專利名稱：用于基因治療的新的載體的制作方法
基因治療是用于治療孟德爾遺傳病最有前途的方法之一。在將基因傳遞到缺乏個別蛋白質的細胞中，以達到治療由缺失或缺陷基因引起的疾病的最終目的方面，已經成功地完成了許多試驗。這些蛋白質有次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(累-納氏綜合癥)、腺苷脫氨基酶(嚴重的聯(lián)合免疫缺陷)、嘌呤核苷磷酸化酶(嚴重的聯(lián)合免疫缺陷)、葡糖腦苷脂酶(高歇氏病)、α-1-抗胰蛋白酶(肺氣腫)、生長激素(侏儒)、低密度脂蛋白受體(家族性血膽甾醇過多)、苯丙氨酸羥化酶(pydroxylase)(pehylketonuria)、精氨基琥珀酸合成酶(瓜氨酸血)、β-球蛋白(地中海貧血癥)、(凝血)因子IX(血友病)等。
盡管基因治療有著巨大的潛力，然而，不幸地是，從已在全世界范圍內進行的涉及大約567個病人的大約106個臨床試驗中，尚得不出足夠的證據來證明基因治療的臨床功效。國家人類基因組研究中心(NCHGR)主任Francis Collins將這種情況總結為“現(xiàn)有的技術都不能在臨床上用于系統(tǒng)的基因轉移，即能夠提供永久治療的基因治療”(Marshall E.The truble with vectors.Science 2691052-1055(1995))。
迄今臨床基因轉移已應用了病毒載體，不是逆轉錄病毒載體(大約72％的冶療方案)，就是腺病毒載體。使用重組病毒有幾個缺點，例如這些重組病毒只能容納幾個千堿基的DNA，以及難于控制和難于確保表達。與這些病毒載體有關的其它問題還有傳遞不穩(wěn)定、整合頻率低及免疫原性和隨機插入突變。
由于高等生物許多基因的DNA片段都大，因此片段大小的限制及逆轉錄病毒載體的限制是致命弱點。例如，人類血友病中缺失的編碼凝血因子的因子VIII基因的全長至少為190kb(Gitschier，et al.，Nature(London)，312326，1984)。假肥大性肌營養(yǎng)障礙有缺陷的基因估計包括超過一百萬個堿基對(1000kb)，這個基因的顯著特點是蛋白編碼部分能夠由小至15kb的DNA來編碼(Monaco，et al.，Nature(London)，302575，1983)。因此，為了用于基因治療強烈需要新的載體，以允許加入很大片段的多核苷酸，如一個基因。因此，本發(fā)明的一個目的是提供可克服現(xiàn)有基因治療方式的許多缺點的、用于基因治療的新的真核表達載體。本發(fā)明的載體得自于人類隨體小染色體并能夠容納大于50個千堿基對的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個目的是用本發(fā)明載體構建用傳統(tǒng)載體不能構建的、含有大片段DNA序列的基因文庫。
本發(fā)明提供了能容納大片段多核苷酸，諸如編碼基因的多核苷酸的新的真核表達載體。本發(fā)明的載體在真核細胞，尤其是哺乳類、更尤其是人類細胞中作為額外染色體元件可以穩(wěn)定地保持與自主復制，可用于體細胞基因治療。
本發(fā)明的另一個目的是提供能夠用作新的表達載體源的細胞系。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種用含有所需基因的新的表達載體來治療由基因缺失或基因缺陷引起的疾病或失調的方法。
對于本發(fā)明的目的，術語“表達載體”或“基因治療載體”指的是用于體細胞治療的能在選定的哺乳類、尤其是人類宿主細胞中進行復制的，并表達所需蛋白質的DNA載體。
隨體小染色體是一種超過人類正常數目46條染色體的額外微染色體，它存在于攜帶者的所有細胞中，核型為47，XX/XY+隨體小染色體。隨體小染色體沒有有害的遺傳效應，而且在減數分裂中以穩(wěn)定的方式傳遞。文獻中大量報導了帶有或不帶有隨體的額外小染色體。在這一類有一由無害的、家族例外的雙隨體小染色體組成的亞組。在這些家族中，額外隨體小染色體通常是被偶然發(fā)現(xiàn)的，一般在攜帶者中不產生有害效應。一般請參閱Journal of Heredity，P.N.Howard-Peebles，70(5)347-8(1979)；Human Genetics，C.Ramos et al.，497-10(1979)；Clinical Genetics，D.R.Romain，16183-190(1979)；SouthAfrican Medical Journal，A.H.Bamard and R.D.Smart，58(12)485-8(1980)；New England Medical Journal，D.R.Romain，96(689)90-91(1981)；和Steinbach P.et al.，Hum.Genet.1983；65155-164(1983)。
