專利名稱：一種新型溶栓藥物及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型溶血栓藥物及其制備方法。
尖吻蝮蛇毒中提取的纖維蛋白(原)溶解酶可降解血栓的主要成分纖維蛋白。目前報(bào)道的該酶僅作用于纖維蛋白原的α(A)鏈，而對(duì)β(B)鏈無作用(l.Ouyang C，Huang T-F.Purification and characterization of the fibrinolytic principle of Agkistrodon acutus venom.Biochim Biophys Acta 1976;439146-53.2.Ouyang C，Huang T-F.The properties of the purified fibrinolytic principle from Agkistrodon acutus snake venom.Toxicon 1977;15161-7)。
尿激酶也是一個(gè)溶血栓劑，有人將尿激酶與抗人纖維蛋白單克隆抗體連接，制成單抗導(dǎo)向溶血栓劑，其纖溶效率比單純尿激酶增加100倍(Bode C，et al.Antibody-directed urokinasea specific fibrinolytic agent，Science 1985;229765)。但是尿激酶價(jià)格昂貴。
本發(fā)明的目的是從蛇毒中得到一種新的纖維蛋白(原)溶解酶，并將此酶與抗人纖維蛋白單克隆抗體共價(jià)連接，制成單抗導(dǎo)向蛇毒溶血栓劑。
本發(fā)明從尖吻蝮蛇毒中得到一個(gè)對(duì)纖維蛋白原的α(A)和β(B)鏈均有降解作用的酶，分子量為25000～28000，等電點(diǎn)為8.00～9.00。并從含有抗人纖維蛋白β鏈N-端七肽單克隆抗體的小鼠腹水中親和層析提純?cè)搯慰寺】贵w。將上述纖維蛋白(原)溶解酶與雙功能交連劑N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(簡稱SPDP，下同)連接，再與經(jīng)巰基修飾的單克隆抗體連接，最后得到纖維蛋白(原)溶解酶與抗人纖維蛋白β-鏈N-端七肽單克隆抗體的連接物。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是，所得到的溶栓藥物其體外溶解血漿凝塊活力較單純纖維蛋白(原)溶解酶高，特異性好。與國外實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的尿激酶抗體導(dǎo)向溶血栓劑相比，本發(fā)明所得到的溶血栓劑成本低，原料易得，更具臨床應(yīng)用價(jià)值。
實(shí)施例1 纖維蛋白(原)溶解酶的鑒定分子量測(cè)定采用十二烷基硫酸鈉(簡稱SDS，下同)-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法。凝膠濃度12.5%，照常規(guī)方法電泳，標(biāo)準(zhǔn)蛋白采用Pharmacia公司電泳分子量測(cè)定試劑盒。測(cè)得纖維蛋白(原)溶解酶的分子量為26800。
等電點(diǎn)測(cè)定采用等電聚焦電泳法。照常規(guī)方法進(jìn)行等電聚焦電泳。電泳完畢，以1厘米為間隔，測(cè)量電泳膠從陽極到陰極各點(diǎn)的pH值，繪制pH梯度曲線，從曲線求出纖維蛋白(原)溶解酶的等電點(diǎn)。測(cè)得纖維蛋白(原)溶解酶的等電點(diǎn)為8.65。
對(duì)纖維蛋白的溶解方式將纖維蛋白(原)溶解酶與纖維蛋白凝塊在37℃反應(yīng)，取反應(yīng)液作SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，膠濃度為12.5%。反應(yīng)15分鐘后，纖維蛋白的α亞基全部降解，反應(yīng)60分鐘后，β亞基大部分降解。
對(duì)纖維蛋白原的溶解方式將纖維蛋白(原)溶解酶與纖原在37℃反應(yīng)，取反應(yīng)液作SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，膠濃度為7.5%。反應(yīng)15分鐘后，纖維蛋白原的α亞基全部降解。60分鐘后，β亞基大部分降解。
2 抗人纖維蛋白β鏈N-端七肽單克隆抗體與纖維蛋白(原)溶解酶連接物的制備抗纖維蛋白β鏈N-端七肽單克隆抗體的純化取小鼠腹水5毫升，用0.45μ膜過濾。將濾液加于用0.1M pH8.0的磷酸緩沖液平衡好的蛋白-A親和層析柱上，用相同緩沖液洗脫至280nm的吸光度＜0.01，改用0.1M，pH3.5的檸檬酸鈉洗脫(洗脫組分用2M Tris-Hcl pH6.0，含0.15M Nacl的溶液中和)。將收集組分對(duì)0.005M pH8.0的磷酸緩沖液透析24hr，測(cè)抗體含量，冰干備用。
