專利名稱：超氧化物歧化酶組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種超氧化物歧化酶(SOD)組合物及其制備方法，以及一種從動(dòng)物血液，尤其是牛血中提取超氧化物歧化酶并對(duì)其進(jìn)行聚乙二醇修飾的方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶是一種廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中，具有催化超氧陰離子歧化反應(yīng)的金屬酶，分別含有Cu、Zn、Mn、Fe、Co等金屬元素，具有抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、增強(qiáng)人體免疫力的功能，被譽(yù)為人體內(nèi)的垃圾清道夫。臨床上主要用于延緩人體衰老、防治色素沉積、消除局部炎癥。特別用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎及放射治療后出現(xiàn)的炎癥。超氧化物歧化酶因其無(wú)抗原性，毒副作用較小，所以被認(rèn)為是很有臨床價(jià)值的治療酶。不僅如此，近年來(lái)，超氧化物歧化酶還成為日用化工產(chǎn)品和保健食品行業(yè)的重要添加劑。
超氧化物歧化酶的制備方法隨原料而異。目前國(guó)內(nèi)外制備超氧化物歧化酶的原料有動(dòng)物血液、微生物和動(dòng)植物組織。由于超氧化物歧化酶的生物半衰期短，且具有異體蛋白免疫原性和患者不易吸收利用等缺點(diǎn)，因此其臨床應(yīng)用受到了限制。通過(guò)使用聚乙二醇對(duì)天然超氧化物歧化酶進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)修飾，降低、甚至消除了天然超氧化物歧化酶免疫原性，生物半衰期由此得以延長(zhǎng)。
迄今為止，動(dòng)物血液是提取制備超氧化物歧化酶的主要原料。從動(dòng)物血液中制備超氧化物歧化酶的方法已有報(bào)導(dǎo)，其基本工藝流程為對(duì)于動(dòng)物血液進(jìn)行預(yù)處理，洗滌紅細(xì)胞和溶血；用有機(jī)溶劑去除大部分雜蛋白得超氧化物歧化酶粗制品；再經(jīng)柱層析分離得到成品。但是這些方法普遍存在處理量小、純化效率低、周期長(zhǎng)等缺陷。本發(fā)明所述制備超氧化物歧化酶的方法，克服了上述缺陷，而且適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
含有超氧化物歧化酶作為活性成分的組合物也有少量報(bào)導(dǎo)，但研制新的、用途更為廣泛和更為有效的超氧化物歧化酶組合物一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員努力的目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人在進(jìn)行多次篩選和大量實(shí)驗(yàn)后驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將過(guò)氧化物歧化酶、維生素C(VC)、維生素E(VE)、蜂膠按照以下特定比例制成本發(fā)明組合物時(shí)，其各有效成分能在人體內(nèi)靶向定位，清除過(guò)剩自由基，免除細(xì)胞損傷，從而阻斷疾病的發(fā)生與發(fā)展，保護(hù)生命大分子(基因)，延緩衰老，而且沒(méi)有副作用，且可改善患者因長(zhǎng)期依賴藥物的累積性毒副作用并降低用藥量與標(biāo)準(zhǔn)，大幅度提高生命質(zhì)量。
