專利名稱：由一種位置異構(gòu)體表示的穩(wěn)定的干擾素α聚乙二醇綴合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物，即涉及干擾素的生理活性綴合物，特別涉及干擾素與聚こニ醇(PEG)的新穎綴合物，其可用于醫(yī)藥，例如用于治療病毒、免疫和腫瘤疾病。
背景技術(shù)：
干擾素(IFN)是ー組生物活性蛋白質(zhì)或糖蛋白，其由多種細(xì)胞對(duì)病毒感染應(yīng)答而生產(chǎn)，或者因某種化學(xué)和生物物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的影響而產(chǎn)生(Isaacs & Lindeman, 1957 ；Pestka等人，2007)。IFN與細(xì)胞受體的綴合導(dǎo)致多種介導(dǎo)抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗增殖IFN效應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)蛋白的誘導(dǎo)(Pestka等人,2004 ；Bekisz, 2004)。不同的人類IFN基因被克隆并在細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，因此已產(chǎn)生多種重組IFN(Pestka等人，2004 ;Pestka，2007)。包含重組IFN的藥物用于臨床實(shí)踐以治療多種病毒、腫瘤和免疫疾病(Pestka 等人,2004 ;Chevaliez & Pawlotsky, 2009)。目前，基于干擾素的藥物用于臨床實(shí)踐以治療多種病毒、腫瘤和免疫疾病(Pestka等人，2004)。IFN藥物最廣泛地用于治療病毒性肝炎(Chevaliez & Pawlotsky，2009)，該病是最嚴(yán)重的社會(huì)問題之一。如今全世界約有3. 5億病人被こ型肝炎病毒慢性感染，并有
I.7億病人被丙型肝炎慢性感染(MarCellin，2009)。丙型肝炎在大多數(shù)情況下呈現(xiàn)慢性病程，其導(dǎo)致嚴(yán)重后果ー肝硬化和肝細(xì)胞癌(Modi & Liang，2008)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，從1961年起慢性肝炎和肝硬化作為美國和西歐國家中的死因從第10位提高到第5位(Marce11 in,2009)。包含IFN的藥物普遍用于治療白血病和實(shí)體瘤，包括復(fù)發(fā)性黑色素瘤(Bukowski等人，2002 ；Decantris 等人，2002 ；Qintas-Cardama 等人，2006)。包含天然IFN的藥物的效カ受皮下組織快速吸收、大體積分布、相對(duì)低的穩(wěn)定性、短半衰期、高免疫原性和毒性的限制(Wills，1990)。因此，施用之后幾小時(shí)內(nèi)，觀察到血漿中IFN濃度快速下降，且注射24小時(shí)后血漿中已不能檢測(cè)到干擾素(Chatelut等人，1999)。干擾素濃度的快速下降導(dǎo)致病毒復(fù)制繼續(xù)和病毒顆粒濃度升高(Lam等人，1997)。因此，需要經(jīng)常注射干擾素以達(dá)到血漿中的有效治療濃度，導(dǎo)致劑量依賴的副作用。因此使用IFN-α 2b的慢性丙型肝炎(CHC)的單ー療法在12個(gè)月中僅在15_20%的病人中引起持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答，而在具有基因型Ib和高病毒負(fù)載的病人中完全沒有觀察到藥物效力(McHutchinson 等人，1998)。
當(dāng)使用持續(xù)釋放藥物特別是PEG化IFN時(shí)，IFN的治療效カ可得到增強(qiáng)(Manns等人，2001 ；Hadziyannis等人，2004 ；Zeuzem等人，2001)。PEG化IFN由干擾素分子與聚合物化學(xué)綴合產(chǎn)生，所述聚合物例如由環(huán)氧こ烷的重復(fù)殘基組成的單甲氧基聚こニ醇(MPEG)，其在一端具有甲氧基，在另一端具有羥基。MPEG分子可具有不同的分子量和立體化學(xué)結(jié)構(gòu)(線型或分枝型)。對(duì)于PEG化反應(yīng)，MPEG末端的羥基由多種反應(yīng)功能基團(tuán)活化?