專利名稱：穩(wěn)定核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定核酸的方法。
核酸在特殊醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)證明是有前途的藥物。核酸作為藥物使用的特別令人感興趣的領(lǐng)域是利用特異性多核苷酸的一般性免疫刺激作用接種裸DNA或RNA，特別是接種特異性(重組)抗原、反義處理及基因治療處理。
在新一代疫苗的研發(fā)中，接種裸核酸正在成為最有前途的進(jìn)展之一。已經(jīng)為這種接種提出了許多進(jìn)展和特殊策略，以使其成為接種技術(shù)中的有效手段。
核酸作為普通免疫刺激劑的使用也正在從理論研究向醫(yī)學(xué)實(shí)踐發(fā)展。免疫系統(tǒng)識(shí)別低等生物(包括細(xì)菌)可能是由于病原體與宿主DNA之間結(jié)構(gòu)與序列應(yīng)用的差異。特別是針對(duì)來源于非脊椎動(dòng)物的短DNA片段，或在某些堿基中含有非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸(CpG)的合成短寡脫氧核苷酸(ODN)的形式。CpG基序在細(xì)菌DNA中以預(yù)期的頻率出現(xiàn)，但在脊椎動(dòng)物DNA中頻率較低。另外，非脊椎動(dòng)物CpG基序未甲基化，而脊椎動(dòng)物CpG序列甲基化。細(xì)菌DNA與脊椎動(dòng)物DNA之間的差異使得脊椎動(dòng)物將非脊椎動(dòng)物DNA識(shí)別為危險(xiǎn)信號(hào)。而且，先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞將病毒的雙鏈RNA識(shí)別為危險(xiǎn)信號(hào)。
反義和/或基因治療處理也是其主題，其中核酸的醫(yī)學(xué)應(yīng)用起主要作用。
然而，為了在所有這些應(yīng)用領(lǐng)域中獲得足夠的藥物效能，用于預(yù)防或治療的核酸應(yīng)當(dāng)具有一定的穩(wěn)定性，特別是體內(nèi)穩(wěn)定性。
當(dāng)用于個(gè)體時(shí)，為了提高核酸的有效性，特別是延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期，以現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行了幾種嘗試。例如，對(duì)于核酸接種，提出了用于核酸的復(fù)雜包裝系統(tǒng)，例如微球體、脂質(zhì)體、病毒體、乳液、微團(tuán)等。這些包裝系統(tǒng)主要在向細(xì)胞內(nèi)輸送核酸方面有其優(yōu)點(diǎn)，而不是有效并直接地穩(wěn)定核酸，特別是DNA。另一方面，核酸的修飾，特別是磷酸骨架中的修飾，已經(jīng)報(bào)告能夠有效延長(zhǎng)這些分子的半衰期(參見，例如US 5,663,153和US 5,723,335)。然而，至少含有一個(gè)硫代磷酸鍵的這些分子是非天然物質(zhì)，尤其是當(dāng)用于人時(shí)，如果長(zhǎng)時(shí)間使用，在可能的降解產(chǎn)物以及這些物質(zhì)的積累兩方面產(chǎn)生危險(xiǎn)。另外，這些修飾核酸在人體中的效果與安全性仍有待于確定。
因此本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定、特別是在體內(nèi)穩(wěn)定在藥物中使用的核酸(特別是DNA)的方法。
該目的通過一種穩(wěn)定核酸的方法達(dá)到，該方法的特征在于使核酸接觸一種聚陽離子聚合物。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的聚陽離子聚合物是聚陽離子肽，特別是聚精氨酸、聚賴氨酸和類似的化合物。