此外，本發(fā)明所述組合物中各有效成分具有協(xié)同作用，其對(duì)于人體內(nèi)過(guò)剩自由基的清除作用明顯優(yōu)于各組分單獨(dú)使用時(shí)作用之和。同時(shí)可以有效地清除血管壁膽固醇的沉積，恢復(fù)和提高高血脂患者的血清高密度脂蛋白，有效降低血液粘度，防止和延緩動(dòng)脈硬化、狹窄和堵塞，使蜂膠和螺旋藻中的營(yíng)養(yǎng)成分更易于被人體吸收和儲(chǔ)存。
本發(fā)明的超氧化物歧化酶組合物含有超氧化物歧化酶、維生素C(VC)、維生素E(VE)、蜂膠。此外，本發(fā)明組合物還可以含有螺旋藻。
其中，每百克本發(fā)明組合物中含有600,000-1,200,000U的超氧化物歧化酶，組合物中維生素C、維生素E和蜂膠的重量比為5.2-7.3∶4.1-5.2∶4.1-5.0。優(yōu)選的本發(fā)明組合物含有75,000-96,000U的超氧化物歧化酶，維生素C、維生素E和蜂膠的優(yōu)選重量比為5.9-6.4∶4.3-4.5∶4.4-4.7。
當(dāng)本發(fā)明組合物中含有螺旋藻時(shí)，維生素C、維生素E、蜂膠與螺旋藻的重量比為5.2-7.3∶4.1-5.2∶4.1-5.0∶3.5-5.1，優(yōu)選5.9-6.4∶4.3-4.5∶4.4-4.7∶3.8-4.4。
本發(fā)明的超氧化物歧化酶組合物可以按照以下方法制備1.過(guò)篩與滅菌取蜂膠過(guò)篩并滅菌；2.稱量按比例稱取超氧化物歧化酶、維生素C、維生素E、滅菌后的蜂膠和螺旋藻(在使用螺旋藻時(shí))；3.原料混合與包裝將稱量好的上述原料按照維生素E、超氧化物歧化酶、蜂膠、維生素C、螺旋藻(在使用螺旋藻時(shí))的添加順序在三維混料機(jī)中進(jìn)行充分混合，然后按需要進(jìn)行包裝。
本發(fā)明的超氧化物歧化酶組合物的服用量為每公斤體重0.02g，每日2次。
另外，本發(fā)明提供了一種從動(dòng)物血液，尤其是牛的血液中提取超氧化物歧化酶的方法，其具體步驟為1.制備抗凝血向新鮮的動(dòng)物血液，優(yōu)選牛的血液中加入抗凝劑檸檬酸三鈉溶液；2.分離洗滌紅細(xì)胞將抗凝血在常溫下離心4-6分鐘，優(yōu)選5分鐘，去除上層黃色液體，收集下層的紅細(xì)胞，生理鹽水洗滌兩次；3.溶血，破碎將步驟2所得紅細(xì)胞中加入適量去離子水，劇烈攪拌使所述紅細(xì)胞溶血破碎；4.去除血紅蛋白加入相當(dāng)于步驟3所得溶血溶液0.2-0.3倍，優(yōu)選0.25倍量的乙醇和0.05-0.15倍，優(yōu)選0.1倍量的氯仿，攪拌使得血紅蛋白反應(yīng)沉淀，離心除去血紅蛋白沉淀；5.超氧化物歧化酶粗產(chǎn)物的制備將步驟4制得的乙醇-氯仿上清液中加入1-3倍，優(yōu)選2倍量的丙酮，高速離心收集沉淀物；6.熱變將步驟5中所得的沉淀物準(zhǔn)確稱量，按超氧化物歧化酶磷酸鉀緩沖液1∶10-14，優(yōu)選1∶12的重量比加入磷酸鉀緩沖液(所述磷酸鉀緩沖液按1000ml去離子水加入5.9g磷酸氫二鉀和2.2g磷酸二氫鉀配制而成)，加熱該溶液使其溫度快速升至55-62℃，優(yōu)選60℃，然后再快速使其溫度降至15℃以下，高速離心收集上清液后加入1.5-2.5倍，優(yōu)選2倍量的丙酮，高速離心收集沉淀物；7.去除雜蛋白準(zhǔn)確稱量步驟6制得的沉淀并向其中加入4-6倍，優(yōu)選5倍量的所述磷酸鉀緩沖液，攪拌至其徹底溶解。高速離心收集上清液，加入1.5-2.5倍，優(yōu)選2倍量的丙酮，高速離心收集下層沉淀；8.除鹽、濃縮向步驟7所得沉淀物中加入去離子水，攪拌至徹底溶解，離心收集上清液，加入該上清液1.5-2.5倍量的丙酮，離心收集下層沉淀，所述沉淀與去離子水的比例優(yōu)選1∶1；9.將步驟8所得沉淀加入去離子水，混合后真空冷凍干燥。
