專利名稱：確定人april基因啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種確定人APRIL基因啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的方法及用途。
背景技術(shù)：
在世界范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌在癌癥引起死亡病例中排第三位。近幾年，結(jié)直腸癌在亞洲和東歐國(guó)家的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。APRIL在1998年克隆并鑒定。APRIL除了在結(jié)直腸癌和淋巴瘤和黑色素瘤細(xì)胞細(xì)胞高表達(dá)之外，在別的組織中表達(dá)水平很低，說(shuō)明APRIL具有組織特異性。前面的研究發(fā)現(xiàn)，與其周圍的正常組織相比，APRIL在結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480 中高表達(dá)。我們實(shí)驗(yàn)室的研究也發(fā)現(xiàn)APRIL在結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中高表達(dá)。此外將APRIL 干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SW480結(jié)直腸癌裸鼠模型中，裸鼠體內(nèi)的的腫瘤明顯減少。以上說(shuō)明APRIL 在結(jié)直腸癌的的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。因此，了解APRIL的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)結(jié)直腸癌的治療具有重要的作用。人APRIL基因定位于染色體17pl3. 1，與小鼠11號(hào)染色體上的位置相似。APRIL 是一個(gè)典型的跨膜蛋白，N端在內(nèi)，C端在外。它是腫瘤壞死因子家族的一名成員。它通過(guò)腫瘤壞死因子的同源區(qū)域與含有半胱氨酸富集區(qū)的受體相結(jié)合。它有三個(gè)受體B細(xì)胞成熟抗原、穿膜蛋白活化物、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。APRIL與B細(xì)胞成熟抗原和穿膜蛋白活化物結(jié)合能激活經(jīng)典的NF-kB途徑，NF-kB途徑在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。APRIL 和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖結(jié)合能促進(jìn)有APRIL誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤的生長(zhǎng)。然而到，到底是哪一個(gè)受體對(duì)APRIL信號(hào)通路有直接的作用，到現(xiàn)在還不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的確定人APRIL基因啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種光輝霉素和Bayl 1-7082在制備治療人結(jié)直腸癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是—種確定人APRIL基因啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的方法，其特征是包括下列步驟(1)結(jié)構(gòu)分析APRIL啟動(dòng)子區(qū)域用生物信息學(xué)軟件分析APRIL基因5，側(cè)翼區(qū)的3500bp的基因序列，發(fā)現(xiàn)-1899 到+103的區(qū)域是APRIL的潛在啟動(dòng)子區(qū)域，PromoterScan軟件分析發(fā)現(xiàn)-1889到-1639 和-968到-718是潛在的啟動(dòng)子區(qū)域，CpG Island分析發(fā)現(xiàn)CpG島位于-222到-15區(qū)域， APRIL的5，側(cè)翼區(qū)含有大量的GC和CpG島；(2)擴(kuò)增APRIL啟動(dòng)子區(qū)域和構(gòu)建熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒采用單向缺失方法來(lái)分析APRIL 5’側(cè)翼區(qū)的2003個(gè)堿基，平截片段的5末端從-1889到-222，3，末端是+103，APRIL的4個(gè)平截片段由PCR從人基因組DNA上擴(kuò)增得到， 每個(gè)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度分別是200;3bp，1643bp, 1105bp and 407bp，然后PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶MluI和HindIII進(jìn)行雙酶切，并連接到無(wú)啟動(dòng)子活性的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-BasiC 上；把質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物組成的重組產(chǎn)物分別命名為APRIL-1889，APRIL-1539，APRIL-1001, APRIL-304,重組產(chǎn)物通過(guò)酶切和DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證；(3)功能性鑒定APRIL啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)榱髓b定哪一個(gè)片段對(duì)APRIL基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有作用，將這4個(gè)重組產(chǎn)物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞和Η ^9細(xì)胞中。