通過本發(fā)明能夠驚奇地看到，聚陽離子聚合物，優(yōu)選地聚陽離子肽，特別是聚氨基酸(如聚精氨酸)，對(duì)核酸、尤其是含有天然磷酸二酯鍵的核酸具有保護(hù)及穩(wěn)定作用。因此本發(fā)明特別適用于在磷酸骨架中缺乏人工修飾的核酸。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案目的在于一種穩(wěn)定在核苷殘基之間含有二磷酸基(即缺乏硫代磷酸鍵)的脫氧核糖核酸的方法。
盡管根據(jù)本發(fā)明也可以使用修飾的核酸，但是在核酸的醫(yī)學(xué)用途上，使用含未修飾骨架、特別是未修飾DNA和RNA的核酸，本發(fā)明的效果特別明顯。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明也涉及聚陽離子聚合物，優(yōu)選地聚陽離子肽，特別是聚精氨酸等，在穩(wěn)定核酸中的用途。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的用途特別適于穩(wěn)定在核苷殘基之間含有磷酸二酯鍵的核酸，特別是脫氧核糖核酸。
驚奇地發(fā)現(xiàn)，核酸(例如ODNs)的化學(xué)重要性顯著高于序列(例如CpG基序)。因此，通過本發(fā)明，天然形式核酸獲得的比活性結(jié)果優(yōu)于硫代磷酸修飾的分子，盡管在現(xiàn)有技術(shù)中后者更加有效。
如果穩(wěn)定發(fā)生在水溶液或懸液中，優(yōu)選地發(fā)生在待應(yīng)用(“現(xiàn)配現(xiàn)用”)于個(gè)體的溶液或懸液中，特別是在例如作為基因治療或反義藥物的疫苗中，本發(fā)明特別適用。
水溶液或懸液另外還可能含有緩沖物、藥物賦形劑和載體、其它穩(wěn)定劑、其它藥物等，特別是本領(lǐng)域周知的可與核酸和聚陽離子聚合物的混合物一起使用的輔助物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明表明，使用根據(jù)本發(fā)明的聚陽離子聚合物，優(yōu)選地聚陽離子肽，可延長(zhǎng)用于個(gè)體的核酸的體內(nèi)半衰期，而無論其特定用途如何，即無論核酸是用作如特異性“裸”DNA疫苗，用作普通免疫刺激劑，用作反義藥物，還是用作基因治療藥物。它能夠使基于核酸如DNA、RNA或PNA的這些藥物具有長(zhǎng)期的有效性。
根據(jù)本發(fā)明使用的聚陽離子化合物例如可以是任何一種聚陽離子化合物，其顯示根據(jù)WO97/30721的特有作用。優(yōu)選的聚陽離子化合物選自堿性多肽、有機(jī)聚陽離子、堿性聚氨基酸或其混合物。這些聚氨基酸應(yīng)當(dāng)具有至少4個(gè)氨基酸殘基的鏈長(zhǎng)。特別優(yōu)選的是含有肽鍵的物質(zhì)，如聚賴氨酸、聚精氨酸和在8個(gè)以上、特別是20個(gè)以上氨基酸殘基中含有20％以上、特別是50％以上堿性氨基酸的多肽，或其混合物。其它優(yōu)選的聚陽離子及其藥物組合物在WO97/30721(例如聚乙烯亞胺)和WO99/38528中描述。優(yōu)選地，這些多肽含有20-500個(gè)氨基酸殘基，特別是30-200個(gè)殘基。
這些聚陽離子化合物可以通過化學(xué)或重組方法產(chǎn)生，或者可以來自于天然來源。
陽離子(多)肽也可以是聚陽離子抗細(xì)菌微生物肽。這些(多)肽可以是原核或動(dòng)物或植物來源的，或者可以通過化學(xué)或重組方法產(chǎn)生，或者來自于天然來源。肽也可能屬于防衛(wèi)素一類。
這些宿主防御肽或防衛(wèi)素也是根據(jù)本發(fā)明的聚陽離子聚合物的優(yōu)選形式。通常用一種可作為終產(chǎn)物激活(或下調(diào))獲得性免疫系統(tǒng)(優(yōu)選地由APC(包括樹突細(xì)胞)介導(dǎo))的化合物作為聚陽離子聚合物。
在本發(fā)明中特別優(yōu)選的用作聚陽離子物質(zhì)的是cathelicidin衍生的抗微生物肽或其衍生物(A 1416/2000，在此引用作為參考)，特別是由哺乳動(dòng)物cathelicidin衍生的抗微生物肽，優(yōu)選地來源于人、?；蛐∈?，或神經(jīng)活性化合物，如(人)生長(zhǎng)激素(如WO01/24822所述)。