根據(jù)本發(fā)明的上述方法所制得的超氧化物歧化酶的比活為3600-9000u/mg本發(fā)明還提供了一種使用聚乙二醇(PEG)對(duì)超氧化物歧化酶進(jìn)行修飾的方法，該方法包括以下步驟1.聚乙二醇的活化(1)向二氧六環(huán)中依次和混和加入聚乙二醇、丁二酸鉀；所得溶液水浴中充分加熱攪拌，然后冰浴冷卻攪拌該溶液；
(2)向所得溶液中加入乙醚，離心后去除乙醚；(3)向去除乙醚后的殘余物中二氯甲烷，攪拌溶解后離心分離出上清液；(4)向所得上清液中加入無(wú)水乙醚，離心分離收集沉淀；(5)將所得沉淀凍干后，加入二甲基甲酰胺和羥基琥珀酰亞胺，攪拌過(guò)夜；(6)加入無(wú)水乙醚，離心分離出沉淀，將該沉淀凍干。
2.將步驟1所得凍干后的沉淀和超氧化物歧化酶按比例于雙蒸水中充分混合，低溫過(guò)夜后，真空冷凍干燥。
其中，優(yōu)選在下述條件下進(jìn)行過(guò)氧化物歧化酶的聚乙二醇修飾1.聚乙二醇的活化(1)將聚乙二醇、丁二酸鉀加至二氧六環(huán)中，所述各物質(zhì)的比例為二氧六環(huán)∶聚乙二醇∶丁二酸鉀1000∶400-800∶10-50(ml∶g∶g)。所得溶液放入90℃水浴鍋中攪拌1小時(shí)，然后冰浴冷卻攪拌；(2)按前述二氧六環(huán)4-6倍量加入乙醚，離心10分鐘后去除乙醚；(3)向去除乙醚后的殘余物中按前述二氧六環(huán)1-2倍量加入二氯甲烷，攪拌溶解后離心分離15分鐘，分離出上清液；(4)按前述二氧六環(huán)4-6倍量向所得上清液中加入無(wú)水乙醚，離心分離15分鐘，離心分離收集沉淀；(5)將所得沉淀凍干后，按前述二氧六環(huán)1-3倍量加入二甲基甲酰胺，同時(shí)按每100ml二甲基甲酰胺加入0.050-0.075g羥基琥珀酰亞胺的比例加入羥基琥珀酰亞胺攪拌過(guò)夜；(6)按二氧六環(huán)4-6倍量的比例加入無(wú)水乙醚，離心15分鐘分離出沉淀，將該沉淀凍干。
2.將步驟1所得凍干后的沉淀和超氧化物歧化酶按1∶1.5-2.5，優(yōu)選1∶2重量比充分混合于二氧六環(huán)4-6倍量的雙蒸水中，低溫過(guò)夜后，真空冷凍干燥，所得產(chǎn)品即為聚乙二醇修飾的超氧化物歧化酶。
通過(guò)上述方法得到的聚乙二醇修飾的超氧化物歧化酶，其免疫原性被降低，甚至被消除，其生物半衰期因此得以延長(zhǎng)。
本發(fā)明所制得的經(jīng)聚乙二醇修飾的超氧化物歧化酶，其比活為3600u/mg-9,000u/mg，且在體內(nèi)可以存活7個(gè)小時(shí)以上。
除非另有說(shuō)明，本發(fā)明所使用的比例均為體積比。
具體實(shí)施例方式
參考下列實(shí)施例將更易于理解本發(fā)明，但給出下述實(shí)施例是為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1超氧化物歧化酶的制備將4％的檸檬酸三鈉1000ml加至7000ml的新鮮牛血中，制備成抗凝血。
將上述抗凝血在常溫下離心5分鐘，去除上層黃色液體，收集下層的紅細(xì)胞。用生理鹽水洗滌兩次，收集洗滌后的紅細(xì)胞。向紅細(xì)胞中加入等量去離子水，劇烈攪拌使紅細(xì)胞溶血破碎。之后，加入相當(dāng)于溶血溶液0.25倍量的乙醇和0.1倍的氯仿，攪拌使血紅蛋白反應(yīng)沉淀，離心除去沉淀。
向上述制得的乙醇-氯仿上清液中加入2倍量的丙酮，高速離心收集超氧化物歧化酶粗產(chǎn)物沉淀。將所得超氧化物歧化酶準(zhǔn)確稱量，按1∶12的比例加入磷酸鉀緩沖液。所得溶液放入95℃-100℃的水浴鍋中加熱，使該溶液溫度快速升至60℃，然后再放入冰水浴中使其溫度快速降至15℃以下。通過(guò)高速離心收集上清液后加入2倍量的丙酮，再高速離心收集沉淀物。
