專利名稱：口服真菌多糖硫酸酯前體脂質(zhì)體及其制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一類用于防治血管栓塞、彌漫性血管內(nèi)凝血、病毒感染等疾 病的多糖硫酸酯口服前體脂質(zhì)體制劑，具體涉及將真菌(如茯苓、香菇、云芝、樹舌、豬苓、 裂褶菌等)多糖進行硫酸酯化半人工合成、再以其為活性成分制備前體脂質(zhì)體的方法和用 途。
背景技術(shù)：
脂質(zhì)體(Liposome)具有緩釋、靶向、提高藥物穩(wěn)定性及改善藥物動力 學特性等優(yōu)點，是近20年國內(nèi)外新型給藥系統(tǒng)研究領域的熱點之一。脂質(zhì)體具有類細胞結(jié) 構(gòu)，即由磷脂為膜材及附加劑組成，親水性和疏水性藥物可直接包裹或附著于雙分子層中。 口服脂質(zhì)體由于其極小的粒徑而易于粘附于腸壁上，增加了藥物與腸壁的接觸面積和接觸 時間。脂質(zhì)體還可與胃腸粘膜細胞作用發(fā)生融合、胞飲和吞噬作用，使藥物進人胃腸道粘膜 進而被吸收。脂質(zhì)體進入體內(nèi)后緩慢釋放藥物，降低體內(nèi)消除速率。同時藥物由于脂質(zhì)體 的包裹保護，免于胃腸道酶的降解或減少胃腸道刺激等副作用，從而提高藥物的治療指數(shù)， 減少藥物的治療劑量和降低藥物的毒性。所以口服脂質(zhì)體具有藥物促吸收、藥物緩釋和減 少毒副作用三重功能。但無論如何，脂質(zhì)體混懸液在貯存期間易發(fā)生聚集、融合及藥物滲漏，尤其水溶 性藥物的滲漏更顯著。同時天然磷脂易氧化、水解，難以滿足藥物制劑穩(wěn)定性的要求。 為解決脂質(zhì)體實際應用中存在的問題，1986年，英國學者Payne等提出了前體脂質(zhì)體 (Proliposome)這一概念，系將脂質(zhì)體膜材和藥物的混合溶液在減壓攪拌下逐步分布到一 種可溶性固體載體表面，形成可自由流動的粉體狀制劑。由于尚未形成脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)， 因此稱之為前體脂質(zhì)體，使用前水化即形成脂質(zhì)體混懸液。多糖硫酸酯是多糖衍生物，由多糖鏈單糖分子上的某些羥基被硫酸根取代而形 成。多糖硫酸酯大致可分成兩類，一類是天然的硫酸化多糖，如動物糖胺聚糖、褐藻多糖硫 酸酯、卡拉膠等。此類藥物需通過分離、純化獲得，來源有限，提純工藝復雜，價格昂貴，產(chǎn)品 質(zhì)量不易控制。另一類是人工半合成產(chǎn)物，通過簡單分離獲得豐富的天然多糖，經(jīng)硫酸酯化 結(jié)構(gòu)修飾獲得多糖硫酸酯，制備工藝簡單，產(chǎn)物成本低，易通過控制反應條件按目標產(chǎn)物的 結(jié)構(gòu)進行化學合成。我國是食用菌、藥用菌生產(chǎn)大國，年產(chǎn)量1000多萬噸，占世界總產(chǎn)量的 60%以上。以茯苓為例，茯苓國內(nèi)年產(chǎn)量高達1萬多噸。茯苓多糖含量占干菌核的90%以 上，提取、純化相對容易，開發(fā)成本低。開發(fā)利用真菌多糖這一廉價的雄厚資源具有巨大的 工業(yè)價值。多糖硫酸酯藥學活性十分廣泛，具有抗凝血、抗血栓形成、抗病毒(HIV、單純皰疹 病毒、巨細胞病毒、流感病毒等)、降血脂和抗腫瘤等活性，尤其是其抗艾滋病的功能已引起 國內(nèi)外許多研究者的極大興趣，且硫酸根取代度越高，抗病毒活性越強。1987年原聯(lián)邦德國 的Beyer與Hoechst公司合作，人工合成硫酸化木聚糖用于艾滋病的治療。硫酸化右旋糖 酐鈉鹽(Dextran sulfate sodium)已是臨床治療Ila及l(fā)ib型高血脂癥和保護血管內(nèi)皮 的藥物。