；罨腗PEG可在ー個(gè)或多個(gè)位置共價(jià)綴合蛋白質(zhì),取決于活化基團(tuán)的性質(zhì)和反應(yīng)條件(Zalipsky& Hurris, 1997 ；Roberts 等人，2002)IFN的PEG化導(dǎo)致更好的藥代動(dòng)力學(xué)、延長的半衰期、減少的血液濃度波動(dòng)、降低的免疫原性和毒性、升高的體內(nèi)活性(體外活性降低)；提高的穩(wěn)定性(Glue等人，2000;Reddy 等人,2001)。體外系統(tǒng)中的降低活性取決于PEG分子量。綴合分子量彡5000Da的小PEG分子引起體外活性的微小變化(Grace等人，2005)。包含如此質(zhì)量PEG的PEG化蛋白與未修飾蛋白的藥效和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)難以區(qū)分。綴合更高分子量的PEG由于無效綴合受體導(dǎo)致體外生物學(xué)活性的顯著降低，但在此情況下可見PEG化蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效性質(zhì)明顯提高(Delgado等人，1992),導(dǎo)致體內(nèi)生物學(xué)活性升高(Bailon & Berthold, 1998)。PEG結(jié)構(gòu)也影響生物學(xué)活性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，綴合線型PEG比綴合分枝型PEG結(jié)構(gòu)具有更大的分布體積(Caliceti 等人,2003)。PEG-IFN綴合物的抗病毒活性和生物學(xué)性質(zhì)還取決于使用不同的活化MPEG，因?yàn)槠涔δ芑鶊F(tuán)隨修飾不同蛋白質(zhì)氨基酸殘基的能力以及與蛋白質(zhì)形成的化學(xué)鍵類型而變化(Roberts等人,2002)。能夠與蛋白質(zhì)的自由氨基綴合的活化MPEG最廣泛地用于蛋白質(zhì)的PEG化(琥珀酰亞胺碳酸酯、琥珀酰亞胺琥珀酸酷、trisilate、三嗪、羥基琥珀酰亞胺酷、縮醛等等)。目前已知下列PEG-IFN綴合物。已知ー種PEG-IFN-a 2a綴合物，其中線型PEG分子量為l_5000Da (美國專利5，382，657，1995)。MPEGこニ醇衍生物用于綴合，該反應(yīng)在pH = 10在室溫下進(jìn)行O. 5-4小吋。3倍過量的PEG用于IFN的PEG化反應(yīng)。在使用的條件中，PEG與IFN的結(jié)合通過不同賴氨酸(Lys-31、Lysl33> Lysl34> Lys23> Lysl31> Lysl21> Lys70> Lys83> Lys49 和Lysll2)的自由氨基的空間可進(jìn)入性與碳酰胺鍵的形成而發(fā)生(Monkarsh等人，1997)。因此，PEG-IFN-α 2a由得到的PEG-IFN-a 2a綴合物的位置異構(gòu)體的混合物組成，其中每個(gè)異構(gòu)體包含單個(gè)PEG。與未修飾IFN比較，異構(gòu)體的抗病毒比活性范圍在6% (對(duì)于Lysl 12)到40% (對(duì)于Lysl33)。由11個(gè)異構(gòu)體組成的所得綴合物的總比活性為未修飾IFN的34%。這些綴合物的體外活性也取決于PEG的分子量，范圍在45% (對(duì)于2500Da PEG)到25% (對(duì)于IOOOODa PEG)。得到的綴合物的缺點(diǎn)如下I.使用こニ醇活化的低分子量(彡5000Da)MPEG。結(jié)果PEG-IFN綴合物與未修飾IFN的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)僅有微小差異。因此該綴合物未進(jìn)入臨床試驗(yàn)；2.由于PEG通過不同賴氨酸的自由氨基與IFN分子綴合，形成大量具有不同比活性的位置異構(gòu)體。已知由天然IFN-a 2b與分子量13 000_17000Da的線型(俄羅斯專利2311930，2004)或分枝型(俄羅斯專利2382048，2008) MPEG衍生物綴合獲得的PEG-IFN-a 2b綴合物。該反應(yīng)使用50-100倍摩爾過量的活化PEG在pH 9. 5進(jìn)行60小時(shí)(對(duì)于線型MPEG)或者在pH 7. 5進(jìn)行12小時(shí)(對(duì)于分枝型MPEG)。結(jié)果獲得了 PEG-IFN綴合物，其總抗病毒活性為未修飾IFN活性的29到38%之間。沒有關(guān)于綴合物穩(wěn)定性、位置異構(gòu)體數(shù)量及其抗病毒比活性的數(shù)據(jù)。這些綴合物的缺點(diǎn)如下I.使用活化MPEG的三氟こ基磺酸單甲氧基(tresylate)衍生物，其在水溶液中的半衰期少于20分鐘。