準(zhǔn)確稱量沉淀并加入5倍量的磷酸鉀緩沖液，攪拌至其徹底溶解。高速離心收集上清液，加入相當(dāng)于上清液量2倍量的丙酮，高速離心收集下層沉淀。
將制得的SOD加入去離子水中，攪拌至徹底溶解，高速離心收集上清液。
向所得上清液中加入2倍量的丙酮，離心收集沉淀。然后按1∶1的比例向該沉淀加入去離子水，混合后進(jìn)行真空冷凍干燥。從而得到高純度的超氧化物歧化酶。
實(shí)施例2超氧化物歧化酶的聚乙二醇(PEG)修飾將120g聚乙二醇加至200ml二氧六環(huán)中，然后向其中加入6g丁二酸鉀。所得溶液放入90℃水浴鍋中攪拌1小時(shí)，然后冰浴冷卻攪拌。向其中加入1,000ml乙醚，離心10分鐘后去除乙醚。
向去除乙醚后的殘余物中加入300ml二氯甲烷，攪拌溶解后離心分離15分鐘，取上清液加入1,000ml無(wú)水乙醚，離心分離15分鐘，將所得沉淀放入凍干機(jī)里凍干后，加入400ml二甲基甲酰胺和0.25g羥基琥珀酰亞胺攪拌過(guò)夜。
向上述攪拌過(guò)夜物質(zhì)中加入1,000ml的無(wú)水乙醚，離心15分鐘分離出沉淀，將該沉淀放入凍干機(jī)里凍干。
將所得凍干后物質(zhì)和實(shí)施例1中所得超氧化物歧化酶75g在1,000ml的雙蒸水中充分混合，低溫過(guò)夜后，將其真空冷凍干燥，得到經(jīng)聚乙二醇修飾的超氧化物歧化酶。
經(jīng)檢測(cè)，制得的經(jīng)聚乙二醇修飾的超氧化物歧化酶的比活為7500u/mg。
實(shí)施例3超氧化物歧化酶組合物及其制備取蜂膠過(guò)80目篩，然后對(duì)蜂膠進(jìn)行滅菌。取實(shí)施例2所制得的超氧化物歧化酶360mg，并按0.023∶6.0∶4.4∶4.5∶4.0的比例稱取總重300g的超氧化物歧化酶、維生素C、維生素E、滅菌后的蜂膠和螺旋藻。
然后，按照維生素E、超氧化物歧化酶、蜂膠、維生素C、螺旋藻的加料順序依次將各原料加至三維混料機(jī)中進(jìn)行充分混合，然后包裝為腸溶性緩釋膠囊1,000粒。其中，每粒膠囊中含2,700U超氧化物歧化酶，以及維生素C120mg、維生素E90mg、蜂膠90mg。每百克產(chǎn)品含900,000U超氧化物歧化酶。
果蠅壽命實(shí)驗(yàn)使用上海鐵道大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供的美國(guó)野生型黑腹果蠅(OrigenK)，設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組和4個(gè)劑量組，各劑量組飼料含實(shí)施例3組合物濃度分別為0％、0.013％、0.040％、0.120％、0.360％。
配制果蠅基礎(chǔ)飼料，其組分為玉米粉8.5％、紅糖6.5％、瓊脂0.75％、丙酸0.5％、干酵母粉0.75％、水83％，pH7。
將所述果蠅的卵、幼蟲(chóng)、蛹及成蟲(chóng)均培養(yǎng)在25±1(℃)，相對(duì)濕度40-70(％)的生化培養(yǎng)箱中。將果蠅基礎(chǔ)飼料煮成粥后，分裝于無(wú)菌培養(yǎng)試管中。每支培養(yǎng)管用無(wú)菌海綿塞封口。成蟲(chóng)基礎(chǔ)飼料每4天更換一次。將培養(yǎng)管平放在培養(yǎng)箱內(nèi)。收集6小時(shí)內(nèi)孵出的成蟲(chóng)進(jìn)行分組。在此時(shí)間范圍內(nèi)孵化的果蠅均未交配。
