專利名稱：病毒疫苗佐劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于增加哺乳動物疫苗抗原性的新的佐劑。尤其，本發(fā)明涉及利用角鯊烯或角鯊烷或其混合物、甘油和表面活性劑的新的佐劑。
利用四類主要的疫苗來增加哺乳動物，尤其是人的抗疾病抗體。它們是活疫苗、死疫苗或滅活疫苗、亞單位疫苗和類毒素。其中，活疫苗使宿主產(chǎn)生最強的免疫應答。通常將這些活疫苗減毒，使得它們能夠增加其對抗原免疫應答的時間，并且不產(chǎn)生通常相關的疾病。
通過化學或其它方法來滅活死疫苗，其中所述方法不滅活宿主免疫系統(tǒng)中存在的抗原因子。百日咳和索爾克脊髓灰質(zhì)炎疫苗是死疫苗的實例。
就某些疾病媒介體而言，即使殺傷機體也不能阻止它引起受體不需要的作用。在這種情況下，必須將試劑分裂成本身不是病原體的亞單位或亞部分。這種亞單位疫苗的實例包括某些流感疫苗和某些實驗性皰疹病毒和肝炎疫苗。
最后，類毒素疫苗是將機體排泄的毒素變成無毒性的，然后用作任何其它抗原因子來刺激對毒素的免疫應答。破傷風類毒素是這種疫苗的實例。
不幸的是，亞單位和類毒素疫苗難以提供足夠的抗原來觸發(fā)宿主產(chǎn)生長期的免疫性。因此，由非活性疫苗，尤其是高度純化的亞單位疫苗誘導的免疫性僅持續(xù)1-2年。
已經(jīng)描述了各種佐劑來加強非活性設苗的致免疫性。其中有弗氏完全佐劑。它包含礦物油、水、乳化劑和死結核菌。在有效地用于哺乳動物的很多佐劑中，只有很少一部分，包括氫氧化鋁和磷酸鋁已廣泛地用于人類。由于幾種佐劑引起嚴重的局部反應和全身反應，已拒絕將它們用于人類。其中一些，如含礦物油的弗氏完全佐劑是不能代謝的并且由于可引起實驗室動物癌癥，被認為可能致癌。因此，需要有效并安全的佐劑，它能夠加強疫苗，尤其是目前有效并且可以開發(fā)的亞單位型疫苗的作用。
本發(fā)明提供哺乳動物疫苗組合物，它包括滅活的完全或亞單位疫苗或類毒素和佐劑。
本發(fā)明佐劑包含角鯊烯、甘油和表面活性劑的混合物。尤其，第一個佐劑包含這些組分與哺乳動物疫苗的混合物，其中角鯊烯占混合物總量的約1％-40％，甘油占混合物總量的約5％-40％，并且表面活性劑占混合物總量的約0.1％-4.0％。本文所列出的百分數(shù)為每種組分的體積百分數(shù)并且已知總混合物的剩余百分數(shù)由疫苗本身或由疫苗和可有可無的鋁鹽及本文所述的緩沖劑產(chǎn)生。
本發(fā)明更優(yōu)選的方面是，佐劑的角鯊烯組分占混合物總量的約2％-20％，甘油占混合物總量的約10％-30％，并且表面活性劑占混合物總量的約0.15％-1.6％。本發(fā)明進一步更優(yōu)選的方面是佐劑的角鯊烯組分占混合物總量的約3％-7％，甘油組分占混合物總量的約15％-25％，并且表面活性劑占混合物總量的約0.18％-0.22％。
術語角鯊烯是指Merck Index，11th Edition第1383頁中所述的化合物，稱作(全-E)-2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳烯，也稱為Sinacene和Supraene。角鯊烷也在Merck Index，11th Edition第1383頁中提到，稱作2，6，10，15，19，23-六甲基二十四碳烷；全氫角鯊烯；十二氫角鯊烯，和Spinacane，可用于代替本文所述的佐劑混合物的角鯊烯組分或與之混合。
可用于本配方中的表面活性劑包括但不限制于聚山梨醇酯20(聚氧乙烯20失水山梨糖醇單月桂酸酯)，聚山梨醇酯60，司盤80失水山梨糖醇油酸酯，ICI Americas，Wilmington，DE的產(chǎn)品，由BASF Corporation，Parsippany，NJ生產(chǎn)的CremophorO表面活性劑，和聚山梨醇酯80，已知又稱作失水山梨糖醇單-9-十八碳烯酸酯聚(氧-1，2-乙二基)衍生物、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單油酸酯、失水山梨糖醇單油酸酯聚氧乙烯、Sorlate、吐溫80，其中并且表明為每摩爾山梨糖醇或山梨糖醇酐與大約20摩爾環(huán)氧乙烷共聚化的山梨糖醇和其酐的油酸酯。聚山梨糖醇酯80是本發(fā)明優(yōu)選使用的表面活性劑。
