專(zhuān)利名稱(chēng)：沙苑子及其黃酮提取物在制備增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及沙苑子及其黃酮提取物的新用途，具體涉及利用其對(duì)自然殺傷細(xì)胞活性的增強(qiáng)作用在藥物制備中的用途。
背景技術(shù)：
沙苑子為豆科植物扁莖黃苗(Astragalus complanatus R .Br)的干燥成熟種子，有溫補(bǔ)肝腎，固精、縮尿、益肝明目的功能，為補(bǔ)益肝腎的傳統(tǒng)中藥，味甘、辛溫、無(wú)毒。沙苑子主要含有黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、留醇、多糖及鐵、鋅、猛、銅等微量元素，其中沙苑子黃酮有沙苑子式(complanatuside),沙苑子新式 (neocompalnoside),沙苑子楊梅式(myricomplanoside),鼠李朽1 檬素-3_0_β -D-葡萄糖 ft (rhomnocitrin-3-O- β -D-glucoside),紫云英 ft (astragalin),山奈素-3-0-L 阿拉伯批喃糖式(kaempferol-3-0- a -L-arabinoside),山奈酌·(kaompferol),楊梅樹(shù)皮素(myricetin),毛蕊異黃酮-7-0-葡萄糖式(calycosin-7-O-glucoside)等。藥理研究表明，沙苑子具有保肝、降脂、降壓、抑制血小板聚集、改變血液流變學(xué)指標(biāo)、抗炎及增加非特異性和特異性免疫功能等作用。自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK細(xì)胞)是體內(nèi)一類(lèi)獨(dú)特的淋巴細(xì)胞,具有無(wú)需預(yù)先致敏、無(wú)主要組織相容性體系(MHC)限制性、能直接殺傷靶細(xì)胞的功能特性。在機(jī)體抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和造血調(diào)控等方面發(fā)揮著重要的免疫功能，因此，NK細(xì)胞的臨床治療研究已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，通過(guò)各種途徑擴(kuò)增和激活NK細(xì)胞具有重要意義。而中藥活性成分調(diào)節(jié)NK活性目前未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種沙苑子及其黃酮提取物的新用途。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物在制備增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性藥物中的應(yīng)用。所述沙苑子黃酮提取物中以重量計(jì)黃酮含量> 50%。沙苑子黃酮提取物的制備屬于現(xiàn)有技術(shù)，例如，可以采用下列方法制備沙苑子粗粉用80%乙醇提取，經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂純化，無(wú)水乙醇重結(jié)晶，得黃色沙苑子黃酮提取物。上述技術(shù)方案中，所述沙苑子黃酮提取物包括黃酮及其醫(yī)藥上可接受的鹽。所述藥物含有治療有效量的沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物及藥學(xué)上可接受的載體。沙苑子黃酮提取物可口服給藥，每日劑量為3. Og-6. 0g，優(yōu)選4. Og-5. 0g。
由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)
I.研究證明，沙苑子黃酮提取物能促進(jìn)NK細(xì)胞增殖，提高NK的殺傷能力，上調(diào)NK細(xì)胞表面活性分子和NK細(xì)胞活化受體的表達(dá)；2.本發(fā)明首次采用中藥活性成分調(diào)節(jié)NK活性，具有重要的意義。


圖I是實(shí)施例二中沙苑子黃酮提取物(ACF)對(duì)NK細(xì)胞增殖活性的影響柱狀對(duì)比圖。圖2是實(shí)施例三中沙苑子黃酮提取物(ACF)對(duì)NK細(xì)胞殺傷K-562細(xì)胞作用的影響圖。圖3是實(shí)施例三中沙苑子黃酮提取物(ACF)對(duì)NK細(xì)胞殺傷SMCC7721細(xì)胞作用的影響圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述
實(shí)施例一沙苑子黃酮提取物(ACF)的制備
沙苑子粗粉lkg，用80%乙醇8000ml、7000 ml,7000 ml回流提取3次，每次I. 5 h，過(guò)濾，合并濾液，回收溶劑至無(wú)醇味后，加水稀釋至1000 ml，通過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂，上樣速度為l.Oml/min、上樣濃度為10. Oml/min、樣品液pH 5. O，水洗脫至淡黃色，40 %乙醇洗脫至
淺黃色。收集40%乙醇洗脫液，減壓濃縮至干，無(wú)水乙醇重結(jié)晶，結(jié)晶真空干燥，得黃色固體狀沙苑子黃酮提取物，采用紫外分光光度法以沙苑子苷為對(duì)照品測(cè)定總黃酮含量D，結(jié)果D 彡 60%ο實(shí)施例二 沙苑子黃酮提取物(ACF)對(duì)NK細(xì)胞增殖活性的影響