用乙醚麻醉后稱重分組。選擇個(gè)體大小相近的果蠅，每管20只，雌雄分養(yǎng)。每組雌雄果蠅各200只。在成蟲(chóng)期給本發(fā)明實(shí)施例3組合物，所述組合物摻入到預(yù)先溶化的50℃基礎(chǔ)飼料中，并保持各組pH值一致。每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)果蠅存活數(shù)和死亡數(shù)。直至全部死亡。每組最后死亡的20只果蠅存活天數(shù)的平均數(shù)為該組的最高壽命。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束，計(jì)算實(shí)驗(yàn)果蠅平均壽命和最高壽命及半數(shù)死亡時(shí)間。實(shí)施例3組合物對(duì)果蠅半數(shù)死亡時(shí)間的影響、對(duì)果蠅壽命的影響等結(jié)果如表1、2。
表1飼料中實(shí)施例3性別樣本數(shù) 半數(shù)死亡時(shí)間(天)組合物濃度(％)♀ 200 610♂ 200 58♀ 200 640.013♂ 200 63♀ 200 640.040♂ 200 61♀ 200 600.120♂ 200 62♀ 200 600.360♂ 200 61
表2(x±SD)飼料中實(shí)施例3組 平均壽命性別樣本數(shù) P值 最高壽命 P值合物濃度 (d)(％)♀ 200 58.7±13.3 - 76.5±2.7 -0♂ 200 54.9±12.4 - 73.9±3.9 -♀ 200 59.6±13.6 0.5183 78.6±3.5*0.04190.013♂ 200 58.7±12.1**0.0016 76.2±2.6*0.0360♀ 200 60.8±14.0 0.1316 80.1±2.7***0.00010.040♂ 200 56.4±13.9 0.2543 77.7±3.1**0.0015♀ 200 56.9±13.8 0.1833 77.6±3.1 0.21620.120♂ 200 58.2±12.7**0.0082 77.7±1.9***0.0004♀ 200 57.7±14.1 0.4505 76.1±3.1 0.66820.360♂ 200 56.1±12.3 0.3030 74.4±3.5 0.6744*與空白對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.05)**與空白對(duì)照組比較有非常顯著差異(p＜0.01)***與空白對(duì)照組比較有極顯著差異(p＜0.001)表1、2結(jié)果表明，與空白對(duì)照組(含本發(fā)明實(shí)施例3組合物0％的果蠅飼料喂養(yǎng))相比較含本發(fā)明實(shí)施例3組合物濃度為0.013％的果蠅飼料喂養(yǎng)的雌性果蠅平均壽命無(wú)顯著差異(p＞0.05)，最高壽命延長(zhǎng)3％(p＜0.05)，半數(shù)死亡時(shí)間延長(zhǎng)3天；雄性果蠅平均壽命延長(zhǎng)7％(p＜0.01)；最高壽命延長(zhǎng)3％(p＜0.05)，半數(shù)死亡時(shí)間延長(zhǎng)5天。
含本發(fā)明實(shí)施例3組合物濃度為0.040％的果蠅飼料所喂養(yǎng)的雌性果蠅平均壽命無(wú)顯著差異(p＞0.05)，最高壽命延長(zhǎng)5％(p＜0.001)，半數(shù)死亡時(shí)間延長(zhǎng)3天；雄性果蠅平均壽命無(wú)顯著差異(p＞0.05)，最高壽命延長(zhǎng)5％(p＜0.01)，半數(shù)死亡時(shí)間延長(zhǎng)3天。
含本發(fā)明實(shí)施例3組合物濃度為0.120％的果蠅飼料所喂養(yǎng)的雌性果蠅平均壽命、最高壽命均無(wú)顯著差異(p＞0.05)，半數(shù)死亡時(shí)間縮短1天；雄性果蠅平均壽命延長(zhǎng)6％(p＞0.01)，最高壽命延長(zhǎng)5％(p＜0.001)，半數(shù)死亡時(shí)間延長(zhǎng)4天。