質(zhì)粒pG14. 74作為內(nèi)參，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將細(xì)胞提取物用于熒光素酶活性分析，在SW480細(xì)胞APRIL-1539在所有的重組產(chǎn)物中表現(xiàn)出最強(qiáng)的熒光素酶活性，APRIL-1001和APRIL-304啟動(dòng)子的活性低于APRIL-1539，APRIL-1889 的活性最低，在HT-四細(xì)胞中具有相似的結(jié)果；再用TFSEARCH軟件來(lái)尋找該區(qū)域潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)重要的順式作用元件，NF-kB位于-1023to-1032，和Spl位于-1029to-1038 ；(4) Spl和NF-kB結(jié)合APRIL啟動(dòng)子區(qū)域用EMSA電泳遷移位移試驗(yàn)來(lái)觀察Spl和NF_kB是否結(jié)合APRIL基因的核心啟動(dòng)子區(qū)的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，生物素標(biāo)記探針與SW480細(xì)胞核提取物在室溫下孵育20分鐘后，觀察到NF-Kb和Spl生物素標(biāo)記探針與SW480DNA核蛋白相互反應(yīng)產(chǎn)生的DNA蛋白復(fù)合體，核蛋白與探針的相互作用，能分別被NF-Kb和Spl的冷凝探針競(jìng)爭(zhēng)掉，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合是特異性的；(5)轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和Spl與APRIL啟動(dòng)子之間的相互作用為了檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和Sp 1對(duì)APRIL調(diào)節(jié)的影響，分別將不同量的pcDNA3. 1/ p65或pCMV-HA/Spl與熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒APRIL-538轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，538表示APRIL基因從-1539到-1001的序列長(zhǎng)度，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，檢測(cè)熒光素酶活性，過(guò)表達(dá)NF_kB或Spl 后，APRIL啟動(dòng)子的活性明顯升高，結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和Spl能通過(guò)APRIL-538上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)激活A(yù)PRIL的轉(zhuǎn)錄。一種光輝霉素和Bayll-7082在制備治療人結(jié)直腸癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明克隆并鑒定了 APRIL的啟動(dòng)子區(qū)域。發(fā)現(xiàn)-1539到-1001的區(qū)域?qū)PRIL 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有重要的作用；這一區(qū)域內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄因子Spl或NF-kB，并且能激活A(yù)PRIL基因的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明提供了光輝霉素和Bayll-7082在制備治療人結(jié)直腸癌的藥物中的應(yīng)用， 效果確切。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。圖1是生物信息學(xué)軟件分析人APRIL基因的5’側(cè)翼區(qū)。圖上顯示了 APRIL潛在啟動(dòng)子區(qū)域和CpG島的位置。翻譯起始位點(diǎn)ATG中的“A”定為+1，其它堿基的數(shù)字都按照它來(lái)計(jì)數(shù)。圖2是驗(yàn)證重組質(zhì)粒示意圖。是用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分析酶切產(chǎn)物，M代表的是DNAmarker，泳道1_4分別代表的的重組質(zhì)粒(APRIL-1889，APRIL-1539，APRIL-1001, APRIL-304)用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化。圖3是APRIL-1889的測(cè)序結(jié)果。圖4是功能性分析人APRIL基因的5’側(cè)翼區(qū)示意圖。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析APRIL啟動(dòng)子區(qū)的各個(gè)片段，圖代表了 4個(gè)重組產(chǎn)物的相關(guān)熒光素酶活性與無(wú)啟動(dòng)子活性PGL3-BasiC質(zhì)粒熒光素酶活性的比值。