專(zhuān)利名稱(chēng)：一種提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一種提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法。 具體涉及一種在靈芝菌絲體液體發(fā)酵中利用中藥提取物以及通過(guò)調(diào)控中藥種類(lèi)、濃度和添加時(shí)間等因素誘導(dǎo)靈芝次生代謝產(chǎn)物靈芝三萜類(lèi)化合物的產(chǎn)生與積累的方法。
背景技術(shù)：
靈芝(Ganoderma lucidum)是我國(guó)最著名的高等藥用真菌。作為藥物已有2000 多年的歷史。目前在靈芝中研究較多的化學(xué)成分有多糖類(lèi)、三萜類(lèi)、核苷類(lèi)、留醇類(lèi)、生物堿類(lèi)、呋喃類(lèi)、氨基酸多肽類(lèi)、油脂類(lèi)、微量元素等物質(zhì)。靈芝三萜是靈芝的主要活性成分之一。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，靈芝三萜具有抗腫瘤、保肝作用，抑制組胺釋放、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶等活性。而通過(guò)各種方法(如紫外誘變選育)促使得到更多的靈芝的有效活性成分，已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究和關(guān)注的熱點(diǎn)。靈芝代謝產(chǎn)物可能與中草藥的有效成分發(fā)生復(fù)方、協(xié)同作用，如靈芝在添加中草藥培養(yǎng)液的環(huán)境中可能加速靈芝萜類(lèi)的形成，增加其生物活性。中藥的某些成分可能促進(jìn)靈芝的生長(zhǎng)和有效成分的產(chǎn)生，使靈芝的原有作用得到補(bǔ)充或增強(qiáng)，從而具有更強(qiáng)的保健、 預(yù)防或治療功能，以便于進(jìn)一步制作出配伍更佳的新型復(fù)合發(fā)酵制劑，用于功能性食品的開(kāi)發(fā)等方面。三萜類(lèi)化合物為靈芝主要藥用成分之一，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多報(bào)道，另外通過(guò)添加外源物的方法研究其對(duì)靈芝菌絲體生物量和三萜類(lèi)化合物含量的影響也有不少報(bào)道，如把中藥提取液作為靈芝外源誘導(dǎo)物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法。本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—種提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法，其在于在靈芝菌絲體液體發(fā)酵時(shí)，采用含中藥提取物的培養(yǎng)基進(jìn)行靈芝菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)。上述的提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法，其在于包括以下步驟(1)稱(chēng)取中藥材，制備中藥提取物；(2)向PDA培養(yǎng)基中加入步驟1制備的中藥提取物，制備含有中藥提取物的PDA培
養(yǎng)基；(3)向步驟(2)制備的含有中藥提取物的PDA培養(yǎng)基中接入靈芝菌種，菌種接種量為5% 15% ；在溫度沘 30°C，轉(zhuǎn)速120 150r/min條件下，搖床培養(yǎng)7 10d。上述的提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法，其在于所述的中藥提取物的制備方法為稱(chēng)取中藥材，加4 10倍量的水浸泡0. 5 池后，加熱提取2 3次，每次提取時(shí)間為15 40min，過(guò)濾，合并濾液并濃縮濾液后，將濃縮液置于容量瓶中定容，得到中藥提取物。
上述的提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法，其在于步驟O)中按生藥量計(jì)算，所述PDA培養(yǎng)基中中藥材的添加量為50 800mg/mL。上述的提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法，其在于用于制備所述中藥提取物的中藥材為板藍(lán)根、連翹、澤瀉、黃芪或酸棗仁。優(yōu)選為板藍(lán)根、連翹或酸棗仁。上述的提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法，其在于按生藥量計(jì)算，板藍(lán)根添加量為50 800mg/mL，連翹添加量為50 100mg/mL，澤瀉添加量為100mg/mL，黃芪添加量為50mg/mL，酸棗仁添加量為100mg/mL。進(jìn)行靈芝菌絲體液體發(fā)酵時(shí)，不能直接將中藥材加入培養(yǎng)基中，需要先制備制備中藥提取液，再將中藥提取液加入到培養(yǎng)基中制成含中藥提取物的培養(yǎng)基。