實(shí)驗(yàn)方法將NK-92細(xì)胞調(diào)整密度為I X IO5個(gè)細(xì)胞/ml，于96孔板中加IOOul/孔，力口入用培養(yǎng)基配制的不同濃度ACF，使終濃度分別為200，100，50，25，12 μ g/ml，于37°C培養(yǎng)2411、4811和7211，每孔加入1(^1^皿17溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入100 μ I 10%SDS,待紫色結(jié)晶完全溶解后，測(cè)定570nm的OD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果培養(yǎng)24h、48h和7此后，ACF各劑量對(duì)NK-92細(xì)胞活性均有增強(qiáng)作用，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。與對(duì)照組比較，培養(yǎng)24h的ACF-B、48h的ACF-B和ACF_C、72h的ACF-A E組細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)(/7〈0. 01)，尤以100 μ g/ml的ACF-B組最明顯，見(jiàn)圖I。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，沙苑子黃酮提取物(ACF)能顯著促進(jìn)NK細(xì)胞增殖，提高NK活性。實(shí)施例三沙苑子黃酮提取物(ACF)對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的影響
I.沙苑子黃酮提取物(ACF)對(duì)NK細(xì)胞殺傷K-562腫瘤細(xì)胞作用的影響實(shí)驗(yàn)方法以K-562為靶細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)至5 X IO4個(gè)細(xì)胞/ml，每孔100 μ I，加入96孔板中，不同濃度加藥培養(yǎng)的ΝΚ-92細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，效靶比為10: 1,5: I, I: 1，每孔100 μ 1，對(duì)照組加不含藥培養(yǎng)的ΝΚ-92細(xì)胞，每個(gè)效靶比設(shè)4個(gè)復(fù)孔，各組設(shè)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞對(duì)照孔。37°C，5%C02培養(yǎng)24h，吸棄100 μ I上清，加入MTT 10 μ I后繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入100ull0%SDS，待紫色結(jié)晶完全溶解后，測(cè)定570nm OD,根據(jù)以下公式計(jì)算NK細(xì)胞殺傷活性
殺傷活性(%) = {1_[(效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞OD值)一效應(yīng)細(xì)胞OD值]/靶細(xì)胞OD值}X100%
實(shí)驗(yàn)結(jié)果NK-92細(xì)胞加ACF培養(yǎng)3天后，ACF能增強(qiáng)NK-92細(xì)胞對(duì)K-562細(xì)胞的殺傷作用。與對(duì)照組比較，ACF-A, ACF-B和ACF-C組能顯著提高NK-92細(xì)胞對(duì)K-562細(xì)胞的殺傷活性(/KO. 01)，見(jiàn)圖2。2.沙苑子黃酮提取物(ACF)對(duì)NK細(xì)胞殺傷SMCC7721肝癌細(xì)胞作用的影響
實(shí)驗(yàn)方法將3麗(-7721靶細(xì)胞調(diào)至5\104個(gè)細(xì)胞/1111，于96孔板中加入100 μ I/孔，培養(yǎng)12h后，按照效靶比為10:1，5: I, I: 1，加入不同濃度加藥培養(yǎng)的NK-92細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)照組加不含藥培養(yǎng)的NK-92細(xì)胞，每個(gè)效靶比設(shè)4個(gè)復(fù)孔，各組設(shè)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞對(duì)照孔。37°C，5%C02培養(yǎng)24h，吸棄100 μ I上清，加入MTT 10 μ I后繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入100ull0%SDS，放置過(guò)夜，測(cè)定570nm 0D,計(jì)算NK細(xì)胞殺傷活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果NK-92細(xì)胞加ACF培養(yǎng)3天后，ACF能增強(qiáng)NK-92細(xì)胞對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的殺傷作用。當(dāng)效靶比為10 :1和5 :1時(shí)，與對(duì)照組比較，ACF-A、ACF-B和ACF-C組能顯著提高NK-92細(xì)胞對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的殺傷活性(/X0. 01 )，見(jiàn)圖3。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，沙苑子黃酮提取物(ACF)能顯著提高NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞K562和SMMC-7721的殺傷活性。實(shí)施例四沙苑子黃酮提取物(ACF)對(duì)NK細(xì)胞表型及活化分子表達(dá)的影響