來自于天然來源的聚陽離子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生的陽離子肽、觸角肽、殼聚糖或幾丁質(zhì)的其它衍生物)或通過生物化學(xué)或重組生產(chǎn)由這些肽或蛋白質(zhì)衍生的其它肽。其它優(yōu)選的聚陽離子化合物是cathelin或與cathelin(特別是小鼠、?；蛘?尤其是)人cathelin和/或cathelicidin)相關(guān)或由其衍生的物質(zhì)。相關(guān)或衍生的cathelin物質(zhì)包含cathelin序列的全部或部分，其含有至少15-20個(gè)氨基酸殘基。衍生包括不屬于20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸之內(nèi)的氨基酸對(duì)天然氨基酸的置換或修飾。另外，也可將其它陽離子殘基導(dǎo)入這些cathelin分子中。這些cathelin分子優(yōu)選地與根據(jù)本發(fā)明的抗原/疫苗組合物組合。然而，令人驚奇的是，這些cathelin分子也可有效地作為抗原的佐劑，而不需要添加其它佐劑。因此，在疫苗制品中能夠用這些cathelin分子作為有效的佐劑，其中含有或不含其它免疫激活物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明使用的另一種優(yōu)選聚陽離子物質(zhì)是至少含有2個(gè)KLK-基序的合成肽，這兩個(gè)基序被3-7個(gè)疏水氨基酸(特別是亮氨酸)的接頭隔開(A 1789/2000，在此引用作為參考)。
無論如何，根據(jù)本發(fā)明使用的聚陽離子化合物，特別是肽，其自身不應(yīng)是免疫原性的(即不引發(fā)免疫應(yīng)答)，而只參與免疫應(yīng)答。
本發(fā)明通過下列實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述，然而，并非僅限于此。


圖1顯示利用pR和含CpG的ODN產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。
圖2顯示利用pR和含脫氧I或脫氧U的ODN產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。
圖3顯示利用pR和含脫氧-U的ODN的混合物產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。
圖4顯示利用pR和ODN產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。
圖5顯示利用pR誘導(dǎo)持續(xù)的免疫應(yīng)答。
圖6顯示利用KLK和含脫氧I的ODN產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。
圖7顯示利用KLK和含脫氧I的ODN產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。
圖8顯示在存在或不存在pR的條件下，用DNAse處理的DNA的1％瓊脂糖凝膠。
實(shí)施例實(shí)施例1使用pR和含CpG的寡脫氧核苷酸CpG 1668(未用硫代磷酸取代)，針對(duì)卵白蛋白衍生的肽(OVA257-264)的特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生小鼠 C57Bl/6(Harlan/Olac)肽 OVA257-264-肽(SIINFEKL)，雞卵白蛋白的一種MHC I類(H-2Kb)-限制的表位(Rotzschke等人，1991)，通過標(biāo)準(zhǔn)固相F-moc合成法合成，HPLC純化，通過質(zhì)譜法分析其純度劑量300μg/小鼠聚-L-精氨酸(pR) 平均聚合度為43個(gè)精氨酸殘基的聚-L-精氨酸；SIGMA Chemicals劑量100μg/小鼠CpG-ODN 1668 含有CpG-基序的硫代磷酸取代的ODNtcc atg acg ttc ctg atg ct，由PurimexGmbH，Gttingen合成劑量5nmol/小鼠CpG-ODN 1668b含有CpG-基序tcc atg acg ttc ctg atg ct(未用硫代磷酸取代)的ODN，由PurimexGmbH，Gttingen合成劑量5nmol/小鼠實(shí)驗(yàn)組(每組4只小鼠)1.OVA257-264+pR2.OVA257-264+CpG-ODN 16683.OVA257-264+CpG-ODN 1668b
