L、0. 0125mmol/L、0. 025mmol/L、0. 05mmol/L 0. lmmol/L、至 0. 2mmol/L 的 P22 多肽和BSA，100 μ 1/孔，每一個稀釋濃度做3個重復(fù)孔，稀釋液為10%DMEM，其中BSA作為無關(guān)多肽，4°C作用Ih;
(3)加病毒傾去含有多肽的上清，在每孔中加入10TCID50雞傳染性法氏囊病毒感染細(xì)胞，其中一組不加病毒，只加完全培養(yǎng)基作為陰性對照組，4°C作用Ih ；
(4)用新鮮10%DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，加新培養(yǎng)基于感染的細(xì)胞孔中，100 μ 1/ 孔，在5%ω2培養(yǎng)箱中、37°C培養(yǎng)48h。(5)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，同時進(jìn)行細(xì)胞免疫組化學(xué)染色，統(tǒng)計感染細(xì)胞數(shù)量，具體步驟如下
①固定，加入含0.3%H2O2的甲醇溶液50 μ 1/孔，4°C固定lOmin，傾去上清，PBST洗滌3次；
②封閉，加入5%血清PBST100 μ 1/孔，37°C封閉Ih;傾去上清，PBST洗滌3次；
③加Avidin-HRP，加入辣根過氧化酶標(biāo)記抗生物素蛋白50μ 1/孔，1:500稀釋，稀釋液為5%血清PBST，37°C作用Ih ；傾去上清，PBST洗滌3次；
④AEC顯色，按照試劑盒說明，依次將試劑盒中的A溶液、B溶液和C溶液各取一滴于 Iml雙蒸水中，充分混勻防止結(jié)晶出現(xiàn)，加以上溶液于96孔細(xì)胞板上，50 μ 1/孔，室溫作用 IOmin,顯微鏡下觀察試驗結(jié)果，并將染色細(xì)胞計數(shù)整理、記錄結(jié)果。參見表1、圖14 圖22。圖14表明，Ρ22多肽在0. 2mmol/L時可以完全抑制IBDV病毒感染CEF，培養(yǎng)板上 CEF全部不感染。圖15 圖19說明隨著P22多肽濃度的降低，CEF的感染數(shù)量呈增多趨勢，當(dāng)多肽的濃度降低到一定范圍的時候，對抑制病毒感染細(xì)胞基本不起作用。圖20作為陽性對照，只加10TCID50的IBDV的CEF全部感染；圖21作為無關(guān)多肽對照，BSA在任何濃度都不能抑制IBDV感染CEF，細(xì)胞未染色；圖22為抑制試驗中細(xì)胞的感染情況作為陰性對照，正常CEF未染色。圖中箭頭所指顏色較深細(xì)胞為染色細(xì)胞。圖14 圖22共同表明IBDV VP2蛋白配體結(jié)合表位多肽P22具有抑制IBDV感染CEF的功能，且P22多肽在抑制病毒感染中具有劑量依賴性，P22濃度為0. 2 mmol/L時可以完全抑制病毒對細(xì)胞的感染。 表1 不同濃度P22抑制IBDV感染CEF
權(quán)利要求
1.雞傳染性法氏囊病病毒IBDVVP2蛋白配體的結(jié)合表位多肽，其特征是所述結(jié)合表位多月太的氛基酸序歹0為 lqsngnykfdqmlgtaqnlpasynycrlvsrsltvrsstIpggο
2.權(quán)利要求1所述的結(jié)合表位多肽位于VP2三維結(jié)構(gòu)S區(qū)域的D-E環(huán)。
3.權(quán)利要求1所述的結(jié)合表位多肽為線性配體結(jié)合表位。
4.權(quán)利要求1所述的結(jié)合表位多肽，其特征是所述多肽能夠抑制IBDV感染雞胚成纖維細(xì)胞CEF的多肽濃度為0. 00625 0. 2mmol/L。
5.權(quán)利要求4所述的結(jié)合表位多肽，其特征是所述多肽能夠完全抑制IBDV感染CEF 時的多肽濃度為0. 2mmol/L。
6.利用權(quán)利要求1所述的結(jié)合表位多肽鑒定該多肽與CEF結(jié)合效率的方法，其特征是 該方法包括以下步驟⑴制備CEF，37°C培養(yǎng)Mh，直至細(xì)胞鋪滿96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；⑵加多肽，傾去上清液，將培養(yǎng)好的單層細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌3次，在培養(yǎng)板上依次加入濃度為 0. 2mmol/L、0. Immol/L、0. 05mmol/L、0. 