IOOOmL含中藥提取物的PDA液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成為馬鈴薯汁IOOOmL,葡萄糖20克，中藥提取物。具體做法是馬鈴薯洗凈去皮切成小塊，稱(chēng)取200g，加水IOOOmL煮沸 10 30分鐘，紗布過(guò)濾，再加20g葡萄糖，充分溶解后，用中藥提取液部分代替水定容至1 升，分裝到三角瓶，115°C滅菌30分鐘，冷卻后貯存用于靈芝培養(yǎng)。本發(fā)明利用在液體發(fā)酵基礎(chǔ)中添加中藥提取液，提高靈芝菌絲體的三萜產(chǎn)量。本發(fā)明的有益效果通過(guò)本發(fā)明的方法，可顯著提高靈芝菌絲體液體發(fā)酵時(shí)三萜類(lèi)化合物的產(chǎn)量，且方法簡(jiǎn)單，與常規(guī)培養(yǎng)方法相比采用本發(fā)明方法可使液體發(fā)酵的靈芝菌絲體中三萜類(lèi)化合物的產(chǎn)量提高對(duì)％ 845%。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明實(shí)施例11.稱(chēng)取中藥材板藍(lán)根5g，加入6倍重量的水浸泡Ih后，先用武火加熱至沸騰，再用文火保持沸騰狀態(tài)30min，倒出提取液，補(bǔ)加5倍重量冷水于藥渣中，再煮沸20min，倒出提取液。將兩次提取液過(guò)濾，合并濾液并濃縮后，將濃縮液置于50mL容量瓶中定容，按照生藥量計(jì)算，得到濃度為lOOmg/mL的板藍(lán)根提取液。分別按照上述方法制備50mL 濃度為 200mg/mL、400mg/mL、800mg/mL、1200mg/mL、 1600mg/mL的板藍(lán)根提取液。2.分別用50mL不同濃度的板藍(lán)根提取液部分代替水配制IOOmL PDA培養(yǎng)基，則所配制的PDA培養(yǎng)基中板藍(lán)根的生藥量分別為50mg/mL、100mg/mL、200mg/mL、400mg/mL、 600mg/mL、800mg/mL。每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)。115°C滅菌30分鐘。分別以10%接種量接入靈芝液體菌種，28°C，150r/min培養(yǎng)7天。3.發(fā)酵結(jié)束后，用銅濾網(wǎng)收集菌絲球，并用蒸餾水沖洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法測(cè)定三萜含量。取烘干的菌絲粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95 %乙醇定容，在超聲波破碎儀中超聲破壁2小時(shí)后，取超聲提取液4000r/min離心lOmin， 取上清液0. IOmL于IOmL具塞試管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷卻，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm處測(cè)定吸光度，測(cè)定靈芝三萜含量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。與比較例相比產(chǎn)量增加明顯，三萜產(chǎn)量增加百分比見(jiàn)表2。實(shí)施例2
1.稱(chēng)取中藥材連翹5g，加入6倍重量的水浸泡Ih后，先用武火加熱至沸騰，再用文火保持沸騰狀態(tài)30min，倒出提取液，補(bǔ)加5倍重量冷水于藥渣中，再煮沸20min，倒出提取液。將兩次提取液過(guò)濾，合并濾液并濃縮后，將濃縮液置于50mL容量瓶中定容，按照生藥量計(jì)算，得到濃度為lOOmg/mL的連翹提取液。按照上述方法制備50mL濃度為200mg/mL的連翹提取液。2.分別用50ml不同濃度的連翹提取液部分代替水配制IOOml PDA培養(yǎng)基，則所配制的PDA培養(yǎng)基中連翹的生藥量分別為50mg/mL、100mg/mL。每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)。115°C 滅菌30分鐘。分別以10%接種量接入靈芝液體菌種，28°C，150r/min培養(yǎng)7天。3.發(fā)酵結(jié)束后，用銅濾網(wǎng)收集菌絲球，并用蒸餾水沖洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法測(cè)定三萜含量。取烘干的菌絲粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95 %乙醇定容，在超聲波破碎儀中超聲破壁2小時(shí)后，取超聲提取液4000r/min離心lOmin， 取上清液0. IOmL于IOmL具塞試管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷卻，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm處測(cè)定吸光度，測(cè)定靈芝三萜含量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。