專利名稱：一種b群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說，本發(fā)明涉及一種B群腦膜炎重組蛋 白嵌合疫苗。同時，本發(fā)明還涉及所述疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
流行性腦脊髓膜炎(簡稱流腦)是由奈瑟氏腦膜炎球菌(Nesseria meningitidis) 引起的急性呼吸道傳染病，流腦是細(xì)菌性腦脊髓膜炎中唯一能造成流行的疾病，引起相當(dāng) 高的病死率和致殘率。流腦呈世界范圍分布，全世界流腦的平均年發(fā)病率為1 10/10萬， 在流行地區(qū)流行期間其年發(fā)病率可達(dá)500/10萬以上。流腦從病原體的發(fā)現(xiàn)至今已超過100 年，目前在世界上許多國家仍未能得到有效控制，仍是世界范圍的一個嚴(yán)重公共健康問題。
腦膜炎疫苗是全球兒童常規(guī)接種的細(xì)菌性疫苗之一。目前，該類疫苗的使用形式 主要是采取多糖或者多糖結(jié)合蛋白疫苗兩種形式。由于A、C、W、Y群多糖疫苗的應(yīng)用，有效 地降低了腦脊髓膜炎的發(fā)病率。而B群腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis group B, MenB)莢膜多糖結(jié)構(gòu)因與人體神經(jīng)細(xì)胞黏附分子同源，而不能激發(fā)有效的保護(hù)性免疫， 因此其多糖不能有效預(yù)防B群腦膜炎奈瑟菌的感染。因此，發(fā)展通用的蛋白質(zhì)疫苗勢在必 行。
能作為候選疫苗的具有免疫原性的蛋白質(zhì)需具備以下特點(diǎn)在大多數(shù)菌株中都表 達(dá)且結(jié)構(gòu)保守；可誘生殺菌抗體或保護(hù)性抗體?，F(xiàn)有技術(shù)中，研制與應(yīng)用的有B群外膜囊 泡(OMV)疫苗，其主要包括單價的VA-MENG0C-BC (古巴)、MenBvac (挪威)、MENZBTM (新西 蘭)，以及荷蘭研制出的6價PorA OMV疫苗，此類疫苗有其局限性，只能保護(hù)特定型別的B 群Nm。瑞士諾華公司(Novartis)研制的5CVMB疫苗三種主要的抗原為GNA2132、GNA1870、 NadA，另外的兩種抗原為GNA1030、GNA2091，但是此類疫苗也具有菌株的保護(hù)性差異。另外 諾華公司研制的FHBP蛋白疫苗，方法是對FHBP進(jìn)行氨基酸的替換和刪除，已經(jīng)開始二期臨 床試驗(yàn)。
當(dāng)前，國內(nèi)外B群Nm疫苗研究主要集中于一些特別的外膜蛋白上。其中腦膜炎球 菌外膜上，與腦膜炎球菌致病性密切相關(guān)的FHBP (Factor Η-binding Protein)，是一外膜 脂蛋白。由于具有較高的保守性成為了最有希望的MenB候選疫苗抗原之一。FHBP即為為 H因子結(jié)合蛋白。因子H是補(bǔ)體替代途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子，它在因子I介導(dǎo)的Ob裂解為滅活 片段iC!3b過程中發(fā)揮輔助因子作用。也促進(jìn)替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶C3bBb的衰變。FHBP和 因子H結(jié)合可下調(diào)替代途徑，從而有利于腦膜炎奈瑟菌生存。根據(jù)FHBP氨基酸的差異，可 以將MenB分為VI、V2、V3三個FHBP變異型，變異型內(nèi)高度保守而變異型間差異較大，針對 FHBP的抗體在變異型內(nèi)具有保護(hù)作用。分析FHBP氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HBP包含有三個結(jié)構(gòu) 域ABC，A結(jié)構(gòu)域在三個變型中是一致的，抗Vl的抗體由B結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)產(chǎn)生，而抗V2或V3 的抗體由位于C結(jié)構(gòu)域174-216位的氨基酸誘導(dǎo)產(chǎn)生。因此，由Vl變異型的全長FHBP和 V2變異型位于C結(jié)構(gòu)域的一段抗原表位組成的融合蛋白(FHBP-C2)能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對所 有MenB的保護(hù)性抗體。