4.OVA257-264+CpG-ODN 1668+pR5.OVA257-264+CpG-ODN 1668b+pR在第0天，向小鼠的每只后足墊內(nèi)注射總體積100μl(每只足墊50μl)，其中含有上述化合物。動(dòng)物在注射4天后處死，收獲腘淋巴結(jié)。淋巴結(jié)通過70μm細(xì)胞濾器，用含有5％胎牛血清(FCS，SIGMAchemicals)的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL)洗滌兩次。細(xì)胞用DMEM/5％/FCS調(diào)節(jié)至適當(dāng)?shù)募?xì)胞數(shù)。如述(Miyahira等人，1995)一式三份進(jìn)行IFN-γELISPOT測(cè)定。該方法是一種廣泛使用的方法，可定量抗原特異性T細(xì)胞。用培養(yǎng)基(背景對(duì)照)、OVA257-264-肽、一種無關(guān)肽TRP-2181-188和伴刀豆球蛋白A(ConA)一式三份離體(exvivo)刺激淋巴細(xì)胞。計(jì)數(shù)代表產(chǎn)IFN-γ的單個(gè)T細(xì)胞的斑點(diǎn)，所有樣品均減去背景斑點(diǎn)的數(shù)量。在ConA刺激后檢測(cè)到大量斑點(diǎn)(數(shù)據(jù)未顯示)，表明使用的淋巴細(xì)胞狀態(tài)良好。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠，產(chǎn)IFN-γ細(xì)胞/1×106淋巴結(jié)細(xì)胞的數(shù)量在圖1中顯示，給出離體刺激的三份樣品的標(biāo)準(zhǔn)差。
該實(shí)驗(yàn)表明，注射含硫代磷酸取代的CpG-ODN1668的OVA257-264與組合注射OVA257-264與聚-L-精氨酸相比，可增強(qiáng)OVA257-264-特異性免疫應(yīng)答。同時(shí)注射聚-L-精氨酸強(qiáng)烈增強(qiáng)CpG-ODN 1668誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。相反，當(dāng)使用未用硫代磷酸取代的CpG-ODN 1668b時(shí)，只在同時(shí)注射聚-L-精氨酸后才誘發(fā)強(qiáng)免疫應(yīng)答。
實(shí)施例2使用pR和脫氧肌苷修飾的寡核苷酸I-ODN 2b(磷酸二酯鍵，未用硫代磷酸取代)或脫氧尿苷一磷酸修飾的寡核苷酸U-ODN 13b(磷酸二酯鍵，未用硫代磷酸取代)，針對(duì)黑素瘤衍生肽(TRP-2181-188)的特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生小鼠C57Bl/6(Harlan/Olac)肽 TRP-2-肽181-188(VYDFFVWL)，小鼠酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2的一種MHC I類(H-2Kb)-限制的表位(B16黑素瘤，Bloom，M.B.等人，J Exp.Med 1997，185，453-459)，通過標(biāo)準(zhǔn)固相F-moc合成法合成，HPLC純化，通過質(zhì)譜法分析其純度劑量100μg/小鼠聚-L-精氨酸(pR) 平均聚合度為43個(gè)精氨酸殘基的聚-L-精氨酸；SIGMA Chemicals劑量100μg/小鼠I-ODN 2 含有脫氧肌苷的硫代磷酸取代的ODNstcc atg aci ttc ctg atg ct，由PurimexGmbH，Gttingen合成劑量5nmol/小鼠I-ODN 2b 含有脫氧肌苷的ODNs(未用硫代磷酸取代)tcc atg aci ttc ctg atg ct，由PurimexGmbH，Gttingen合成劑量5nmol/小鼠U-ODN 13 含有脫氧尿苷一磷酸的硫代磷酸取代的ODNstcc atg acu ttc ctgatg ct，由Purimex GmbH，Gttingen合成劑量5nmol/小鼠U-ODN 13b含有脫氧尿苷一磷酸的ODNs(未用硫代磷酸取代)tcc atg acu ttc ctg atg ct，由Purimex GmbH，Gttingen合成劑量5nmol/小鼠實(shí)驗(yàn)組(每組4只小鼠)1.TRP-2181-1882.TRP-2181-188+pR3.TRP-2181-188+I-ODN 2