用于檢測(cè)的APRIL區(qū)域分別是 APRIL-1889 (_1889to+103)，APRIL-1539 (_1539to+103)，APRIL-1001 (-1001to+103)。 所有的數(shù)據(jù)都是三次實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤。圖5是APRIL啟動(dòng)子區(qū)域從-1539到-1001的核苷酸序列。下劃線表示潛在轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。圖6是NF-kB和Spl與APRIL啟動(dòng)子區(qū)上它們結(jié)合位點(diǎn)的相互作用示意圖。EMSA顯示NF-kB和Spl結(jié)合APRIL啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。泳道1和 6，只加了標(biāo)記探針；，泳道2和7，核提取物+標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)探針(野生型探針)；泳道3和8， 核提取物+標(biāo)記的突變探針；泳道4和9，核提取物+標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)探針+未標(biāo)記的冷凝探針 (競(jìng)爭(zhēng)探針)；泳道5和10，核提取物+標(biāo)記的突變探針+未標(biāo)記的冷凝探針(競(jìng)爭(zhēng)探針)。 NE 核提取物；WT 野生型探針；MT 突變探針；NS 非特異性結(jié)合；COM 競(jìng)爭(zhēng)探針。圖7是NF-kB和Spl對(duì)APRIL-538的影響示意圖。將0. 2ug的APRIL-538和不同量的pcDNA3. 1/p65, ρCMV-HA/SP及其相應(yīng)的空載體分別轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞。結(jié)果是與空載體轉(zhuǎn)染組的比值。質(zhì)粒PG14.74做為內(nèi)參。所有的數(shù)據(jù)都是三次實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤。圖8是抑制劑對(duì)APRIL-538的影響示意圖。將APRIL-538轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，各自與不同濃度的藥物作用M小時(shí)。結(jié)果是與沒(méi)加藥物組的比值。所有的數(shù)據(jù)都是三次實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤。
具體實(shí)施例方式細(xì)胞培養(yǎng)含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基單層培養(yǎng)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株，于37°C，5% C02飽和濕度恒溫孵育箱內(nèi)，0. 25%胰酶消化傳代。以細(xì)胞數(shù)2X IO6個(gè)/ml傳代6孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90%以上時(shí)，按脂質(zhì)體2000說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效^ ο啟動(dòng)子區(qū)及轉(zhuǎn)錄因子分析以APRIL基因5，側(cè)翼區(qū)3. 5kb作為研究對(duì)象，用潛在啟動(dòng)子預(yù)測(cè)用軟件i^romoter 2.OPrediction Server (http//www. cbs. dtu. dk/services/Promoter/)和Promoter Scan program(http: //www-bimas. cit. nih. gov/molbio/proscan/)進(jìn)行分析。CpG 島用 CpG Islmd karcher(http://cpgislmds.usc. edu/)進(jìn)行查找。啟動(dòng)子區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄因子用 TF search program (http://molsunl. cbrc. aist. go. jp/research/db/TFSEARCH. html)進(jìn)行分析?？寺∪薃PRIL基因的5，側(cè)翼區(qū)基因組DNA用人基因組DNA抽提試劑盒(凱杰，美國(guó))從人全血中抽提。以人基因組DNA為模板，用基因特異性引物，PCR擴(kuò)增得到不同長(zhǎng)度的APRIL啟動(dòng)子片段。利用引物設(shè)計(jì)軟件I^rimer 5. 0按疊瓦方式在5’側(cè)翼序列設(shè)計(jì)4個(gè)片段的引物，由上海生工合成，引物序列(表 1)。PCR用 25“1^反應(yīng)體系，941預(yù)熱51^11后，941 30sec、55°C 30sec、72°C 2min 30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物APRIL-1899 (核苷酸計(jì)數(shù)以翻譯起始點(diǎn)ATG的A作為 +1)、APRIL-1539、APRIL-1001、APRIL-304 用膠回收試劑盒進(jìn)行回收，與 PMD18-T 載體 16°C 連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，涂布于經(jīng)2% X-gal和20% IPTG處理的含75μ g/ml氨芐青霉素的LB平皿上，37°C培養(yǎng)12 16h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，白色菌落經(jīng) PCR初步鑒定，陽(yáng)性克隆進(jìn)一步測(cè)序分析(由上海生工生物工程公司完成)。