眾多研究表明真菌(如茯苓、香菇、云芝、靈芝、豬苓等)來源多糖多為帶少量1， 6分支的3-1，3葡聚糖。申請人所在實驗室一直從事多糖的硫酸酯化人工半合成及藥效學實驗研究。目前，已通過中試確定茯苓多糖硫酸酯生產(chǎn)的最佳工藝路線和質(zhì)量分析監(jiān)控體 系，產(chǎn)品產(chǎn)量、性質(zhì)穩(wěn)定，成本較低；藥效學實驗揭示本茯苓多糖硫酸酯屬于低毒或無毒物 質(zhì)，具有抗凝血、抗血栓和抗腎衰作用(參見中國專利200410013931. 1,200410064766. 2, 生物學雜志，2004，21(1) :36、中國藥學雜志，2005，40 (12) :908)。但是，不論是天然硫酸化多糖還是人工半合成多糖硫酸酯，由于分子量大，含有大 量硫酸基、羧基陰離子基團而呈強極性，口服吸收比較困難。如肝素廣泛用于血栓栓塞性 疾病、彌漫性血管內(nèi)凝血等疾病的治療，給藥方式基本為靜脈注射和皮下注射，并需要住院 觀察。為了方便多糖硫酸酯類藥物給藥，減輕病人和醫(yī)院的住院負擔，開發(fā)緩釋(降低粘膜 出血的副作用)、高效的口服制劑迫在眉睫。采用脂質(zhì)體制劑技術(shù)，將這類藥物和易被胃腸 道吸收的物質(zhì)有機結(jié)合，可以實現(xiàn)該類藥物口服吸收。脂質(zhì)體成膜材料卵磷脂原本是一種具有降血脂、抗動脈硬化、抗血栓等多種保健 功能的天然物質(zhì)，因帶有膽堿基團而帶正電荷，易與多糖硫酸酯發(fā)生靜電吸引而結(jié)合，所 以多糖硫酸酯即使不被脂質(zhì)體包封，也可能結(jié)合在脂質(zhì)體表面而增加其脂溶性從而易被吸 收。近年來，我國人口老齡化程度日益加劇，血栓性疾病的發(fā)生率不斷上升，抗血栓藥物市 場迅速擴容。根據(jù)中國數(shù)字醫(yī)藥網(wǎng)的檢測數(shù)據(jù)，2006年，全國使用抗血栓藥物總金額在22 億元左右，年增長率為15% -20%。而肝素類產(chǎn)品是目前主要的抗血栓產(chǎn)品，市場份額占抗 血栓藥物的50%以上。因此開發(fā)多糖硫酸酯類藥物新劑型，方便病人使用，降低用藥成本， 提高療效，減輕副作用，必將有廣闊的市場前景。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是解決硫酸化多糖的口服不吸收問題，開發(fā)緩釋、高效的口 服制劑，降低這類藥物注射給藥的粘膜出血副作用，方便用藥，減輕病人和醫(yī)院的住院負 擔。以真菌多糖硫酸酯取代肝素作為脂質(zhì)體的活性成分，有益于降低藥物成本。人工 半合成真菌多糖硫酸酯及前體脂質(zhì)體制備的生產(chǎn)工藝簡單，工藝條件溫和，對設備無特殊 要求，生產(chǎn)過程無固體廢料，溶劑可回收套用。真菌多糖原材料來源豐富。人工半合成真菌 多糖硫酸酯，通過控制反應條件，可以得到高硫酸根取代度、低分子量的產(chǎn)物，有利于口服 吸收和增大藥效。本發(fā)明公開的是提高脂質(zhì)體穩(wěn)定性的一類真菌多糖硫酸酯前體脂質(zhì)體粉末或凝 膠的制備方法。本發(fā)明將真菌多糖硫酸酯和其它脂質(zhì)成分通過加入支撐劑配制成顆粒狀、 凍干狀的前體脂質(zhì)體，加水水化即可成脂質(zhì)體。本發(fā)明公開的前體脂質(zhì)體除了具有普通脂 質(zhì)體優(yōu)點外，可以進一步延長藥物作用時間，增加產(chǎn)品穩(wěn)定性，有利于產(chǎn)品長期存放；還可 以進一步制作成緩釋(控釋)制劑、膠囊劑、顆粒劑、栓劑、片劑等，即可直接服用，也可以水 化后服用。本發(fā)明公開的前體脂質(zhì)體可以防治血管栓塞、彌漫性血管內(nèi)凝血、病毒感染和高 血脂等疾病。本發(fā)明通過下述制備方法和步驟完成(1)逆相蒸發(fā)法取成膜脂質(zhì)、膽固醇和維生素E按10-2 1 0. 