4.TRP-2181-188+I-ODN 2b5.TRP-2181-188+U-ODN 136.TRP-2181-188+U-ODN 13b7.TRP-2181-188+I-ODN 2+pR8.TRP-2181-188+I-ODN 2b+pR9.TRP-2181-188+U-ODN 13+pR10.TRP-2181-188+U-ODN 13b+pR小鼠的注射和免疫應(yīng)答的分析如實(shí)施例1所述進(jìn)行。結(jié)果顯示于圖2中。對(duì)于淋巴結(jié)細(xì)胞的離體再刺激，用TRP-2181-188作為特異肽，OVA257-264作為無關(guān)肽。
該實(shí)驗(yàn)顯示，注射TRP-2181-188與硫代磷酸取代的I-ODNs或U-ODNs，與單獨(dú)注射TRP-2181-188相比，強(qiáng)烈增強(qiáng)TRP-2181-188特異的免疫應(yīng)答。同時(shí)注射聚-L-精氨酸與各自的ODN進(jìn)一步增強(qiáng)這些應(yīng)答。相反，當(dāng)使用未用硫代磷酸取代的I-ODN 2b或U-ODN 13b時(shí)，只在同時(shí)注射聚-L-精氨酸后才誘發(fā)強(qiáng)免疫應(yīng)答。
實(shí)施例3使用pR和脫氧尿苷一磷酸修飾的寡核苷酸(U-ODN 15b，未用硫代磷酸取代)的混合物，針對(duì)黑素瘤衍生肽(TRP-2181-188)的特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生小鼠 C57Bl/6(Harlan/Olac)肽 TRP-2-肽181-188(VYDFFVWL)，小鼠酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2的一種MHC I類(H-2Kb)-限制的表位(B16黑素瘤，Bloom，M.B.等人，J Exp.Med 1997，185，453-459)，通過標(biāo)準(zhǔn)固相F-moc合成法合成，HPLC純化，通過質(zhì)譜法分析其純度劑量100μg/小鼠聚-L-精氨酸(pR) 平均聚合度為43個(gè)精氨酸殘基的聚-L-精氨酸；SIGMA Chemicals劑量100μg/小鼠U-ODN 15b含有脫氧尿苷的ODNs(未用硫代磷酸取代)的混合物nhh hhh wdu dhh hhh hhhwn，由Purimex GmbH，Gttingen合成。
(n＝GCAT，h＝CAT，w＝AT，d＝GAT)劑量5nmol/小鼠實(shí)驗(yàn)組(每組4只小鼠)1.TRP-2181-1882.TRP-2181-188+pR3.TRP-2181-188+U-ODN 15b4.TRP-2181-188+U-ODN 15b+pR小鼠的注射和免疫應(yīng)答的分析如實(shí)施例1所述進(jìn)行。結(jié)果顯示于圖3中。對(duì)于淋巴結(jié)細(xì)胞的離體再刺激，用TRP-2181-188作為特異肽，OVA257-264作為無關(guān)肽。
在同時(shí)注射TRP-2181-188、pR以及未用硫代磷酸取代的U-ODN(U-ODN 15b)的混合物之后，與單獨(dú)注射TRP-2181-188或分別注射TRP-2181-188與pR或U-ODN 15b相比，TRP-2181-188特異的免疫應(yīng)答強(qiáng)烈增強(qiáng)。
實(shí)施例4由pR和不同寡脫氧核苷酸(磷酸二酯鍵，未用硫代磷酸取代)誘導(dǎo)的黑素瘤衍生肽(TRP-2181-188)特異性免疫應(yīng)答是持續(xù)的。
小鼠 C57Bl/6(Harlan/Olac)肽 TRP-2-肽181-188(VYDFFVWL)，小鼠酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2的一種MHC I類(H-2Kb)-限制的表位(B16黑素瘤，Bloom，