本發(fā)明利用基因工程的手段，構(gòu)建表達(dá)純化了一種B群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合 疫苗。此融合蛋白(FHBP-C2)大小約為37KD，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價的抗體，并且此抗體 能誘發(fā)補(bǔ)體依賴的殺菌反應(yīng)。另外，由于該蛋白能在大腸桿菌中表達(dá)，例如BL21，因而有利 于大規(guī)模培養(yǎng)制備。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)實(shí)狀況的迫切需要，利用基因工程的手段，提供一種B 群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗。同時，本發(fā)明還提供一種所述重組蛋白嵌合疫苗的制備 方法。該方法所建立的質(zhì)粒的構(gòu)建、蛋白的分離純化方法，可以制備數(shù)種腦膜炎球菌重組蛋 白嵌合疫苗。
本發(fā)明的目通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。
*除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
A.本發(fā)明提供了一種B群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗，該疫苗由下列成分組 成含有基因工程表達(dá)并純化的B群腦膜炎球菌FHBP融合蛋白75000 μ g / ml，氫氧化鋁 佐齊[J Img / ml。
其中，①B群腦膜炎球菌FHBP融合蛋白由B群腦膜炎球菌FHBP蛋白Vl變異型全 長氨基酸序列和V2變異型位于C結(jié)構(gòu)域的一段抗原表位通過Gly-Pr0-Gly連接肽融合而 成；②按照FHBP蛋白的趨異性可以將B群腦膜炎球菌分為三個變異型，該重組蛋白疫苗是 由變異型Vl的全長FHBP與變異型V2的位于174-216位的一段氨基酸(以)連接而成，中 間是一段連接肽Gly-Pro-Gly。
該疫苗選自下述任一氨基酸序列①SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列；②在嚴(yán)謹(jǐn) 的雜交條件下與編碼①的氨基酸酸序列雜交的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列；SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，克隆入pET30a(+)載體后，導(dǎo)入大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)， 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE及Western鑒定分析，鎳離子親和層析柱純化，獲得的融合蛋白，該融 合蛋白具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明對所述的B群腦膜炎球菌蛋白嵌合疫苗進(jìn)行了蛋白含量的檢測，檢測結(jié)果 如下半成品蛋白含量MOOOOyg/ml ； 成品蛋白含量為75mg/ml ； 殺菌力試驗(yàn)殺菌抗體滴度達(dá)到1:32。
B.本發(fā)明提供了一種所述的B群腦膜炎球菌蛋白嵌合疫苗的制備方法，該方法采用下 述順序的步驟(1)采用基因工程的方法，搭橋PCR構(gòu)建含有Vl的全長FHBP和V2變異型的位于C結(jié) 構(gòu)域的一段抗原表位的融合基因片段，中間是一段連接肽基因，即為SEQ ID N0:1所示的 核苷酸序列，克隆入pET30a(+)載體后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；(2)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE及Western鑒定分析，鎳離子親和層析柱純化，獲得的蛋白 純度達(dá)到90%以上；分子量的大小約為37kD，可以判定為FHBP-C2融合蛋白，具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列；該抗原組分在測定蛋白含量后作為半成品疫苗；(3)根據(jù)半成品疫苗蛋白濃度，以生理鹽水稀釋至150mg/ml，同時與AL(0H)3以對倍 (V/V)混合，制成實(shí)驗(yàn)性蛋白疫苗，并對其進(jìn)行檢測；其半成品蛋白含量〉50000μ g/ml，成品 蛋白含量為75mg/ml ；該疫苗即為所需的腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗。
本發(fā)明所提出的質(zhì)粒的構(gòu)建、蛋白的分離純化方法還可用于制備數(shù)種腦膜炎球菌 重組蛋白嵌合疫苗。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下述突出的優(yōu)點(diǎn)(1)保護(hù)率高本發(fā)明研制的B群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗，雖然僅含有FHBP-C2 一個免疫原性的強(qiáng)的蛋白亞單位，但是具有抗三個變異型菌株的抗原表位，因此可以誘發(fā) 機(jī)體產(chǎn)生針對所有MenB的保護(hù)性抗體。