1-0.5的質(zhì)量比溶于有機溶劑 (W/V為2-5% )，混勻后加入0. 5% -5%的多糖硫酸酯PBS(pH7. 0)溶液，有機相、無機相的 體積比為10-5 1，磁力攪拌制成穩(wěn)定的W/0型乳劑，超聲5-30分鐘，0 0. 8-1.2微孔濾膜 過濾，分次加入預熱(35°C)的載體中，液相、固相重量比為10-5 1，攪拌混勻后置真空干燥器或冷凍干燥器去除有機溶劑既制備成多糖硫酸酯前體脂質(zhì)體。(2)薄膜蒸發(fā)法取成膜脂質(zhì)、膽固醇和維生素E按10-2 1 0. 1-0.5的質(zhì)量比溶于有機溶劑 m為2-5% )，混勻后置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中35°C減壓蒸發(fā)成膜，加入0. 5% -5%的多糖硫酸酯 PBS(pH7. 0)溶液，有機相、無機相的體積比為10-5 1，洗膜，超聲5-30分鐘，00. 8-1. 2微 孔濾膜過濾，分次加入預熱(35°C)的載體中，液相、固相重量比為10-5 1，攪拌混勻后置 真空干燥器或冷凍干燥器去除有機溶劑既制備成多糖硫酸酯前體脂質(zhì)體。上述2種前體脂質(zhì)體制備方法中，有機溶劑選自乙醇、甲醇、氯仿、乙醚，或2種以 上溶劑的組合。本發(fā)明公開的真菌來源多糖硫酸酯前體脂質(zhì)體，其中多糖硫酸酯含量為 0. 1_10%，加水回復成脂質(zhì)體后，多糖硫酸酯在脂質(zhì)體中含量不少于0. 05-5%。本發(fā)明所述的前體脂質(zhì)體，真菌來源的多糖可以是均多糖，也可以是雜多糖，優(yōu)選 帶少量1，6分支的0-1，3葡聚糖。真菌優(yōu)選產(chǎn)量較大的食用菌或藥用菌。本發(fā)明所述的前體脂質(zhì)體，其中真菌多糖硫酸酯分子量在0. 2萬-50. 0萬之間，優(yōu) 選0. 3萬-20. 0萬，最優(yōu)0. 5萬-10. 0萬；單糖硫酸根的取代度為0. 5-2. 5，優(yōu)選1-1. 5。本發(fā)明公開的多糖硫酸酯前體脂質(zhì)體中成膜脂質(zhì)含量為10-90%，支撐劑的含量 為 9. 9-80%。本發(fā)明所述的前體脂質(zhì)體，其成膜脂質(zhì)成分選自蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、二棕櫚 酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺中篩選，優(yōu) 選卵磷脂。支撐劑選自殼聚糖、山梨醇、甘露醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、聚乙烯吡咯烷酮，優(yōu)選 低分子殼聚糖。
具體實施例方式實施例1 茯苓多糖硫酸酯的制備(1)采用常規(guī)堿溶解-酸沉淀的方法從中藥茯苓中提取茯苓多糖，苯酚-硫酸法檢 測多糖含量為99.2%。索氏抽提和元素分析結(jié)果顯示，所得茯苓多糖中檢測不出蛋白、核酸 和脂類物質(zhì)。粘度法測定粘均分子量為2. 15X105Da(2) 1000ml平底燒瓶中加入吡啶240ml，冷卻至4°C并攪拌，用分液漏斗慢慢滴加 氯磺酸40ml，制備磺化試劑；(3)向磺化試劑中加入12g茯苓多糖，于75-80°C下劇烈攪拌反應1小時；(4) 4NNaOH調(diào)pH6，減壓蒸餾去除水和吡啶，一直到蒸干為止；(5)反應瓶中加500ml熱水溶解，流水透析1天，收集溶液用活性碳脫色；(6) 3倍量的95 %乙醇沉淀茯苓多糖硫酸酯，無水乙醇洗滌，真空干燥，得淺黃色 粉末38. 5g ；(7)改良的BaS04濁度法檢測所得產(chǎn)品硫酸根含量，結(jié)果為48. 6% ；硝酸銀法檢測 NaCI含量小于0. 15% ；(8)經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳，甲苯胺藍染色，以已知分子量的肝素、硫酸軟骨素、透 明質(zhì)酸為對照品，檢測所得產(chǎn)品分子量分布范圍為0. 6萬-20. 0萬。實施例2 逆相蒸發(fā)法制備茯苓多糖硫酸酯前體脂質(zhì)體