含本發(fā)明實(shí)施例3組合物濃度為0.360％的果蠅飼料所喂養(yǎng)的雌性果蠅平均壽命、最高壽命均無(wú)顯著差異(p＞0.05)，半數(shù)死亡時(shí)間縮短1天；雄性果蠅平均壽命、最高壽命均無(wú)顯著差異(p＞0.05)，半數(shù)死亡時(shí)間延長(zhǎng)3天。
試驗(yàn)結(jié)果表明與空白對(duì)照組相比，本發(fā)明組合物在果蠅飼料中含量在0.013％-0.040％之間時(shí)，可以顯著延長(zhǎng)受試果蠅壽命。
抗疲勞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)例實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為二級(jí)昆明種雄性小鼠220只，體重18-22g，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
給予小鼠本發(fā)明實(shí)施例3組合物的劑量分別為低劑量0.04g/kgbw(體重)、中劑量0.2g/kg bw、高劑量0.6g/kg bw，高、中、低劑量分別相當(dāng)于人的推薦每公斤體重日攝入量30倍、10倍和2倍。
稱取本發(fā)明實(shí)施例3組合物適量，用蒸餾水配制高劑量組的樣品溶液，中、低劑量組的樣品溶液則由高劑量組的溶液按比例用蒸餾水稀釋制得。
給各實(shí)驗(yàn)組小鼠連續(xù)經(jīng)口灌胃本品各劑量組的樣品溶液，正常對(duì)照組小鼠給予蒸餾水。
實(shí)驗(yàn)中使用的儀器Fisher M-300 DR電子天平(德國(guó))、TP-1000動(dòng)物天平(湘宜天平儀器廠)、計(jì)時(shí)器、120L游泳桶、鉛皮、實(shí)驗(yàn)方法小鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)2天后，負(fù)重4％體重的鉛皮進(jìn)行游泳篩選實(shí)驗(yàn)，10分鐘后取出存活者。
將游泳篩選后的60只小鼠晾干，稱重并隨機(jī)分成4組，即正常對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)。
給各劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠連續(xù)經(jīng)口灌胃相應(yīng)的樣品溶液28天，每日灌胃一次，小鼠灌胃量0.2ml/10g bw，每周稱體重，以調(diào)整所述組合物濃度。末次灌胃0.5小時(shí)后，在小鼠的尾根部負(fù)重5％體重的鉛皮，置水深30cm，溫度25℃的游泳桶中游泳。記錄小鼠入水至力竭身亡時(shí)的游泳時(shí)間，作為小鼠的游泳時(shí)間。
表3為所述組合物對(duì)小鼠游泳耐力的影響。與正常對(duì)照組比較，各劑量組小鼠的分組時(shí)及游泳前體重?zé)o顯著性差異，p＞0.05。
表3組別 劑量(g/kg.bw) 分組時(shí)體重(g)1，2游泳前體重(g)1，3正常對(duì)照組 -19.2±0.9(15) 40.5±1.6(15)低劑量組 0.04 19.6±1.0(15) 38.3±2.1(15)中劑量組 0.20 19.3±0.6(15) 39.6±2.9(15)高劑量組 0.60 19.2±0.7(15) 38.6±2.8(15)1x±SD，括號(hào)內(nèi)為動(dòng)物數(shù)2方差分析F＝0.98，P＝0.413方差分析F＝2.64，P＝0.058表4組別 劑量(g/kg.bw)動(dòng)物數(shù)(只) 游泳時(shí)間(min)1，2正常對(duì)照組- 15 19.1±19.2低劑量組 0.0415 32.2±34.3)中劑量組 0.2015 38.5±36.6高劑量組 0.6015 57.1±41.2*表4為所述組合物對(duì)小鼠游泳耐力的影響。與正常對(duì)照組比較。高劑量組小鼠的分組的游泳時(shí)間顯著延長(zhǎng)，p＜0.05。