025mmol/L 的用 Biotin 標(biāo)記的多月太 Biotin-P22,100 μ 1/孔，每個濃度重復(fù)做3次，在4°C結(jié)合lh，使細(xì)胞與Biotin-P22多肽充分結(jié)合，設(shè)6孔不加Biotin標(biāo)記的多肽P22的正常細(xì)胞做對照實驗，設(shè)6孔加Biotin-BSA 的細(xì)胞做無關(guān)多肽對照實驗；(3)用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，洗去未結(jié)合的多肽，中止多肽結(jié)合試驗；(4)固定，加入含0.3%H2A的甲醇溶液，50μ 1/孔，4°C固定lOmin，傾去上清液，用 PBST洗滌3次；(5)封閉，加入含5%血清的PBST緩沖液，100μ 1/孔，37°C封閉Ih ；傾去上清液，用 PBST洗滌3次；(6)加Avidin-HRP，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的抗生物素蛋白，50μ 1/孔，1:500稀釋，稀釋液為含5%血清的PBST緩沖液，37°C作用Ih ；傾去上清液，用PBST洗滌3次；(7)用AEC顯色試劑盒顯色，根據(jù)試劑盒的說明進(jìn)行操作，在顯微鏡下觀察試驗結(jié)果， 并記錄染色細(xì)胞數(shù)目。
7.利用權(quán)利要求1所述的結(jié)合表位多肽鑒定該多肽抑制IBDV感染CEF靶細(xì)胞的方法， 其特征是該方法包括以下步驟⑴制備CEF，37°C培養(yǎng)Mh，直至細(xì)胞鋪滿96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；⑵加多肽，傾去細(xì)胞上清液，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞一次，在培養(yǎng)板上依次加入濃度為 0. 00625mmol/L、0. 0125mmol/L、0. 025mmol/L、0. 05mmol/L 0. Immol/L、0. 2mmol/L 的 P22 多肽和BSA，100 μ 1/孔，每個濃度重復(fù)做3次，稀釋液為10%的DMEM，其中BSA作為無關(guān)多肽， 4°C作用Ih ；(3)加病毒傾去含有多肽的上清液，每孔加入10倍TCID50量的IBDV感染細(xì)胞，其中一組不加病毒只加完全培養(yǎng)基作為陰性對照，4°C作用Ih ；(4)用新鮮10%的DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，加新培養(yǎng)基于感染的細(xì)胞孔中，ΙΟΟμ1/ 孔，在含5%ω2的培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)48h ；(5)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，同時進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)染色，統(tǒng)計感染細(xì)胞數(shù)量。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其特征是所述細(xì)胞免疫化學(xué)染色步驟為①固定，加入含0.3% H2A的甲醇溶液，50μ 1/孔，4°C固定lOmin，傾去上清液，用PBST洗滌3次；②封閉，加入5%血清PBST，100y1/孔，37°C封閉Ih ；傾去上清液，用PBST洗滌3次；③加Avidin-HRP，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的抗生物素蛋白，50μ 1/孔，1:500稀釋，稀釋液為含5%血清的PBST緩沖液，37°C作用Ih ；傾去上清液，用PBST洗滌3次；④用AEC顯色試劑盒顯色，根據(jù)試劑盒的說明操作，在顯微鏡下觀察試驗結(jié)果，并記錄染色細(xì)胞數(shù)目。
9.權(quán)利要求1所述的結(jié)合表位多肽在抑制IBDV感染CEF中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及法氏囊病毒的線性配體表位及具體應(yīng)用，合成了IBDVVP2蛋白上的多肽P22，并以CEF為靶細(xì)胞，通過IBDV的感染、收獲，測定了IBDV的毒力、半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量和感染比，進(jìn)行合成多肽與靶細(xì)胞的結(jié)合試驗、病毒阻斷試驗和多肽阻斷IBDV感染靶細(xì)胞的試驗，篩選的特異性結(jié)合靶細(xì)胞能夠抑制病毒感染配體表位多肽，并對IBDV的配體表位進(jìn)行了精確定位。本發(fā)明的多肽P22能夠抑制IBDV感染CEF，并隨多肽濃度增加，CEF的感染率降低，具有劑量依賴性，當(dāng)多肽濃度為0.2mmol/L時能夠完全抑制IBDV感染CEF靶細(xì)胞。本發(fā)明為進(jìn)一步從病毒配體和病毒受體相互作用方面進(jìn)行病毒配體表位的研究提供了理論依據(jù)。
文檔編號A61P31/14GK102268077SQ20111011265
公開日2011年12月7日 申請日期2011年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月3日
發(fā)明者孫國鵬, 寧紅梅, 岳鋒, 張艷芳, 朱彥彩, 朱艷平, 李鵬, 王選年, 賈文科, 銀梅 申請人:新鄉(xiāng)學(xué)院