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(1)取卵磷脂lg、膽固醇0.2g和維生素E O.Olg溶于30ml乙醇中，磁力攪拌混 勻；(2)加入5%的PBS(pH7. 0)茯苓多糖硫酸酯溶液3ml，磁力攪拌制成穩(wěn)定的W/0型 乳劑；(3)功率120W的超聲波儀超聲10分鐘(每超聲5分鐘，間歇1分鐘)，0 0. 8微 孔濾膜過濾；(4)邊攪拌邊分3次加入到預熱(35°C)的4g載體中，混勻后置真空干燥器35°C 減壓干燥既制備成多糖硫酸酯前體脂質(zhì)體。實施例3 薄膜蒸發(fā)法制備茯苓多糖硫酸酯前體脂質(zhì)體(1)取卵磷脂lg、膽固醇0. lg和維生素E0. Olg溶于30ml氯仿-乙醚混合液中 (V V = 1 1)，磁力攪拌混勻；(2)置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中35°C減壓蒸發(fā)成膜；(3)加入3 %的PBS (pH7. 0)茯苓多糖硫酸酯溶液5ml，洗膜；(4)功率120W的超聲波儀超聲20分鐘(每超聲5分鐘，間歇1分鐘)，①1. 2微 孔濾膜過濾；(5)邊攪拌邊分3次加入到預熱(35°C )的6g載體中，混勻后置冷凍真空干燥器 中干燥既制備成多糖硫酸酯前體脂質(zhì)體。
權(quán)利要求
一類真菌多糖硫酸酯前體脂質(zhì)體，其特征是以真菌來源的多糖經(jīng)硫酸酯化修飾后的聚陰離子產(chǎn)物，既多糖硫酸酯為活性成分，支撐劑和成膜脂質(zhì)成分為輔料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前體脂質(zhì)體，其特征是真菌來源的多糖可以是均多糖，也可 以是雜多糖，優(yōu)選帶少量1，6分支的0 -1，3葡聚糖。真菌優(yōu)選產(chǎn)量較大的食用菌或藥用菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前體脂質(zhì)體，其特征是多糖硫酸酯分子量在0.2萬-50. 0萬 之間，優(yōu)選0. 3萬-20. 0萬，最優(yōu)0. 5萬-10. 0萬；單糖硫酸根的取代度為0. 5-2. 5，優(yōu)選 1-1. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前體脂質(zhì)體，其成膜脂質(zhì)成分選自蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、 二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺中篩 選，優(yōu)選卵磷脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前體脂質(zhì)體，其特征在于所述的支撐劑選自殼聚糖、山梨醇、 甘露醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、聚乙烯吡咯烷酮，優(yōu)選低分子殼聚糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前體脂質(zhì)體，其特征在于真菌多糖硫酸酯的含量為 0. 