以前曾顯示在PEG的三氟こ基磺酸酯衍生物與蛋白質(zhì)的反應(yīng)中，除了通過氨基的穩(wěn)定酰胺鍵之外，還形成了不穩(wěn)定的氨基磺酸酯鍵(Gais & Ruppert, 1995)；2.三氟こ基磺酸單甲氧基活化的PEG與蛋白質(zhì)的結(jié)合通過所有空間可進(jìn)入的賴氨酸的自由氨基完成(Roberts等人，2002)，其導(dǎo)致多種位置異構(gòu)體的形成；3.在高pH值(pH = 10)長時(shí)間(60小時(shí))進(jìn)行IFN的PEG化反應(yīng)可改變IFN結(jié)構(gòu)；4. IFN的PEG化反應(yīng)中顯著過量的活化PEG (PEG/蛋白質(zhì)的摩爾比為50-100/1)導(dǎo)致獲得廣品的聞成本；
已知由天然IFN- a 2b與分子量7500-35 OOODa的分枝型三嗪衍生物MPEG綴合獲得的ー種PEG-IFN- a 2b綴合物(俄羅斯專利2298560，2004)，其總抗病毒活性相當(dāng)于未修飾IFN活性的6. 4%。沒有關(guān)于綴合物穩(wěn)定性、位置異構(gòu)體數(shù)量及其抗病毒比活性的數(shù)據(jù)。獲得的綴合物的缺點(diǎn)如下I.使用活化MPEG的氯化三嗪衍生物，其能夠與除了自由氨基之外的其它氨基酸ー絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酸和組氨酸的官能團(tuán)綴合，導(dǎo)致出現(xiàn)多種異構(gòu)體，其中某些具有不穩(wěn)定的鍵。另外，現(xiàn)在因?yàn)楦叨拘远皇褂萌貉苌?Veronese & Pasut, 2005)；2.所述PEG-IFN綴合物的比活性低。已知由IFN- a 2a與分子量40kDa的分枝型PEG綴合獲得的ー種PEG-IFN- a 2a綴合物(俄羅斯專利2180595，1997)。對(duì)于綴合，使用MPEG的ー種N-羥基琥珀酰亞胺酷衍生物，其選擇性地與蛋白質(zhì)的可用自由氨基反應(yīng)以形成穩(wěn)定的酰胺鍵。該反應(yīng)以3 I的MPEG/蛋白質(zhì)比例在pH 9、4°C進(jìn)行2小吋。該反應(yīng)被終止且獲得的綴合物通過吸附劑Fractogel EMD CM 650 (M)純化。純化綴合物的產(chǎn)率為40-45 %。在這種情況下，獲得的IFN-PEG綴合物由6種位置異構(gòu)體組成，其中每種都通過賴氨酸-LyS31、LyS121、LyS 131、Lys 134、Lys 70和Lys 83的自由氨基通過穩(wěn)定鍵與ー個(gè)PEG分子綴合(Vailon等人，2001 ;Foser等人，2003)。通過位置31、121、131和134的賴氨酸與PEG綴合的異構(gòu)體占全部綴合物的94%。由6種位置異構(gòu)體組成的全部綴合物的活性為天然IFN- a 2a的1_7%(Bailon等人，2001 ;Boulestin等人，2006)。盡管在體外抗病毒活性低，該綴合物與未修飾IFN相比較具有改良的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(Silva等人，2006，Boulestin等人，2006)，目前以商品名 “ Pegasy s ” 出售(由 “ Hoffmann-La Roche” 生產(chǎn))。獲得的綴合物的缺點(diǎn)如下I.使用N-羥基琥珀酰亞胺酯活化的PEG導(dǎo)致與所有空間可進(jìn)入的氨基綴合，結(jié)果獲得的綴合物是6種比活性不同的異構(gòu)體的混合物。2.獲得的綴合物的體外抗病毒活性低。本發(fā)明的原型是美國專利5，951，974，1999中描述的PEG-IFN-a 2b綴合物。琥珀酰亞胺碳酸酯基團(tuán)活化的分子量5000到12 OOODa的線型MPEG(SC-MPEG)用于PEG化反應(yīng)。根據(jù)所述方法獲得了與分子量12kDa的PEG綴合的IFN，目前其以商品名“PegIntron”出售用于治療病毒性肝炎(“Schering-Plough”,美國)。發(fā)現(xiàn)所述PEG-IFN- a 2b綴合物(藥物“Peglntron” )由13種位置異構(gòu)體組成，其中姆種都包含ー個(gè)與蛋白質(zhì)分子的多個(gè)部分綴合的PEG分子(Wang等人2000 ；Grace等人,2001 ;Youngster等人,2002)。據(jù)顯示PEG分子與干擾素綴合不僅通過自由氨基賴氨酸(Lys31> Lys 49、Lys 83、Lys 121、Lys 131、Lys 133、Lys 134 H Lys 164)和(Cysl),而且通過組氨酸咪唑環(huán)(His7、 His34)、酪氨酸(Tyrl29)和絲氨酸OH基團(tuán)(Serl63)。