M.B.等人，J Exp.Med 1997，185，453-459)，通過標(biāo)準(zhǔn)固相F-moc合成法合成，HPLC純化，通過質(zhì)譜法分析其純度劑量100μg/小鼠聚-L-精氨酸(pR) 平均聚合度為43個(gè)精氨酸殘基的聚-L-精氨酸；SIGMA Chemicals劑量100μg/小鼠CpG-ODN 1668 含有CpG-基序的硫代磷酸取代的ODNstcc atg acg ttc ctg atg ct，由PurimexGmbH，Gttingen合成劑量5nmol/小鼠U-ODN 13 含有脫氧尿苷一磷酸的硫代磷酸取代的ODNstcc atg acu ttc ctg atg ct，由Purimex GmbH，Gttingen合成劑量5nmol/小鼠U-ODN 13b含有脫氧尿苷一磷酸的ODNs(未用硫代磷酸取代)tcc atg acu ttc ctg atg ct，由Purimex GmbH，Gttingen合成劑量5nmol/小鼠U-ODN 15 含有脫氧尿苷的硫代磷酸取代的ODNs的混合物nhh hhh wdu dhh hhh hhh wn，由Purimex GmbH，Gttingen合成。(n＝GCAT，h＝CAT，w＝AT，d＝GAT)劑量5nmol/小鼠U-ODN 15b含有脫氧尿苷的ODNs(未用硫代磷酸取代)的混合物nhh hhh wdu dhh hhh hhhwn，由Purimex GmbH，Gttingen合成。
(n＝GCAT，h＝CAT，w＝AT，d＝GAT)劑量5nmol/小鼠實(shí)驗(yàn)組(每組5只小鼠)1.TRP-2181-1882.TRP-2181-188+pR3.TRP-2181-188+CpG 16684.TRP-2181-188+U-ODN 135.TRP-2181-188+U-ODN 13b6.TRP-2181-188+U-ODN 157.TRP-2181-188+U-ODN 15b8.TRP-2181-188+pR+CpG 16689.TRP-2181-188+pR+U-ODN 1310.TRP-2181-188+pR+U-ODN 13b11.TRP-2181-188+pR+U-ODN 1512.TRP-2181-188+pR+U-ODN 15b小鼠的注射如實(shí)施例1所述進(jìn)行。結(jié)果顯示于圖4中。為了在注射后第40天分析免疫應(yīng)答，制備脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液。用TRP-2181-188作為特異肽，OVA257-264作為無關(guān)肽和ConA，離體再刺激脾細(xì)胞。
注射TRP-2181-188與pR、CpG 1668、U-ODN 13或硫代磷酸取代的U-ODNs(U-ODN 15)的混合物，與單獨(dú)注射TRP-2181-188相比，強(qiáng)烈增強(qiáng)TRP-2181-188特異的免疫應(yīng)答。同時(shí)注射聚-L-精氨酸與CpG1668或U-ODN 13顯著增強(qiáng)該應(yīng)答(只在U-ODN 15中輕微)。相反，當(dāng)使用未用硫代磷酸取代的U-ODN 13或U-ODN 15b時(shí)，只在同時(shí)注射聚-L-精氨酸后才誘發(fā)強(qiáng)免疫應(yīng)答。注射pR/U-ODN 15b(未用硫代磷酸取代)后的應(yīng)答顯著超過了pR/U-ODN15(用硫代磷酸取代)所誘發(fā)的應(yīng)答。
實(shí)施例5在TRP-2181-188與pR和含CpG的寡脫氧核苷酸CpG 1668b(磷酸二酯鍵，未用硫代磷酸取代)同時(shí)注射后，針對(duì)黑素瘤衍生肽(TRP-2181-188)的長(zhǎng)期特異性免疫應(yīng)答的誘發(fā)。