中華人民共和國的夏家輝(Jiahui Xia)教授在細胞遺傳學研究中鑒定出兩個帶有隨體小染色體、表型正常的家族。一個家族有三個正常表型的攜帶者，先證者為一30歲男性，其姐為35歲，其父65歲。另一家族有兩個正常表型的攜帶者，先證者為一28歲男性，其女2歲。從每個家族的先證者身上收集血樣及皮膚樣品用于染色體分析。其結果表明，兩者的外周血淋巴細胞及皮膚細胞都含有這種隨體小染色體。該隨體小染色體對人體無害，并且能通過配子到體細胞一代代穩(wěn)定地傳遞下去。該隨體小染色體含有端粒及著絲粒。這些特征符合用于基因治療的載體的需要。因此，此申請的目的是提供用于基因治療的分離的隨體小染色體。此申請的另一個目的是提供一種將這種隨體小染色體作為新的載體，通過基因治療來治療由缺失基因或缺陷基因引起的疾病的方法。
收集來自兩個先證者的外周血淋巴細胞，用EB病毒轉化淋巴細胞系(中國國家醫(yī)學遺傳學實驗室突變細胞庫的目錄號為B5537LC，B5538LC)。還收集了來自兩個先證者的皮膚樣品，用來構建兩個成纖維細胞系(中國國家醫(yī)學遺傳學實驗室突變細胞庫的目錄號為B5537SKIN，B5538SKIN)。這四個含有隨體小染色體的細胞系貯藏在中華人民共和國武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心[*——*]，保藏號為[*——*]。此項保藏是以專利申請步驟為目的、按照布達佩斯條約關于國際微生物保藏的國際確認的條款進行的。隨體小染色體的特征染色體G帶和N帶分析表明，隨體小染色體由雙隨體和著絲粒組成。
利用由微操作構建的隨體小染色體特異性探針庫，用PCR作為探針與攜帶者的中期外周淋巴細胞做熒光原位雜交(FISH)，證明隨體小染色體起源于D組染色體(染色體13至15)和G組染色體(染色體21，22)的短臂部分(H-X Deng，et al.，Chromosome-band specific paintingchromosome in situ suppression hybridization using PCR products from amicrodissected chromosome band as a probe pool.Hum Genet.1992；8913-17(1992))。隨體小染色體的形成起因子配子減數分裂期間的錯誤分裂。
分子遺傳學方面的研究證實，人類D組和G組染色體的短臂是核仁組織區(qū)域(NOR)和編碼人類核糖體RNA(rRNA)的區(qū)域。此區(qū)域含有大約300個拷貝的人類核糖體基因。NOR的DNA參與細胞核中核仁的形成，其轉錄產物—rRNA是蛋白質合成場所核糖體的基本組分(J.E.Sylvester et al.，The human ribosomal RNA genes structure andorganization of the complete repeating unit，Hum.Genet.73193-198(1986))。不同人中的rRNA基因拷貝數是不同的，甚至同一個人的不同組織細胞中或同一細胞的不同代謝周期，rRNA基因的表達量也是不同的，但這對人體功能沒有影響。所以，D組和G組染色體短臂的變化沒有有害的遺傳效應。
盡管對于本領域的技術人員來說，上文介紹的方法學已經含有足夠的細節(jié)來實路本發(fā)明，但市場上買得到的一本題為MOLECULARCLONING(Maniatis，et al.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York)的技術手冊能提供某些額外細節(jié)，有助于實施本發(fā)明的某些方面。因此，將這本手冊引入本文作為參考。
簡而言之，第一步，從保藏的細胞系中分離出隨體小染色體。用于純化染色的技術包括蔗糖密度梯度、流式分選等，這都是本領域的標準技術。通過將有義多核苷酸如一個基因連接在適當的啟動子或控制序列下游，使隨體小染色體具有特殊的遺傳功能?？梢杂貌煌姆椒▽⑦m當的DNA的序列插入到載體中。一般說來，DNA序列通過本領域已知的方法插入到適當的限制性內切酶法位點上，這些限制性內切酶位點最好來自不常見的內切酶，如NotI，BglI等。本領域的技術人員易于制造和/或探測這樣獨特的限制性位點，這些及其它操作方法都被認為是在這些本領域的技術人員的能力范圍內。如果需要，可以用脈沖場凝膠電泳法來純化限制后的片段。
要插入載體的DNA除含有編碼所需蛋白質和啟動子的多核苷酸序列外，還可以含有適當的增強子，也可含有任何必需的核糖體結合位點、多聚腺苷酸化位點，拼接供體和受體位點、轉錄終止序列以及5′端連接的非轉錄序列。來自SV40的t抗原拼接位點和多聚腺苷酸化位點的DNA序列可以用來提供所需的非轉錄的遺傳元件。