將篩選出的陽(yáng)性菌株擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒。得到的質(zhì)粒和空載pGL3kiSiC分別用HindIII和Mlu I雙酶切，電泳后回收。回收的酶切片段和載體PGL3kiSiC用T4DNA連接酶于16°C過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，涂布LB平板過(guò)夜培養(yǎng)菌體，從平板上挑選菌落，擴(kuò)增，用質(zhì)粒抽提試劑盒(凱杰，美國(guó))提取質(zhì)粒，酶切和測(cè)序(上海生工生物工程公司)鑒定。
表1.擴(kuò)增APRIL基因5’側(cè)翼轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的引物序列
擴(kuò)增產(chǎn)物引物序列
F: 5'ACGACGCGTCTTGCTGGTGGATGGTGTGCT3‘ R: 5 'CCCAAGCTTAACTCAACCAGAGGGCAACT3 ‘ F: 5'GCGACGCGTCCATCCCACATAAATACAG3‘ R: 5 'CCCAAGCTTAACTCAACCAGAGGGCAACT3 ‘ F 5 'TCGACGCGTGAGCAGAGGTAGGAAGGCACACT3 ‘ R: 5 'CCCAAGCTTAACTCAACCAGAGGGCAACT3 ‘
F: 5’ACTACGCGTTGTTCCTCCTGGGTGTCACT3’ R: 5 'CCCAAGCTTAACTCAACCAGAGGGCAACT3 ‘ F: 5' GCGACGCGTCC ATCCC AC ATAAATAC AG3 ’ R: 5 'CATAAGCTTCCACCTGGGGGCTGGAGGCA3 ’上游引物加MluI限制性酶切位點(diǎn)，下游引物加HindIII限制性酶切位點(diǎn)(下劃線部分。F:上游引物，R 下游引物。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和熒光素酶活性分析用質(zhì)粒中抽試劑盒(凱杰，美國(guó))抽提質(zhì)粒。將人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480細(xì)胞以 2 X IO5濃度接種M孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80 % -90 %時(shí)，分別用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒，同時(shí)轉(zhuǎn)染的有陽(yáng)性對(duì)照pGL3Control、陰性對(duì)照pGL3-BasiC、內(nèi)參pG14. 74質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染4 后收集并裂解細(xì)胞，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。核蛋白抽提和凝膠遷移分析利用核蛋白抽提試劑(Pierce Biotechnology，美國(guó))從SW480細(xì)胞中提取核蛋白。BCA蛋白定量分析試劑盒檢測(cè)核蛋白的濃度。EMSA反應(yīng)混合物中包括1.5μ1的結(jié)合緩沖液(IOx)、1 μ 1的Poly (dl dC)和2 μ g的核蛋白?；旌衔镌谑覝叵路跤?0分鐘后，加
APRIL-1899 (-1899/+103)
APRIL-1539 (-1539/+103) APRIL-1001 (-1001/+103)
APRIL-304 (-304/+103)
APRIL-538 (-1539/-1001)入0. 5 μ 1的生物素標(biāo)記探針再孵育20分鐘。在競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中，非標(biāo)記的探針在生物素標(biāo)記探針20分鐘之前加入。將DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物加于6. 5%的聚丙烯酰胺凝膠樣品孔中，低溫下180V，電泳1.證，轉(zhuǎn)膜后紫外交聯(lián)lOmin，封閉液室溫封閉15min，然后將結(jié)合膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素反應(yīng)液孵育30min，洗膜后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯影。EMSA中用到的生物素標(biāo)記探針野生型Spl 探針5，TATTCGATCGGGGCGGGGCGAGC 3，突變型Spl 探針5，GTTCAGGCTTGGGGGCGGGGACCTCCAT 3，野生型NF-kB 探針’ GTAAGTTGAGGGGACTTTCCCAGGCCGT 3'突變型NF-kB 探針5，CTTGGGGGCGGGGACCTCCATGCCTCCA 3，.過(guò)表達(dá)NF-kB 和 Spl Spl表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HA/Spl、NF-kB p65表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1/ρ65 (由南通大學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)與pGL3-basic或APRIL-538質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞中?？