小鼠 C57Bl/6(Harlan/Olac)肽 TRP-2-肽181-188(VYDFFVWL)，小鼠酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2的一種MHC I類(H-2Kb)-限制的表位(B16黑素瘤，Bloom，M.B.等人，J Exp.Med 1997，185，453-459)，通過標(biāo)準(zhǔn)固相F-moc合成法合成，HPLC純化，通過質(zhì)譜法分析其純度劑量100μg/小鼠聚-L-精氨酸(pR) 平均聚合度為43個(gè)精氨酸殘基的聚-L-精氨酸；SIGMA Chemicals劑量100μg/小鼠CpG-ODN 1668b含有CpG-基序的ODNs(未用硫代磷酸取代)tcc atg acg ttc ctg atg ct，由Purimex GmbH，Gttingen合成劑量5nmol/小鼠實(shí)驗(yàn)組(每組5只小鼠)1.TRP-2181-1882.TRP-2181-188+pR3.TRP-2181-188+CpG 1668b4.TRP-2181-188+pR+CpG 1668b小鼠的注射如實(shí)施例1所述進(jìn)行。結(jié)果顯示于圖5中。為了在注射后第6、49和98天分析免疫應(yīng)答，制備脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液。用TRP-2181-188作為特異肽，OVA257-264作為無關(guān)肽(數(shù)據(jù)未顯示)和ConA，離體再刺激脾細(xì)胞。
同時(shí)注射TRP-2181-188、pR和CpG 1668b與分別注射TRP-2181-188與pR或CpG 1668b相比，產(chǎn)生數(shù)量顯著增加的肽特異性產(chǎn)IFN-γ細(xì)胞。這不僅在第6天可觀察到，在單次注射以后的時(shí)間點(diǎn)(第49、98天)也可觀察到，表明組合pR/CpG 1668b具有強(qiáng)烈且持久的免疫刺激作用。
實(shí)施例6使用KLK和脫氧肌苷修飾的寡核苷酸I-ODN 2b(磷酸二酯鍵，未用硫代磷酸取代)，針對(duì)OVA257-264-肽的特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。小鼠C57Bl/6(Harlan/Olac)肽 OVA257-264-肽(SIINFEKL)，雞卵白蛋白的一種MHC I類(H-2Kb)-限制的表位(Rotzschke等人，1991)，通過標(biāo)準(zhǔn)固相F-moc合成法合成，HPLC純化，通過質(zhì)譜法分析其純度劑量300μg/小鼠KLKKLKLLLLLKLK-COOH劑量168μg/小鼠I-ODN 2b 含有脫氧肌苷的ODNs(未用硫代磷酸取代)tcc atg aci ttc ctg atg ct，由Purimex GmbH，Gttingen合成劑量5nmol/小鼠實(shí)驗(yàn)組(每組5只小鼠)1.OVA257-264+KLK2.OVA257-264+I-ODN 2b3.OVA257-264+KLK+I-ODN 2b小鼠的注射如實(shí)施例1所述進(jìn)行。結(jié)果顯示于圖6中。為了在注射后第7天分析免疫應(yīng)答，采血，并通過Ficoll梯度分離外周血單核細(xì)胞。用OVA257-264作為特異肽，TRP-2181-188作為無關(guān)肽和ConA，離體再刺激PBMC。
注射OVA257-264與KLK或I-ODN 2b不誘發(fā)肽特異的IFN-γ產(chǎn)生。然而，在同時(shí)注射OVA257-264、KLK和I-ODN 2b之后，可檢測(cè)到大量的OVA257-264特異性產(chǎn)IFN-γT細(xì)胞。
實(shí)施例7使用KLK和脫氧肌苷修飾的寡核苷酸I-ODN 2b(磷酸二酯鍵，未用硫代磷酸取代)，針對(duì)黑素瘤衍生肽(TRP-2181-188)的特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。