本領域技術人員應該理解這些佐劑中的甘油組分是指通過商業(yè)渠道可購得的醇，已知也稱作1，2，3-丙三醇；glycerin；glycerine；或三羥基丙烷。
非強制性地，本發(fā)明佐劑也可以含有一種或多種可藥用的鋁鹽，如氫氧化鋁、磷酸鋁或硫酸鋁，其重量/體積濃度約為0.1％-2.0％，優(yōu)選約0.3％-0.7％，最優(yōu)選約0.5％。氫氧化鋁是優(yōu)選的鋁鹽。
非強制性地，本發(fā)明佐劑也可以含有一種或多種可藥用PH緩沖劑，如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、Tris-HCl、枸櫞酸鹽-磷酸鹽緩沖劑、Tricine緩沖劑、Hepes和馬來酸鹽緩沖劑。如果最終溶液保持在基本等滲條件下，那么，其它的鹽如KCl可代替PBS緩沖劑中的氯化鈉。優(yōu)選使用這些緩沖劑來保持佐劑混合物的PH在6.0-8.0之間。
優(yōu)選用滅菌組分來制備本發(fā)明佐劑或通過已知的熱方法或過濾方法來滅菌。佐劑混合物可在4℃下貯存。如果佐劑是非滅菌的，那么要求在4℃下貯存不超過3天。本發(fā)明微流體化、聲處理或均勻化的佐劑的貯備液可在優(yōu)選-20℃的溫度下或更低溫度下貯存。
本發(fā)明組合物中所使用的佐劑表現(xiàn)出顯著的免疫調(diào)節(jié)性并且假定這些化合物的輔助作用是其調(diào)節(jié)免疫應答能力的直接結果。而且，由于這些佐劑組分缺乏產(chǎn)生反應的能力，因此，它們用作疫苗佐劑的適應性甚至進一步加強。也應該注意到，這些佐劑由已知的可注射物質(zhì)組成并且在商業(yè)渠道購得的注射劑中可見到。
可通過對所使用的特定疫苗所指定的任何方式來施用本發(fā)明組合物中所使用的疫苗，優(yōu)選通過肌肉或皮下注射。所述疫苗可作為獸醫(yī)用或人用疫苗，并且包括滅活的完全疫苗和亞單位疫苗以及類毒素。而且，使用的疫苗是那些用于抗細菌、立克次氏體和病毒病原體的免疫疫苗。例如，適宜的人用疫苗可包括流感、脊髓灰質(zhì)炎、蟲媒病毒(arbovisus)感染、傷寒和副傷寒、ekolcra、鼠疫、百日咳、斑疹傷寒、Rocky Mountain SpottedFever、B型流感嗜血桿菌、多價肺炎球菌多糖、C組腦膜炎雙球菌和新產(chǎn)生的人二倍體細胞狂犬病疫苗和肝炎疫苗的完全疫苗和亞單位疫苗。
例如，適宜的獸醫(yī)用疫苗包括馬流感病毒、馬皰疹病毒、馬腦脊髓灰質(zhì)炎病毒、疣病毒、足口病病毒、狂犬病、貓總白細胞減少、貓鼻氣管炎、貓萼狀病毒、傳染性牛鼻氣管炎、副流感-3、牛病毒性腹瀉、牛腺病病毒、假性狂犬病，傳染性胃腸炎病毒、豬細小病毒、犬腺病毒、犬溫熱病毒和犬副流感的完全疫苗和亞單位疫苗。Strangles、布魯桿菌病、弧菌病、鉤端螺旋體病、梭狀芽胞桿菌感染、沙門菌病、大腸桿菌病、微粒孢子蟲病、巴斯德菌感染、嗜血桿菌感染、丹毒絲菌等的完全疫苗和亞單位疫苗、菌苗和類毒素。進一步，充分考慮到，由于未來的疫苗(尤其是病毒和細菌亞單位型)可能類似地減弱免疫原，因此要求通過適宜的并且可接受的佐劑來強化，并且可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明體系是非常適宜的。
使用所公開的有效佐劑和疫苗的好處是明顯的。通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的某區(qū)域，佐劑可增加體液免疫的免疫反應性，結果在給予受體佐劑和疫苗制劑時，疫苗制劑中所含的抗原物質(zhì)的抗體的產(chǎn)生增加。當然，這種增加將獲得更強和更長久的免疫水平，甚至即使免疫試劑可能是弱的免疫原，如，在很多滅活的完全疫苗、尤其是亞單位疫苗和類毒素中可以看到該作用。這種對抗原免疫應答的加強直接產(chǎn)生這種作用，進一步的好處是可通過使用較少的免疫抗原物質(zhì)以降低宿主產(chǎn)生嚴重和強烈免疫反應的效力。在青少年接種中，這一點是尤其重要的。而且，使用減小劑量的純抗原除了可產(chǎn)生更成功和更安全的免疫作用外，制備疫苗可以更經(jīng)濟和更適宜。
通過將佐劑物質(zhì)溶解或懸浮在抗原稀釋劑中并且在適宜的抗原稀釋劑中將適宜體積的佐劑溶液和抗原溶液混合來制備本發(fā)明組合物?？乖♂寗┦潜绢I域常規(guī)的那些，如磷酸鹽緩沖鹽水、最低基本培養(yǎng)基、胨等等。