單個(gè)異構(gòu)體的含量在O. 8% (Tyrl29)到47% (His34)之間變化。由13種位置異構(gòu)體組成的Peglntron的抗病毒活性為天然蛋白質(zhì)的28%。單個(gè)異構(gòu)體的比活性為天然IFN-a 2b的11%到37%之間(Youngster等人，2002)。通過His34與PEG綴合的主要異構(gòu)體具有最高的比活性(天然蛋白質(zhì)的37% )。IFN的自由氨基與PEG通過穩(wěn)定鍵綴合，而在約占47%的主要異構(gòu)體中，PEG與組氨酸咪唑環(huán)(His34)通過不穩(wěn)定的(在水溶液中)氨基甲酸酯鍵綴合(Roberts等人,2002)。所述綴合物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)優(yōu)于未修飾的IFN(Silva等人，2006)。獲得的綴合物的缺點(diǎn)如下I.使用琥珀酰亞胺碳酸酯活化的PEG不僅綴合IFN的自由氨基，還綴合其它氨基酸的官能團(tuán)。結(jié)果獲得的綴合物由13種抗病毒比活性不同的位置異構(gòu)體的混合物組成；2.在所述PEG-IFN綴合物的主要(His_34)異構(gòu)體中形成不穩(wěn)定的咪唑-碳酸酯(氨基甲酸酷)鍵導(dǎo)致的事實(shí)是“Pegintron”施用之后所述綴合物水解釋放天然IFN并發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。因此，藥物“Pegintron”最好視為前體藥物，其注射之后水解形成活性干擾素(Foster，2004)。由于所述PEG-IFN綴合物在溶液中的不穩(wěn)定性，“PegintronIU-R以凍干粉形式儲(chǔ)存。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目標(biāo)是獲得一種新穎的穩(wěn)定的PEG化的IFN，其具有IFN-α的活性，由一種位置異構(gòu)體組成，具有改良的穩(wěn)定性，具有降低的免疫原性，改良的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，具有PEG分子量與綴合物抗病毒活性的最優(yōu)組合，適合醫(yī)用，以及基于所述PEG-IFN綴合物的藥用組合物。通過構(gòu)建一種新穎的具有干擾素α活性的功能活性PEG-IFN綴合物解決了上述問題，其中分子量10 000到40 OOODa的PEG線型分子嚴(yán)格通過N端半胱氨酸的α氨基通過穩(wěn)定鍵與IFN-α分子結(jié)合，產(chǎn)生具有如下結(jié)構(gòu)式(I)的化合物
權(quán)利要求
1.穩(wěn)定的PEG化的干擾素α綴合物，在式(I)中表示，為單一位置異構(gòu)體 CH3|o-CH2-CH2^-0-|cH2j~NaII IFN
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物，其中m= 4。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物，其中干擾素a為天然或重組干擾素a_2b。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物，其中聚乙二醇的平均分子量為10到40kDa。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的綴合物，其中N端基團(tuán)由半胱氨酸殘基(Cys)表示。
6.藥用組合物，具有抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)活性，包含有效量的通式(I)的綴合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥用組合物，用于治療病毒和腫瘤疾病，以及與原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷相關(guān)的疾病。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥用組合物，其中所述病毒疾病為乙型肝炎或丙型肝炎。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥用組合物，其中所述腫瘤疾病為髓性白血病。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥用組合物，其中所述腫瘤疾病為黑色素瘤。