作為另一個實施方案，為了使操作和處理容易進行，本發(fā)明的載體可以修飾成含有一個或多個下列片段a.編碼至少一個可選擇標記的DNA或基因組DNA區(qū)域，b.編碼多個克隆位點的DNA或基因組DNA區(qū)域，以及c啟動子、增強子、核糖體結合位點、多聚核苷酸化位點、拼接供體和受體位點以及轉錄終止序列。
表達載體也可以修飾成包括適當的表達控制序列(啟動子)，來指導mRNA的合成?？梢詰玫倪m合的啟動子包括，但不限于逆轉錄病毒LTR、SV40啟動子、Miller等人介紹的人類巨細胞病毒(CMV)啟動子(Miller et.al.，Biotechniques 7980-990(1989))或任何其它啟動子(細胞啟動子，例如象包括，但不限于組蛋白、RNA聚合酶III和β-肌動蛋白啟動子的真核細胞啟動子)，其它可以應用的病毒啟動子包括，但不限于腺病毒啟動子、胸苷激酶(TK)啟動子和B19細小病毒啟動子。從本文介紹來看，合適啟動子的選擇對本領域技術人員來說是顯而易見的。
通過插入增強子序列，提高編碼所需高等真核生物多肽的DNA的轉錄。增強子是通常大約100-300bp的DNA順式作用元件，它作用于啟動子以增強它的轉錄。實例包括位于復制起點后邊100-270bp的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、位于復制起點后邊的多瘤增強子和腺病毒增強子。
表達載體也可含有用于轉錄啟動和轉錄終止子的核糖體結合位點。載體也可包含適當的表達擴增序列。
本發(fā)明的載體也可制作成包括包含含有不常見的限制性酶切位點的多克隆盒樣序列的DNA區(qū)域，以便于插入所需基因?？梢詮膸讉€不同的公司(Stratagene，Promega，New England Biolabs，等)買到多克隆盒樣序列盒。典型的盒樣序列盒應該包括8-11個不同酶(即EcoRI，SacI，Smal，Aval，NotI，BamHI，XbaI，HincII，AccI，SalI，PstI，HindIII等)的限制性位點。本領域技術人員知道這些盒的利用價值。
對哺乳類細胞來講，一旦提供抗性的DNA轉染到擁有適合于載體所用的選擇標記遺傳方式的個別細胞中，可選擇標記提供對特異選擇試劑的抗性。本領域技術人員知道有大量不同的顯性和隱性選擇試劑。以下任何一種基因和試劑就應用的選擇系統(tǒng)而論，都應該是有效的。
G418抗性通過暴露于含有100至800ug/ml G418的培養(yǎng)基中來選擇。G418用來篩選氨基葡萄糖苷磷酸轉移酶缺失細胞，并被稱為新霉素抗性細胞(Southern and Berg，J.Molec.Appl.Gen.，1327-341，1982；Colbere Garapin et al.，J.Molec.Biol.，1501，1981)。
用于向前篩選(將胸核苷激酶陰性細胞轉化為胸核苷激酶陽性細胞)的HAT抗性用添加100uM次黃嘌呤、0.4uM氨基蝶呤、16uM胸苷和3uM甘氨酸的完全培養(yǎng)基來篩選。HAT培養(yǎng)基用來篩選次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶或胸核苷激酶缺陷變異株(Littlefield，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，50568，1963；Littlefield，Science.145709-710，1964)(Littlefield，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，50568，1963；Littlefield，Science.145709-710，1964)。
潮霉素B抗性通過暴露于添加10-400ug/ml潮霉素B的完全培養(yǎng)基中來篩選。潮霉素B用來篩選潮霉素-B-磷酸轉移酶有缺陷的變異株(Gritz and Davis，Gene，25179-188，1983，Santerre，et al.，Gene，30147，1984；Palmer，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，841055-1059，1987)。
腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(APRT)陽性變異株通過暴露于添加25uM腺苷、50uM重氮絲氨酸和100uM腺嘌呤的培養(yǎng)基來篩選(Lowy，et al.，Cell，22817，1980，Adair，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，864574-4578，1989)。
黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(SGPRT)陽性變異株用添加透析過的胎牛血清、250ug/ml黃嘌呤、15ug/ml次黃嘌呤、10ug/ml胸苷、2ug/ml氨基蝶呤、25ug/ml霉酚酸、150ug/ml L-谷氨酰胺的完全培養(yǎng)基來篩選(Mulligan and Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，782073-2076，1981)。
氨甲蝶呤抗性通過暴露于0.01uM-300uM氨甲蝶呤和透析過的胎牛血清的完全培養(yǎng)基中來篩選。氨甲蝶呤用來篩選高水平表達二氫葉酸還原酶的細胞(O.Hare，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，781527，1981；Simonsen and Levinson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，802495-2499，1983)。
脫氧柯福霉素抗性細胞通過暴露于添加10ug/ml胸苷、15ug/ml次黃嘌呤、4uM 9-B-D-呋喃木糖基腺嘌呤(XyLA)和0.01-0.03uM 2′脫氧柯福霉素(dCF)的完全培養(yǎng)基來篩選。這是用來篩選表達腺苷脫氨酶的突變株(ADS，Kaufman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，833136-3140，1986)。
構建到宿主細胞中的載體的導入，可以通過用于本領域的傳統(tǒng)技術如磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染以及顯微注射來實現(xiàn)(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。其它的轉染技術包括(1)將含有插入的載體包裹到脂質體中，(2)當細胞周期進行到G1期時，將載體用電穿孔法導入到進行有絲分裂的細胞受體中，以加強它在細胞核中的包埋，以及(3)將包被DNA的粒子用Biolistic粒子傳遞系統(tǒng)(DuPont)注射到細胞中；這最后一個步驟必需將包被DNA的子彈射入到細胞或組織中。
在一個實施方案的一個例子中，在假肥大性肌肉營養(yǎng)障礙或肌強直性營養(yǎng)障礙，或者其它大量與肌肉機能障礙有關的疾病中的一種方面有缺陷的基因或基因的cDNA衍生物可以克隆到隨體小染色體載體中。然后將染色體用下文介紹的適于靶物的方法，在體外導入到細胞、組織或動物中。轉染后的染色體作為受體細胞的組份，在受體細胞中它可穩(wěn)定地保持和表達。原來因基因缺陷引起機能障礙的受體細胞、組織或動物，由于導入載體中的正常基因產物的表達和合成而得到治療，并變?yōu)檎?。當細胞或組織被體外轉化后，可將它們提供給要用所需多肽治療的患者。可以被轉化的哺乳類細胞的實例包括，但不限于胚
干細胞(embryonic stem cells)、胚癌細胞(embryonic carcinomacells)，而且也包括造血干細胞(hematopoietic stem cells)、肝細胞、成纖維細胞、成肌細胞、角化細胞、內皮細胞和支氣管上皮細胞。
權利要求
1.細胞系，它在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為No.……。
2.隨體小染色體，它包含于在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為No.……的被保藏的細胞系中。
3.根據權利要求2的隨體小染色體，它包含一個插入的多核苷酸。
4.一種用于基因治療的方法，該方法包含在體外用隨體小染色體載體轉化帶有缺失基因或缺陷基因的細胞，所述隨體小染色體載體含有所需的多核苷酸，并因而將基因提供給需要它的患者。
全文摘要
本發(fā)明提供了可容納大片段的多核苷酸如基因的新的真核表達載體。本發(fā)明的載體在真核細胞,尤其是哺乳類,以及更尤其是人類細胞中能作為額外染色體元件可以穩(wěn)定地保存及自主復制,可用于體細胞基因治療。本發(fā)明的另一個目的,是提供可用作新的表達載體源的細胞系。本發(fā)明還有一個目的,是提供用含有所需基因的新的表達載體治療由基因缺失或缺陷引起的疾病或失調的方法。
文檔編號A61K48/00GK1180745SQ9612275
公開日1998年5月6日 申請日期1996年10月26日 優(yōu)先權日1996年10月26日
發(fā)明者夏家輝 申請人:湖南醫(yī)科大學