蛰d體pcDNA3. 1 和pCMV-HA作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染4 后，裂解細(xì)胞用于熒光素酶活性分析。抑制NF-kB 和 Spl:轉(zhuǎn)染前M小時(shí)，將SW480細(xì)胞以2X IO5/孔接種到6孔培養(yǎng)板里面。在將APRIL-538/pGL3-basiC轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞前l(fā)h，在培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的 Bayl 1-7082和光輝霉素。24h后，測(cè)熒光素酶的活性。結(jié)果結(jié)構(gòu)分析APRIL啟動(dòng)子區(qū)域我們用了幾個(gè)生物信息學(xué)軟件分析了 APRIL基因5’側(cè)翼區(qū)的3500bp的基因序列， 發(fā)現(xiàn)-1899到+103的區(qū)域是APRIL的潛在啟動(dòng)子區(qū)域。PromoterScan軟件分析發(fā)現(xiàn)-1889 到-1639和-968到-718是潛在的啟動(dòng)子區(qū)域(圖1)。CpG Island分析發(fā)現(xiàn)CpG島位于-222到-15區(qū)域(圖1)。APRIL的5’側(cè)翼區(qū)含有大量的GC和CpG島。擴(kuò)增APRIL啟動(dòng)子區(qū)域和構(gòu)建熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒我們采用了一系列的單向缺失方法來(lái)分析APRIL 5’側(cè)翼區(qū)的2003個(gè)堿基。平截片段的5末端從-1889到-222，3，末端是+103。APRIL的4個(gè)平截片段由PCR從人基因組 DNA上擴(kuò)增得到。每個(gè)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度分別是2003bp，164;3bp，1105bp and 407bp。然后 PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶MluI和HindIII進(jìn)行雙酶切，然后連接到無(wú)啟動(dòng)子活性的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-BasiC上。把質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物組成的重組產(chǎn)物分別命名為APRIL-1889， APRIL-1539，APRIL-1001, APRIL_304(圖2)。重組產(chǎn)物通過(guò)酶切和DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證(圖 3)。功能性鑒定APRIL啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)榱髓b定哪一個(gè)片段對(duì)APRIL基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有作用，我們將這4個(gè)重組產(chǎn)物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞和Η ^9細(xì)胞中。質(zhì)粒pG14. 74作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將細(xì)胞提取物用于熒光素酶活性分析。如圖4所示，在SW480細(xì)胞APRIL-1539在所有的重組產(chǎn)物中表現(xiàn)出最強(qiáng)的熒光素酶活性。APRIL-1001和APRIL-304啟動(dòng)子的活性低于 APRIL-1539。APRIL-1889的活性最低。在HT-四細(xì)胞中具有相似的結(jié)果。根據(jù)以上的結(jié)果，我們推測(cè)-1539到-1001區(qū)域中存在重要的調(diào)節(jié)因子，這些因子能影響啟動(dòng)子的活性。 因此我們用TFSEARCH軟件來(lái)尋找該區(qū)域潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)重要的順式作用元件，NF-kB 位于-1023to-1032，和 Spl 位于-1029to-1038 (圖 5)Spl和NF-kB結(jié)合APRIL啟動(dòng)子區(qū)域我們用EMSA電泳遷移位移試驗(yàn)來(lái)觀察Spl和NF_kB是否結(jié)合APRIL基因的核心啟動(dòng)子區(qū)的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。生物素標(biāo)記探針與SW480細(xì)胞核提取物在室溫下孵育 20分鐘后，能觀察到NF-Kb和Spl生物素標(biāo)記探針與SW480DNA核蛋白相互反應(yīng)產(chǎn)生的DNA 蛋白復(fù)合體(圖6泳道2，，3，7,8)。核蛋白與探針的相互作用，能分別被NF-Kb和Spl的冷凝探針競(jìng)爭(zhēng)掉(圖6泳道4，5，9，7)，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合是特異性的。轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和Spl與APRIL啟動(dòng)子之間的相互作用為了檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和Sp 1對(duì)APRIL調(diào)節(jié)的影響，我們分別將不同量的 pcDNA3. l/p65 (NF-kB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒)或pCMV_HA/Spl (Spl過(guò)表達(dá)質(zhì)粒)與熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(APRIL-538)轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞。538表示APRIL基因從-1539到-1001的序列長(zhǎng)度。重組質(zhì)粒APRIL-538，按照前面描述的方法獲得，其中用到的引物正義鏈5’ GCGACGCGT CCATCCCACATAAATACAG 3，，反義鏈?zhǔn)?5，CATAAGCTTCCACCT GGGGGCTGGAGGCA 3，。限制性酶切位點(diǎn)MluI和HindIII用下劃線標(biāo)出來(lái)了。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，檢測(cè)熒光素酶活性。過(guò)表達(dá) NF-kB或Spl后，APRIL啟動(dòng)子的活性明顯升高。結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子NF_kB和Spl能通過(guò) APRIL-538上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)激活A(yù)PRIL的轉(zhuǎn)錄。Bayl 1-7082 和 Mithramycin A 對(duì) APRIL 最小啟動(dòng)子的影響我們用NF-kB抑制劑(Bayl 1-7082)和Spl抑制劑(MithramycinA，光輝霉素)來(lái)進(jìn)一步分析，轉(zhuǎn)錄因子和APRIL啟動(dòng)子之間的相互關(guān)系。分別加入Bayll-7082和Mithramycin A之后APRIL-538熒光素酶的活性明顯下降。結(jié)果說(shuō)明Bayll-7082和Mithramycin A能分別干擾掉NF-kB和Spl介導(dǎo)的APRIL啟動(dòng)子的活性。光輝霉素和Bayll-7082在制備治療人結(jié)直腸癌的藥物中的應(yīng)用。討論在本研究中我們克隆鑒定了人APRIL基因的5’側(cè)翼區(qū)。我們用PCR擴(kuò)增的方法獲得5’側(cè)翼區(qū)的2003bp的基因序列。這個(gè)區(qū)域缺乏標(biāo)準(zhǔn)的TATA盒，但是含有大量的GC和 CPG島(圖1)。5’平截進(jìn)一步來(lái)分析-1899到+103的序列。缺失產(chǎn)物亞克隆到pGL3-BasiC 載體上。重組質(zhì)粒被鑒定并轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞中。熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn)每一個(gè)重組質(zhì)粒與pGL3-C0ntr0l(陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒)都具有相似或者更高的熒光素酶活性。值得注意的是APRIL-1539具有最高的熒光素酶活性，而APRIL-1899的熒光素酶活性最低。結(jié)果說(shuō)明在-1889到-1539之間存在抑制因子，在-1539到-1001之間存在重要的能促進(jìn)APRIL基因轉(zhuǎn)錄的順式作用元件。因此我們用TFSEARCH軟件分析-1539到-1001啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)這個(gè)區(qū)域含有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)NF-kB和Spl。EMSA鑒定了他們的特異性結(jié)合。過(guò)表達(dá)和抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明了 NF-kB和Spl對(duì)APRIL基因的轉(zhuǎn)錄具有重要的作用。
權(quán)利要求
1.一種確定人APRIL基因啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的方法，其特征是包括下列步驟(1)結(jié)構(gòu)分析APRIL啟動(dòng)子區(qū)域用生物信息學(xué)軟件分析APRIL基因5，側(cè)翼區(qū)的3500bp的基因序列，發(fā)現(xiàn)-1899到+103 的區(qū)域是APRIL的潛在啟動(dòng)子區(qū)域，PromoterScan軟件分析發(fā)現(xiàn)-1889到-1639和-968 到-718是潛在的啟動(dòng)子區(qū)域，CpG Island分析發(fā)現(xiàn)CpG島位于-222到-15區(qū)域，APRIL 的5’側(cè)翼區(qū)含有大量的GC和CpG島；(2)擴(kuò)增APRIL啟動(dòng)子區(qū)域和構(gòu)建熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒采用單向缺失方法來(lái)分析APRIL 5’側(cè)翼區(qū)的2003個(gè)堿基，平截片段的5末端從-1889 到-222，3，末端是+103，APRIL的4個(gè)平截片段由PCR從人基因組DNA上擴(kuò)增得到，每個(gè) PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度分別是2003bp，1643bp, 