實(shí)驗(yàn)方法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞表面分子。NK-92細(xì)胞于含不同濃度ACF(終濃度為100，50，25 μ g/ml)的a -MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)對(duì)照組，每2天換液I次。收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次，加入O. 25%BSA封閉30min后，PBS洗滌兩次，加入單抗CD3、CD56、CD16、CD25 (IL-2L)、CD69、CD95 (同時(shí)以同型單抗作對(duì)照)，冰浴30min, PBA洗滌兩次，流式細(xì)胞儀分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞表型流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，ACF培養(yǎng)7天的NK-92，其細(xì)胞膜表面表達(dá)的CD56分子與對(duì)照組的NK-92細(xì)胞相同，均為CD56toight，control組、ACF100, ACF50、ACF25組⑶56分子表達(dá)率和平均熒光強(qiáng)度分別為99. 2±0. 5、82. 4±0. 3,99. 1±0. 3、85. 6±0· 2,99. 4±0· 3,84. 8±0· 2,99. 1±0· 1,85. 5±0· 3 ;而 CD3 和 CD16 分子仍為陰性，但⑶25、⑶69分子的表達(dá)強(qiáng)度提高，各組⑶25分子表達(dá)率和平均熒光強(qiáng)度分別為63. 4±0. 7、
2.21±0· 2,74. 3±0· 4**、3· 67±0· 3*, 72. 6±0· 5**、2· 58±0· 2,57. 26±0· 6,2. 48±0· 2 ；各組⑶69分子表達(dá)率和平均熒光強(qiáng)度分別為13. 2±0. 3、1.93±0. 3，13. 4±0. 2、
5.05±0· 4**，14. 94±0· 3,1. 87±0· 5，13. 1±0· 5,1. 98±0· 2 ;各組 CD95 分子表達(dá)率增加，分別為3. 76±0· 2，4. 22±0· 3，4. 98±0· 3*，4. 20±0· 2，而熒光強(qiáng)度無(wú)明顯差異。見(jiàn)Fig4-4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，沙苑子黃酮提取物(ACF)可通過(guò)上調(diào)⑶25 (IL_2 R)、⑶69和⑶95分子的表達(dá)，增加與IL-2的結(jié)合而激活殺傷分子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，提高其殺傷作用。實(shí)施例五沙苑子黃酮提取物(ACF)對(duì)NK細(xì)胞活化受體KLRK1、NCR1、NCR2、NCR3表達(dá)的影響
實(shí)驗(yàn)方法采用熒光定量RT-PCR檢測(cè)NKP46、NKP44、NKP30、NKG2D mRNA的表達(dá)。NK-92細(xì)胞于含不同濃度ACF (終濃度為100，50，25 μ g/ml)的a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)對(duì)照組，每2天換液I次。收集細(xì)胞，PBA洗滌兩次，按RNA抽提試劑盒說(shuō)明進(jìn)行總RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在MJ Research Opticon TM2實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上同時(shí)檢測(cè)NKP46、NKP44、NKP30、NKG2D和β-actin的表達(dá)，以SYBR Green I為熒光染料。以看家基因β-actin表達(dá)作為內(nèi)參照，基因表達(dá)水平的改變=2_ΛΛετ。目的基因表達(dá)水平Λ CT =目的基因CT 一 β-actin CTo ΛΛ CT =實(shí)驗(yàn)組Λ CT —對(duì)照組Λ CT值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。CT值的含義是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。引物序列
權(quán)利要求
1.沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物在制備增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物在制備增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述沙苑子黃酮提取物中以重量計(jì)黃酮含量> 50%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物在制備增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述沙苑子黃酮提取物包括黃酮及其醫(yī)藥上可接受的鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物在制備增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物含有治療有效量的沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了沙苑子和/或沙苑子黃酮提取物在制備增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性藥物中的應(yīng)用。沙苑子黃酮提取物能促進(jìn)NK細(xì)胞增殖，提高NK的殺傷能力，上調(diào)NK細(xì)胞表面活性分子和NK細(xì)胞活化受體的表達(dá)；本發(fā)明首次采用中藥活性成分調(diào)節(jié)NK活性，具有重要的意義。
文檔編號(hào)A61P37/04GK102716178SQ20121010651
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月12日
發(fā)明者劉春宇 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)