三萜產(chǎn)量增加百分比見(jiàn)表2。實(shí)施例31.稱(chēng)取中藥材澤瀉10g，加入6倍重量的水浸泡Ih后，先用武火加熱至沸騰，再用文火保持沸騰狀態(tài)30min，倒出提取液，補(bǔ)加5倍重量冷水于藥渣中，再煮沸20min，倒出提取液。將兩次提取液過(guò)濾，合并濾液并濃縮后，將濃縮液置于50mL容量瓶中定容，按照生藥量計(jì)算，得到濃度為200mg/mL的澤瀉提取液。2.用50mL濃度為200mg/mL的澤瀉提取液部分代替水配制IOOmLPDA培養(yǎng)基，則所配制的PDA培養(yǎng)基中澤瀉的生藥量為100mg/mL。樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)。115°C滅菌30分鐘。 以10%接種量接入靈芝液體菌種，28°C，150r/min培養(yǎng)7天。3.發(fā)酵結(jié)束后，用銅濾網(wǎng)收集菌絲球，并用蒸餾水沖洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法測(cè)定三萜含量。取烘干的菌絲粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95%乙醇定容，在超聲波破碎儀中超聲破壁2小時(shí)后，取超聲提取液4000r/min離心lOmin， 取上清液0. IOmL于IOmL具塞試管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷卻，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm處測(cè)定吸光度，測(cè)定靈芝三萜含量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。三萜產(chǎn)量增加百分比見(jiàn)表2。實(shí)施例41.稱(chēng)取中藥材黃芪5g，加入6倍重量的水浸泡Ih后，先用武火加熱至沸騰，再用文火保持沸騰狀態(tài)30min，倒出提取液，補(bǔ)加5倍重量冷水于藥渣中，再煮沸20min，倒出提取液。將兩次提取液過(guò)濾，合并濾液并濃縮后，將濃縮液置于50mL容量瓶中定容，按照生藥量計(jì)算，得到濃度為lOOmg/mL的黃芪提取液。2.用50mL濃度為100mg/mL的黃芪提取液部分代替水配制IOOml PDA培養(yǎng)基，則所配制的PDA培養(yǎng)基中黃芪的生藥量分別為50mg/mL。每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)。115°C滅菌 30分鐘。分別以10%接種量接入靈芝液體菌種，28°C，150r/min培養(yǎng)7天。3.發(fā)酵結(jié)束后，用銅濾網(wǎng)收集菌絲球，并用蒸餾水沖洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法測(cè)定三萜含量。取烘干的菌絲粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95%乙醇定容，在超聲波破碎儀中超聲破壁2小時(shí)后，取超聲提取液4000r/min離心lOmin，取上清液0. IOmL于IOmL具塞試管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷卻，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm處測(cè)定吸光度，測(cè)定靈芝三萜含量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。三萜產(chǎn)量增加百分比見(jiàn)表2。實(shí)施例51.稱(chēng)取中藥材酸棗仁10g，加入6倍重量的水浸泡Ih后，先用武火加熱至沸騰，再用文火保持沸騰狀態(tài)30min，倒出提取液，補(bǔ)加5倍重量冷水于藥渣中，再煮沸20min，倒出提取液。將兩次提取液過(guò)濾，合并濾液并濃縮后，將濃縮液置于50mL容量瓶中定容，按照生藥量計(jì)算，得到濃度為200mg/mL的酸棗仁提取液。2.用50mL濃度為200mg/mL的酸棗仁提取液部分代替水配制IOOmLPDA培養(yǎng)基，則所配制的PDA培養(yǎng)基中酸棗仁的生藥量為100mg/mL。樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)。115°C滅菌30分鐘。以10%接種量接入靈芝液體菌種，28°C，150r/min培養(yǎng)7天。3.發(fā)酵結(jié)束后，用銅濾網(wǎng)收集菌絲球，并用蒸餾水沖洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法測(cè)定三萜含量。取烘干的菌絲粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95%乙醇定容，在超聲波破碎儀中超聲破壁2小時(shí)后，取超聲提取液4000r/min離心lOmin， 取上清液0. IOmL于IOmL具塞試管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷卻，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm處測(cè)定吸光度，測(cè)定靈芝三萜含量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。