1x±SD2方差分析F＝3.26，P＝0.028*與正常對(duì)照組比較，p＜0.050實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以各劑量的本發(fā)明組合物溶液灌食于受試小鼠，對(duì)于受試小鼠的體重沒(méi)有影響。小鼠的抗疲勞效果與灌食的本發(fā)明組合物劑量成正比，在大劑量灌食的條件下，小鼠的抗疲勞效果明顯提高。
權(quán)利要求
1.一種超氧化物歧化酶組合物，該組合物含有超氧化物歧化酶、維生素C、維生素E和蜂膠，其中每百克組合物中含有600,000-1,200,000U的超氧化物歧化酶，其中，維生素C、維生素E和蜂膠的重量比為5.2-7.3∶4.1-5.2∶4.1-5.0；優(yōu)選每百克該組合物含有75,000-96,000U的超氧化物歧化酶，維生素C、維生素E和蜂膠的重量比為5.9-6.4∶4.3-4.5∶4.4-4.7。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其特征在于該組合物中還含有螺旋藻，其中維生素C、維生素E、蜂膠和螺旋藻的重量比為5.2-7.3∶4.1-5.2∶4.1-5.0∶3.5-5.1；優(yōu)選5.9-6.4∶4.3-4.5∶4.4-4.7∶3.8-4.4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2之一的組合物，其特征在于該組合物制成腸溶緩釋膠囊制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2之一的組合物，其特征在于所使用的超氧化物歧化酶經(jīng)過(guò)聚乙二醇修飾，比活為3600u/mg-9000u/mg。
5.一種超氧化物歧化酶組合物的制備方法，該方法包括以下步驟a.過(guò)篩與滅菌取蜂膠原料過(guò)篩并對(duì)其進(jìn)行滅菌；b.稱量按比例稱取維生素E、超氧化物歧化酶、滅菌后蜂膠、維生素C；c.混合與包裝將稱量好的上述原料進(jìn)行充分混合，然后進(jìn)行包裝。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于步驟b為按比例稱取維生素E、超氧化物歧化酶、滅菌后蜂膠、維生素C和螺旋藻。
7.一種從動(dòng)物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，該方法包括以下步驟a.制備抗凝血向新鮮的動(dòng)物血液，優(yōu)選牛血中加入抗凝劑檸檬酸鈉溶液；b.分離洗滌紅細(xì)胞將抗凝血在常溫下離心4-6分鐘，去除上層黃色液體，收集下層的紅細(xì)胞，生理鹽水洗滌兩次；c.溶血破碎將步驟b所得紅細(xì)胞中加入適量去離子水，劇烈攪拌使所述紅細(xì)胞溶血破碎得溶血溶液；d.去除血紅蛋白加入相當(dāng)于步驟c所得溶血溶液0.2-0.3倍量的乙醇和0.05-0.15倍量的氯仿，攪拌使得血紅蛋白反應(yīng)沉淀，離心除去血紅蛋白沉淀，保留乙醇-氯仿上清液；e.超氧化物歧化酶粗產(chǎn)物的制備將步驟d中制得的乙醇-氯仿上清液中加入其1-3倍量的丙酮，離心收集超氧化物歧化酶粗產(chǎn)物沉淀；f.熱變將所得的超氧化物歧化酶準(zhǔn)確稱量，按超氧化物歧化酶∶磷酸鉀緩沖液1∶10-14的重量比加入磷酸鉀緩沖液，加熱該溶液使其溫度快速升至55-62℃，然后再快速使其溫度降至15℃以下，離心收集上清液后加入該上清液1.5-2.5倍量的丙酮，離心收集沉淀物；g.