(2)有效性高將本發(fā)明研制的人用腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗免疫小鼠， ELISA結(jié)果檢測顯示本蛋白疫苗能夠產(chǎn)生很高的抗體效價。充分說明本蛋白疫苗由于含有 一個免疫原性較強(qiáng)的蛋白亞單位，因此能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答效果。
(3)安全性好該融合蛋白相對分子質(zhì)量相對較小，只保留了具有抗原性的蛋白亞 單位；因此副反應(yīng)大大降低，具有更好的安全性。


圖1是PCR產(chǎn)物的電泳圖譜；圖中泳道1表示成功擴(kuò)增出目的基因FHBP，大小約 為 750bp 。
圖2是酶切產(chǎn)物的電泳圖譜；圖中泳道1、2表明融合基因FHBP-C2成功的克隆到 了表達(dá)載體pET-30-a上，大小約為900bp。
圖3是第二峰3號管的SDS-PAGE (14%)電泳圖譜，出現(xiàn)一條帶，大小為37KD。
圖4是3號管的Western Blot結(jié)果，采用腦膜炎球菌診斷血清作為一抗，可見出 現(xiàn)一條特異性條帶，根據(jù)電泳中條帶位置的分子量的大小，可明確為FHBP-C2融合蛋白。
圖5是血清IgG的效價圖，兩次免疫血清IgG滴度15849，實(shí)驗(yàn)組小鼠的抗體水平 較PBS對照組有顯著性差異(P<0. 05)，轉(zhuǎn)陽率達(dá)到100%。證明FHBP-C2能后有效地誘導(dǎo)機(jī) 體產(chǎn)生特異性的IgG抗體。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對 本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，所描述的具體實(shí)施例僅僅用于解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1——基因工程菌的構(gòu)建采用基因工程的方法，搭橋PCR構(gòu)建含有B群腦膜炎球菌Vl變異型全長FHBP蛋白和 V2變異型的位于C結(jié)構(gòu)域的一段抗原表位的融合基因片段，中間是一段連接肽基因，即為 SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，克隆入pET30a(+)載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株。單 克隆擴(kuò)增，提質(zhì)粒用BamH I /EcoR I雙酶切鑒定，篩選陽性克隆，測序。經(jīng)鑒定序列準(zhǔn)確， 融合基因成功的克隆到pET-30-a中。將測序正確的重組質(zhì)粒pET30-a- FHBP-C2轉(zhuǎn)化大腸 桿菌BL21 (DE3)，挑取單克隆，接種于5ml LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜。再以1%接種量接種到5ml LB培養(yǎng)基中，0D600值達(dá)0. 4 0. 6時，加入IPTG至終濃度100mg/ml，誘導(dǎo)后每小 時取樣，14% SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示誘導(dǎo)劑濃度達(dá)到100mg/ml，誘導(dǎo) 時間為6個小時，蛋白表達(dá)量最高，選取表達(dá)量最高的的單菌落作為發(fā)酵用的工程菌種子。
實(shí)施例2 ——發(fā)酵方法將高表達(dá)的工程菌接種到五個三角瓶(每個瓶中300mlLB培養(yǎng)基)，過夜培養(yǎng)，至OD值 達(dá)到1. 2時，接種到含15L LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，優(yōu)化發(fā)酵條件，控制PH在7. 0，連續(xù)培養(yǎng) 約4小時，溶氧控制在20%—30%，每過一個小時測其PH和OD值，并通過補(bǔ)加濃氨水調(diào)節(jié)PH， OD值達(dá)到2時，逐級補(bǔ)料，OD值達(dá)到4. 5時左右時，開始加誘導(dǎo)劑15ml，誘導(dǎo)后6個小時開 始收菌。
實(shí)施例3——目的蛋白的純化將表達(dá)優(yōu)勢菌株發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)，收集菌體超聲破菌。分別用TE+300mMNaCl，TE+l%Trit on-x-100, TE+3M尿素依次洗滌，然后先后過CM離子柱和Q-HP離子柱，純度達(dá)90%以上，經(jīng) SDS-PAGE電泳分析以及Wfesrernblot,分子量的大小約為37kD，確定目的蛋白是FHBP-C2 融合蛋白。其具SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，目的蛋白經(jīng)TE+5%甘油+50mMNacl溶液 ( 冊.0)透析241!復(fù)性，超濾濃縮；該抗原組分在測定蛋白含量后作為半成品疫苗。如表1 所示，處理后的包涵體液先后過CM柱和Q-HP柱后，采用試管共收集到三個峰。