11.包含式(I)的綴合物的藥用制劑，具有抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)活性。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥用制劑，包含緩沖液、等滲劑、穩(wěn)定劑和水。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥用制劑，包含三水合乙酸鈉、乙酸、氯化鈉、聚山梨醇酯 80、EDTA、注射用水。
14.式(I)的綴合物在制備具有抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)活性的藥用產(chǎn)品中的應(yīng)用。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，用于制備具有抗乙型肝炎或丙型肝炎的抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)活性的藥用產(chǎn)品。
16.通過引入有效治療量的式(I)的綴合物預(yù)防和/或治療病毒疾病。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的預(yù)防和/或治療，其中所述病毒疾病為乙型肝炎或丙型肝炎。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的預(yù)防和/或治療，另外引入有效治療量的利巴韋林。
19.通過引入有效治療量的式(I)的綴合物預(yù)防和/或治療與原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷狀態(tài)相關(guān)的疾病。
20.通過引入有效治療量的式(I)的綴合物預(yù)防和/或治療腫瘤疾病。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的預(yù)防和/或治療，其中所述腫瘤疾病為髓性白血病。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的預(yù)防和/或治療，其中所述腫瘤疾病為黑色素瘤。
23.容器，使用之前在無菌環(huán)境中密封并適當(dāng)儲(chǔ)存，包含根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥用組合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的容器，其中所述容器為載藥注射器、小瓶或自動(dòng)注射器。
25. —套產(chǎn)品,包含根據(jù)權(quán)利要求 24所述的容器和處方信息。
全文摘要
本發(fā)明涉及制藥業(yè)和醫(yī)藥，特別涉及新穎的PEG-干擾素衍生物，以及發(fā)現(xiàn)一種新穎的功能活性的高度穩(wěn)定的干擾素聚乙二醇綴合物，其通式為其中n-從227到10 000的整數(shù)值，因此PEG的分子量為約10 000-40 000Da；m-≥4的整數(shù)；IFN-具有IFNα活性的天然或重組多肽本發(fā)明還涉及包含所公布的結(jié)構(gòu)式(I)的綴合物的藥物、包含PEG-IFN綴合物和治療可接受的賦形劑的藥用組合物，其適合治療病毒感染和癌癥，以及與原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷相關(guān)的疾病。本發(fā)明涉及結(jié)構(gòu)式(I)的綴合物在醫(yī)藥產(chǎn)品中的應(yīng)用，涉及用于預(yù)防和/或治療與原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷相關(guān)的疾病的方法，其包括施用有效治療劑量的結(jié)構(gòu)式(I)的綴合物，并涉及含有所述藥用組合物的容器。
文檔編號(hào)A61K38/21GK102617736SQ201110214149
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2011年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者C·T·維尼亞米諾夫納, D·L·阿萊克桑德羅維克, K·A·夫索沃洛多夫納, M·D·瓦倫蒂諾維克, R·E·喬治夫納 申請(qǐng)人:“拜奧卡德”股份公司