去除雜蛋白準(zhǔn)確稱量步驟f中制得的沉淀，向其中加入該沉淀4-6倍量的磷酸鉀緩沖液，攪拌至其徹底溶解，離心收集上清液，加入該上清液1.5-2.5倍量的丙酮，離心收集下層沉淀；h.除鹽、濃縮向步驟g所得沉淀中加入去離子水，攪拌至其徹底溶解，離心收集上清液，加入該上清液1.5-2.5倍量的丙酮，離心收集下層沉淀；i.將步驟h中收集的沉淀加入去離子水，混合后真空冷凍干燥。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于所述步驟b中的離心時(shí)間為5分鐘；所述步驟d中乙醇和氯仿的用量分別為所述溶血溶液的0.25倍和0.1倍；所述步驟e中丙酮的用量為所述乙醇-氯仿上清液的2倍；所述步驟f中超氧化物歧化酶與磷酸鉀緩沖液的比例為1∶12，丙酮的用量為所述上清液的2倍，加熱升溫至60℃；所述步驟g中磷酸鉀緩沖液的用量為所述沉淀的5倍，丙酮的用量為所述上清液的2倍；所述步驟i中所述沉淀與去離子水的用量比為1∶1。
9.一種超氧化物歧化酶的修飾方法，包括以下步驟a.聚乙二醇的活化向二氧六環(huán)中依次加入聚乙二醇、丁二酸鉀后混合；所得溶液水浴中充分加熱攪拌，然后冰浴冷卻攪拌該溶液；向所得溶液中加入乙醚，離心后去除乙醚；向去除乙醚后的殘余物中二氯甲烷，攪拌溶解后離心分離出上清液；向所得上清液中加入無(wú)水乙醚，離心分離收集沉淀；將所得沉淀凍干后，加入二甲基甲酰胺和羥基琥珀酰亞胺，攪拌過(guò)夜，加入無(wú)水乙醚，離心分離出沉淀，將該沉淀凍干；b.將步驟a所得凍干后的沉淀和超氧化物歧化酶按比例于雙蒸水中充分混合，低溫過(guò)夜后，真空冷凍干燥。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于所述步驟a中，二氧六環(huán)∶聚乙二醇∶丁二酸鉀的比例為1000∶400-800∶10-50(ml∶g∶g)。水浴溫度90℃，攪拌時(shí)間為1小時(shí)；乙醚加入量為所述二氧六環(huán)用量的4-6倍，離心時(shí)間10分鐘；去除乙醚后的殘余物中二氯甲烷的加入量為所述二氧六環(huán)用量的1-2倍，離心分離時(shí)間15分鐘；所得上清液中無(wú)水乙醚的加入量為所述二氧六環(huán)用量的4-6倍，離心分離時(shí)間15分鐘；將所得沉淀凍干后，二甲基甲酰胺的加入量為所述二氧六環(huán)用量的1-3倍，同時(shí)按每100ml二甲基甲酰胺加入0.050-0.075g羥基琥珀酰亞胺的比例加入羥基琥珀酰亞胺，攪拌過(guò)夜后無(wú)水乙醚的加入量為所述二氧六環(huán)用量的4-6倍，離心時(shí)間15分鐘；所述步驟b中凍干后的沉淀和超氧化物歧化酶的重量比為1∶1.5-2.5，優(yōu)選1∶2，雙蒸水的用量為所述二氧六環(huán)用量的4-6倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種超氧化物歧化酶(SOD)組合物及其制備方法，以及一種從動(dòng)物血液，尤其是牛血中提取超氧化物歧化酶并進(jìn)行聚乙二醇修飾的方法。本發(fā)明的組合物，可有效地清除人體內(nèi)過(guò)多的氧自由基、增強(qiáng)人體的免疫功能、預(yù)防疾病、延緩衰老。本發(fā)明組合物還可以有效地清除血管壁膽固醇的沉積、降低血液粘度、防止和延緩動(dòng)脈硬化、狹窄和堵塞，使該組合物中的維生素C和維生素E更易于被人體吸收和儲(chǔ)存，從而最大限度地滿足人體的需要。
文檔編號(hào)A61K9/52GK1654640SQ200510008719
公開(kāi)日2005年8月17日 申請(qǐng)日期2005年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月24日
發(fā)明者孫龍祥 申請(qǐng)人:孫龍祥