權(quán)利要求
1.一種B群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗，其特征在于，該疫苗由下列成分組成含有 基因工程表達(dá)并純度在90%以上的B群腦膜炎球菌FHBP融合蛋白75000 μ g / ml，氫氧化 鋁佐劑Img / ml ；其中，B群腦膜炎球菌FHBP融合蛋白由B群腦膜炎球菌FHBP蛋白Vl變異型全長氨基 酸序列和V2變異型C結(jié)構(gòu)域抗原表位通過Gly-Pr0-Gly連接肽融合而成。
2.按照權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，該疫苗選自SEQID N0:2所示的氨基酸 序列。
3.按照權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于，該疫苗選自下述核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s 交條件下與編碼的SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列雜交的核苷酸序列所編碼的氨基酸序 列。
4.按照權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于，具有SEQID NO :1所示的核苷酸序列。
5.一種含有權(quán)利要求4的任意一項所述核苷酸序列的表達(dá)載體。
6.一種含有權(quán)利要求5的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
7.一種B群腦膜炎球菌蛋白嵌合疫苗的制備方法，其特征在于，該方法采用下述順序 的步驟(1)采用基因工程的方法，搭橋PCR構(gòu)建含有B群腦膜炎球菌FHBPVl變異型的全長 氨基酸序列和FHBP V2變異型的C結(jié)構(gòu)域融合而成的基因片段，克隆入pET30a(+)載體后， IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；(2)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE及Western鑒定分析，鎳離子親和層析柱純化，獲得的蛋白純 度達(dá)到90%以上；分子量的大小約為37kD，與B群腦膜炎球菌抗血清特異結(jié)合，可以判定為 FHBP-C2融合蛋白；該抗原組分在測定蛋白含量后作為半成品疫苗；(3)根據(jù)半成品疫苗蛋白濃度，以生理鹽水稀釋至150mg/ml，同時與AL(OH)3以對倍 (V/V)混合，制成實(shí)驗(yàn)性蛋白疫苗，并對其進(jìn)行檢測；其半成品蛋白含量>50000μ g/ml，成 品蛋白含量為75mg/ml ；該疫苗即為所需的腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗。
8.權(quán)利要求7所述的質(zhì)粒的構(gòu)建、蛋白的分離純化方法在制備數(shù)種腦膜炎球菌重組蛋 白嵌合疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種B群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗及其制備方法。系采用搭橋PCR構(gòu)建含有B群腦膜炎球菌V1變異型全長FHBP蛋白和V2變異型的位于C結(jié)構(gòu)域的一段抗原表位的融合基因片段，克隆入pET30a(+)載體后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)層析柱純化，獲得的融合蛋白純度達(dá)到90%以上。該融合蛋白在經(jīng)SDS-PAGE及Western鑒定分析、蛋白含量等測定后作為半成品疫苗。根據(jù)半成品疫苗蛋白濃度，以生理鹽水稀釋至150mg/ml，同時與氫氧化鋁佐劑制成所需的B群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗。免疫小鼠后，能引起較高的FHBP特異抗體和血清殺菌抗體，顯示該疫苗能對B群腦膜炎球菌起到較好的預(yù)防作用。
文檔編號A61P31/04GK102028941SQ20101061013
公開日2011年4月27日 申請日期2011年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月11日
發(fā)明者姬秋彥, 彭世澤, 徐維明, 李健峰, 李智華, 畢研偉, 高丹丹 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所