1105bp and 407bp，然后PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶MluI和HindIII進(jìn)行雙酶切，并連接到無(wú)啟動(dòng)子活性的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-BasiC 上；把質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物組成的重組產(chǎn)物分別命名為APRIL-1889，APRIL-1539, APRIL-1001, APRIL-304,重組產(chǎn)物通過(guò)酶切和DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證；(3)功能性鑒定APRIL啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)榱髓b定哪一個(gè)片段對(duì)APRIL基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有作用，將這4個(gè)重組產(chǎn)物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞和HD9細(xì)胞中；質(zhì)粒pG14. 74作為內(nèi)參，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將細(xì)胞提取物用于熒光素酶活性分析，在SW480細(xì)胞APRIL-1539在所有的重組產(chǎn)物中表現(xiàn)出最強(qiáng)的熒光素酶活性，APRIL-1001和APRIL-304啟動(dòng)子的活性低于APRIL-1539，APRIL-1889的活性最低，在HT-四細(xì)胞中具有相似的結(jié)果；再用TFSEARCH軟件來(lái)尋找該區(qū)域潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)重要的順式作用元件，NF-kB位于-1023 to -1032，和Spl位于-1029 to -1038 ；(4)Spl和NF-kB結(jié)合APRIL啟動(dòng)子區(qū)域用EMSA電泳遷移位移試驗(yàn)來(lái)觀察Spl和NF-kB是否結(jié)合APRIL基因的核心啟動(dòng)子區(qū)的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，生物素標(biāo)記探針與SW480細(xì)胞核提取物在室溫下孵育20分鐘后，觀察到NF-Kb和Spl生物素標(biāo)記探針與SW480 DNA核蛋白相互反應(yīng)產(chǎn)生的DNA蛋白復(fù)合體，核蛋白與探針的相互作用，能分別被NF-Kb和Spl的冷凝探針競(jìng)爭(zhēng)掉，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合是特異性的；(5)轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和Spl與APRIL啟動(dòng)子之間的相互作用為了檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和Spl對(duì)APRIL調(diào)節(jié)的影響，分別將不同量的pcDNA3. 1/ p65或pCMV-HA/Spl與熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒APRIL-538轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，538表示APRIL基因從-1539到-1001的序列長(zhǎng)度，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，檢測(cè)熒光素酶活性，過(guò)表達(dá)NF-kB或Spl 后，APRIL啟動(dòng)子的活性明顯升高，結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和Spl能通過(guò)APRIL-538上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)激活A(yù)PRIL的轉(zhuǎn)錄。
2.一種光輝霉素和Bayll-7082在制備治療人結(jié)直腸癌的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種確定人APRIL基因啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的方法及用途，本發(fā)明克隆并鑒定了APRIL的啟動(dòng)子區(qū)域。發(fā)現(xiàn)-1539到-1001的區(qū)域?qū)PRIL的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有重要的作用；這一區(qū)域內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄因子Sp1或NF-kB，并且能激活A(yù)PRIL基因的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明提供了光輝霉素和Bay11-7082在制備治療人結(jié)直腸癌的藥物中的應(yīng)用，效果確切。
文檔編號(hào)A61K31/704GK102533996SQ20121000052
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月4日
發(fā)明者季伙燕, 徐錦, 景蓉蓉, 王惠民 申請(qǐng)人:南通大學(xué)附屬醫(yī)院