1_10%，成膜脂質(zhì)含量為10-90%，支撐劑的含量為9. 9-80%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前體脂質(zhì)體，其特征在于制備方法是將多糖硫酸酯和成膜脂 質(zhì)成分通過加入支撐劑配制成固體狀的前體脂質(zhì)體，其制備步驟如下(1)逆相蒸發(fā)法取成膜脂質(zhì)、膽固醇和維生素E按10-2 1 0.1-0. 5的質(zhì)量比溶于有機溶劑(W/V 為2-5% )，混勻后加入0. 5% -5%的多糖硫酸酯PBS(pH7. 0)溶液，有機相、無機相的體積 比為10-5 1，磁力攪拌制成穩(wěn)定的W/0型乳劑，超聲5-30分鐘，0 0. 8-1. 2微孔濾膜過 濾，分次加入預熱(35°C)的載體中，液相、固相重量比為10-5 1，攪拌混勻后置真空干燥 器或冷凍干燥器去除有機溶劑既制備成多糖硫酸酯前體脂質(zhì)體。(2)薄膜蒸發(fā)法取成膜脂質(zhì)、膽固醇和維生素E按10-2 1 0.1-0. 5的質(zhì)量比溶于有機溶劑(W/ V為2-5% )，混勻后置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中35°C減壓蒸發(fā)成膜，加入0.5% -5%的多糖硫酸酯 PBS(pH7. 0)溶液，有機相、無機相的體積比為10-5 1，洗膜，超聲5-30分鐘，00. 8-1. 2微 孔濾膜過濾，分次加入預熱(35°C)的載體中，液相、固相重量比為10-5 1，攪拌混勻后置 真空干燥器或冷凍干燥器去除有機溶劑既制備成多糖硫酸酯前體脂質(zhì)體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的前體脂質(zhì)體制備方法，其特征在于有機溶劑選自乙醇、甲醇、 氯仿、乙醚，或2種以上溶劑的組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前體脂質(zhì)體，其特征在于真菌多糖硫酸酯前體脂質(zhì)體可進一 步制作成緩釋(控釋)制劑、膠囊劑、顆粒劑、栓劑、片劑等，即可直接服用，也可以水化后服 用。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前體脂質(zhì)體，其特征是該類藥物可以防治血管栓塞、彌漫性 血管內(nèi)凝血、病毒感染和高血脂等疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類以硫酸酯化修飾的真菌多糖為活性成分的口服前體脂質(zhì)體，屬于醫(yī)藥領域。真菌多糖，尤其是帶有少量1，6分支的β-1，3葡聚糖是真菌主要的活性成分，經(jīng)硫酸酯化修飾后有顯著的防治血管栓塞、彌漫性血管內(nèi)凝血、病毒感染和高血脂等疾病的功能。由于此類藥物極性強和分子量大，口服不吸收。注射給藥需要病人住院觀察，藥物誘導的粘膜出血副作用也很難控制。將這類藥物制備成口服前體脂質(zhì)體，既克服了脂質(zhì)體混懸液不穩(wěn)定的缺點，又實現(xiàn)了此類藥物的口服吸收，且通過脂質(zhì)體對藥物的緩控釋放，減小粘膜出血副作用。以逆向蒸發(fā)法和薄膜超聲分散法兩種方法制備脂質(zhì)體，再加入合適的載體，真空干燥或冷凍干燥制備前體脂質(zhì)體。本工藝過程簡單，容易控制，易放大工業(yè)化。
文檔編號A61K9/16GK101849908SQ200910116470
公開日2010年10月6日 申請日期2009年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月2日
發(fā)明者吳環(huán), 李賡, 沈壽國, 陳群 申請人:合肥學院