抗纖維蛋白β鏈N-端七肽單克隆抗體與纖維蛋白(原)溶解酶的連接纖維蛋白(原)溶解酶-SPDP連接物的制備取纖維蛋白(原)溶解酶8毫克，溶于1毫升pH7.4的磷酸鈉溶液中，加入20倍的SPDP無水乙醇溶液，室溫?cái)嚢?5分鐘，反應(yīng)液對(duì)pH7.4的磷酸鈉溶液(含0.2M精氨酸，0.01%Tween 80)透析12hr。
單克隆抗體-巰基化試劑(iminothiolane)連接物的制備取抗體4.43毫克，溶于0.85毫升pH7.4的磷酸鈉溶液中，對(duì)相同溶液透析6hr，加入100倍的iminothiolane(溶與25mM pH9.3的硼酸鈉溶液中)，室溫?cái)嚢?5分鐘，過Sephadex G-25脫鹽柱。(預(yù)先用pH6.6的磷酸緩沖液平衡)。
單克隆抗體-纖維蛋白(原)溶解酶的連接、純化將上述方法得到的纖維蛋白(原)溶解酶-SPDP連接物溶液與抗體-iminothiolane溶液混和，室溫?cái)嚢柽^夜，加10倍量的馬來酰亞氨溶液終止反應(yīng)，反應(yīng)液過Sephacryl S-200凝膠過濾柱，用pH6.6的磷酸緩沖液洗脫，收集洗脫峰。
所用的單克隆抗體來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所提供的含抗人纖維蛋白β鏈N-端七肽單克隆抗體的小鼠腹水。
3 抗纖維蛋白β鏈N-端七肽單克隆抗體與纖維蛋白(原)溶解酶連接物的鑒定采用放射性同位素125I標(biāo)記的纖維蛋白(原)溶解酶，進(jìn)行各步反應(yīng)，將反應(yīng)液過Sephacryl S-200凝膠過濾柱(予先用標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白標(biāo)定)，測(cè)定各組分分子量和放射性活性，確定具有放射性活性，分子量約300KD的組分為單克隆抗體與纖維蛋白(原)溶解酶的連接物。
4 體外溶解血漿凝塊活力測(cè)定放射性標(biāo)記血漿凝塊的制備取1毫升枸櫞酸鈉抗凝人血漿，與痕量125I標(biāo)記的纖維蛋白原、50微升CaCl2(0.5M)混和，加25微升凝血酶(100NIH U/ml)，將混和物吸進(jìn)內(nèi)徑4mm膠管內(nèi)，在37℃保溫1小時(shí)。按1厘米長度切割，推進(jìn)平皿，用0.15M NaCl洗60分鐘，測(cè)量凝塊的放射性計(jì)數(shù)。
取單抗-纖維蛋白(原)溶解酶溶液1毫升，加入2毫升血漿，從加入放射性標(biāo)記的血凝塊起，1分鐘后，取反應(yīng)液50微升測(cè)定放射性計(jì)數(shù)，作為本底，分別于0.5、1、1.5、2hr取50微升反應(yīng)液測(cè)量放射性記數(shù)。
取同樣活力單位的纖維蛋白(原)溶解酶溶液1毫升，加入2毫升血漿，加入放射性標(biāo)記的血凝塊，照上述方法測(cè)量反應(yīng)液的放射性記數(shù)，分別計(jì)算血塊溶解率。單抗-纖維蛋白(原)溶解酶溶解血漿凝塊活力較單純纖維蛋白(原)溶解酶高2.5～4.9倍。
權(quán)利要求
1.一種新型溶血栓藥物，其特征為含有從蛇毒中提取的酶和單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶是尖吻蝮蛇毒酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶，其分子量為25000～28000，等電點(diǎn)為8.00～9.00。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶既能溶解纖維蛋白原的α(A)鏈，又能溶解β(B)鏈。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶血栓藥物的制備是將蛇毒溶栓酶與單克隆抗體連接而得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型溶血栓藥物及其制備方法。從蛇毒得到了一種新的纖維蛋白(原)溶解酶，并將此酶與抗人纖維蛋白單克隆抗體連接，制成蛇毒溶栓導(dǎo)向藥物。
文檔編號(hào)A61K35/58GK1077390SQ9310196
公開日1993年10月20日 申請(qǐng)日期1993年2月27日 優(yōu)先權(quán)日1993年2月27日
發(fā)明者錢小紅, 馬立人 申請(qǐng)人:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所