小鼠 C57Bl/6(Harlan/Olac)肽 TRP-2-肽181-188(VYDFFVWL)，小鼠酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2的一種MHC I類(H-2Kb)-限制的表位(B16黑素瘤，Bloom，M.B.等人，J Exp.Med1997，185，453-459)，通過標(biāo)準(zhǔn)固相F-moc合成法合成，HPLC純化，通過質(zhì)譜法分析其純度劑量100μg/小鼠KLKKLKLLLLLKLK-COOH劑量168μg/小鼠I-ODN 2b 含有脫氧肌苷的ODNs(未用硫代磷酸取代)tcc atg aci ttc ctg atg ct，由Purimex GmbH，Gttingen合成劑量5nmol/小鼠實(shí)驗(yàn)組(每組5只小鼠)1.TRP-2181-1882.TRP-2181-188+KLK3.TRP-2181-188+I-ODN 2b4.TRP-2181-188+KLK+I-ODN 2b小鼠的注射如實(shí)施例1所述進(jìn)行。結(jié)果顯示于圖7中。為了在注射后第7天分析免疫應(yīng)答，采血，并通過Ficoll梯度分離外周血單核細(xì)胞。用TRP-2181-188作為特異肽，OVA257-264作為無關(guān)肽和ConA，離體再刺激PBMC。
單獨(dú)注射或與KLK或I-ODN 2b一起注射TRP-2181-188不誘發(fā)肽特異的IFN-γ產(chǎn)生。相反，在同時(shí)注射TRP-2181-188、KLK和I-ODN 2b之后，可檢測(cè)到極大量的肽特異性產(chǎn)IFN-γT細(xì)胞。
實(shí)施例8聚-L-精氨酸阻止血清DNAse對(duì)DNA的降解為了研究pR在阻止DNAse降解DNA中的保護(hù)作用，進(jìn)行下列體外實(shí)驗(yàn)。為了顯示可能的體內(nèi)相關(guān)性，用血清作為DNase的來源。
在含或不含聚-L-精氨酸(2.4μg/2.4μl)的條件下，DNA-質(zhì)粒pSP65(1.58μg/2μl)與來源于幼稚小鼠的血清(8μl)一起在37℃下溫育1小時(shí)。在室溫下添加肝素(1.6U/1.6μl)20分鐘，用來分解DNA/pR復(fù)合物，以使DNA遷移至凝膠中。圖8顯示1％瓊脂糖凝膠(30分鐘/100伏)。用100bp DNA標(biāo)記物(GIBCO BRL)作為對(duì)照。
對(duì)于未處理的pSP65 DNA，可觀察到典型的環(huán)狀質(zhì)粒超螺旋/螺旋/松弛帶模式。DNA與血清溫育導(dǎo)致降解，檢測(cè)為不同的隨機(jī)DNase切割產(chǎn)物的成片條帶(smear)。在添加聚-L-精氨酸后阻止了血清DNase的這種降解。
因此，聚-L-精氨酸穩(wěn)定DNA免遭酶降解，并且延長(zhǎng)DNA的半衰期和生物有效性。
權(quán)利要求
1.穩(wěn)定核酸的方法，其特征在于核酸與一種聚陽離子聚合物接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于該核酸是一種在核苷殘基之間含有二磷酸基的脫氧核糖核酸。
3.聚陽離子聚合物在穩(wěn)定核酸中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，用于穩(wěn)定在核苷殘基之間含有磷酸二酯基的脫氧核糖核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的用途，其特征在于該核酸在水溶液或懸液中穩(wěn)定。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其特征在于該聚陽離子聚合物是一種聚陽離子肽，優(yōu)選的是在8個(gè)以上氨基酸殘基中含有20％以上、特別是50％以上堿性氨基酸的多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任何一項(xiàng)的用途，其特征在于對(duì)個(gè)體施用的核酸的體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)。
全文摘要
描述了一種通過使核酸與聚陽離子聚合物接觸穩(wěn)定核酸的方法。
文檔編號(hào)A61K9/10GK1526016SQ02811697
公開日2004年9月1日 申請(qǐng)日期2002年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月21日
發(fā)明者C·舍拉克, K·林納奧, W·施米迪特, C 舍拉克, 椎咸, 砂 申請(qǐng)人:英特塞爾股份公司