三萜產(chǎn)量增加百分比見(jiàn)表2。比較例1.配制IOOmL PDA培養(yǎng)基，設(shè)三個(gè)重復(fù)。115°C滅菌30分鐘。以10%接種量接入靈芝液體菌種，28°C，150r/min培養(yǎng)7天。2.發(fā)酵結(jié)束后，用銅濾網(wǎng)收集菌絲球，并用蒸餾水沖洗5 6次，于60°C烘箱中烘干至恒重，分光光度法測(cè)定三萜含量。取烘干的菌絲粉0. 50g左右，置于25mL容量瓶中加 95%乙醇定容，在超聲波破碎儀中超聲破壁2小時(shí)后，取超聲提取液4000r/min離心lOmin， 取上清液0. IOmL于IOmL具塞試管中，依次加入香草醛0. 20mL,高氯酸0. 50mL,混勻，60°C 水浴20min，取出立即冷卻，加入5. OOmL冰醋酸，混勻后于550nm處測(cè)定吸光度，測(cè)定靈芝三萜含量。測(cè)得靈芝三萜產(chǎn)量為0. 07g/L。表1添加不同種類(lèi)不同用量中藥提取液的培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝菌絲體時(shí)三萜產(chǎn)量
權(quán)利要求
1.一種提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法，其特征在于在靈芝菌絲體液體發(fā)酵時(shí)，采用含中藥提取物的培養(yǎng)基進(jìn)行靈芝菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法，其特征在于包括以下步驟(1)稱(chēng)取中藥材，制備中藥提取物；(2)向PDA培養(yǎng)基中加入步驟1制備的中藥提取物，制備含有中藥提取物的PDA培養(yǎng)基；(3)向步驟( 制備的含有中藥提取物的PDA培養(yǎng)基中接入靈芝菌種，菌種接種量為 5% 15% ；在溫度28 30°C，轉(zhuǎn)速120 150r/min條件下，搖床培養(yǎng)7 10d。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法，其特征在于所述的中藥提取物的制備方法為稱(chēng)取中藥材，加4 10倍量的水浸泡0. 5 池后，加熱煮沸提取2 3次，每次提取時(shí)間為15 40min，過(guò)濾，合并濾液并濃縮濾液后，將濃縮液置于容量瓶中定容，得到中藥提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法，其特征在于步驟 ⑵中按生藥量計(jì)算，所述PDA培養(yǎng)基中中藥材的添加量為50 800mg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 3所述的提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法，其特征在于用于制備所述中藥提取物的中藥材為板藍(lán)根、連翹、澤瀉、黃芪或酸棗仁。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法，其特征在于所述的中藥材為板藍(lán)根、連翹或酸棗仁。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法，其特征在于按生藥量計(jì)算，板藍(lán)根添加量為50 800mg/mL，連翹添加量為50 100mg/mL，澤瀉添加量為 100mg/mL，黃芪添加量為50mg/mL，酸棗仁添加量為100mg/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用中藥提取物提高靈芝液體發(fā)酵菌絲體三萜產(chǎn)量的方法。本發(fā)明靈芝菌絲體的培養(yǎng)采用液體培養(yǎng)，在靈芝菌絲體液體發(fā)酵時(shí)，采用含中藥提取物的培養(yǎng)基進(jìn)行靈芝菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)。將不同濃度的中藥提取液(如板藍(lán)根、連翹、澤瀉、黃芪、酸棗仁)加入靈芝液體培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)，培養(yǎng)后測(cè)定靈芝菌絲體三萜產(chǎn)量顯著提高。本方法具有成本低，無(wú)污染，易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K36/074GK102488719SQ201110439918
公開(kāi)日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月25日
發(fā)明者任昂, 師亮, 李夢(mèng)嬌, 林龍, 穆大帥, 趙明文 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)