可以以大于最終濃度的濃度將本發(fā)明佐劑混合，然后在使用或貯存前，用疫苗以及可有可無的緩沖劑稀釋。優(yōu)選使用滅菌佐劑組分或在某些情況下，使用滅菌濾液。然后，在與選擇的疫苗混合前，將得到的佐劑組分的混合物完全混勻，優(yōu)選使用均化器，以適宜的速度和時間確?；旌衔锞鶆?，例如時間約為1-10分鐘。
尤其是，可通過下列步驟來生產(chǎn)本發(fā)明佐劑。
1)首先，應該將所有的佐劑組分調(diào)至溫度約為37℃。
2)應該將緩沖劑(如果使用)、角鯊烯組分和甘油組分混合到一起并且使其達到室溫。應將該混合物保持在室溫約15分鐘。
3)邊混合邊將表面活性劑組分加到混合物中。將佐劑組分的整個混合物高壓滅菌并且聲處理，得到滅菌、均勻的佐劑混合物。可在冰浴中，用Heat System探針型聲處理器，在約6號位來完成聲處理。要求聲處理的時間至少為5分鐘，并且將時間分成聲處理脈沖大約為30秒，然后經(jīng)過15秒的中斷，保持佐劑混合物在冰浴中。該種聲處理更一致并且更優(yōu)選的選擇是將佐劑混合物微流體化或均勻化，直到它通過0.22μm的濾膜。如果需要，可在混合下，將本文所述的鋁鹽加到佐劑組合物中。
4)根據(jù)需要的劑量，將病毒疫苗或疫苗濃縮物加到佐劑混合物中。
5)將佐劑/疫苗混合物適度混合。在混合期間，另外加入一定量的緩沖劑，使得最終混合物達到要求的體積。
實施例1制備本發(fā)明佐劑和比較佐劑，并且與三價Wyeth-Ayerst1993流感病毒疫苗(在1993 Physician′s Desk Reference，47th Edition第2578頁中描述)混合。對試驗組6只雌性、7周齡CD-1-小鼠，給予1.5μg疫苗中所含的三種血凝素中的每一種，A/Beijing/32/92，A/Texas/36/91和B/Panama/45/90。每只小鼠肌內(nèi)注射0.2ml Wyeth-Ayerst疫苗。在接種后28天時，采血并用血凝反應抑制法來測定血清中抗A/Beijing組分的抗體。下表I列出每試驗組6只小鼠的平均幾何效價。應該注意，使用適量的PBS緩沖劑將本文所述的佐劑和比較佐劑調(diào)至要求的體積。
所使用的佐劑如下佐劑No.1)含5％角鯊烯、5％甘油和0.2％吐溫80的佐劑混合物。
比較佐劑No.1)Syntex Laboratories用作SyntexAdjuvant Formulation-Microfluidized載體。該佐劑含5％角鯊烯、1.25％Pluronic L-121(通過商業(yè)渠道可從BASF WyandotteCorp購得)和0.2％吐溫80。
比較佐劑No.2)5％角鯊烯/0.2％吐溫80的佐劑混合物。
比較佐劑No.3)5％角鯊烯/1.0％吐溫80的佐劑混合物。
比較佐劑No.4)5％角鯊烯/2.0％吐溫80的佐劑混合物。
比較佐劑No.5)5％角鯊烯/4.0％吐溫80的佐劑混合物。
比較佐劑No.6)5％角鯊烯、0.2％卵磷脂、0.2％吐溫80的佐劑混合物。
比較佐劑No.7)5％角鯊烯、5％甘油、0.5％卵磷脂的佐劑混合物。
比較佐劑No.8)5％角鯊烯、0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％吐溫80的佐劑混合物。
比較佐劑No.9)在PBS緩沖劑中單一的疫苗。
表I流感佐劑佐劑HI效價(千)佐劑No.12.048比較佐劑No.15.793比較佐劑No.21.825比較佐劑No.31.625比較佐劑No.42.048比較佐劑No.52.048比較佐劑No.61.29比較佐劑No.71.149比較佐劑No.80.406比較佐劑No.90.406實施例2用Cynomolgus猴子試驗組來完成另一佐劑試驗。每組3只猴子，通過肌肉注射接種0.5ml 以50∶50的比例與下文所述的佐劑混合的三價Wyeth-Ayerst 1993流感病毒疫苗(在1993 Physician′sDesk Reference，47th Edition第2578頁中描述)。在開始接種疫苗后28天，用相同的接種物加強。在第28天和42天，從每只猴子上取5ml血，分析肌酸磷酸激酶(cpk)，下表II顯示每組3只猴子的分析結果。如上所述，用適量的PBS緩沖劑將下文所述的佐劑/疫苗混合物調(diào)至要求的體積。
試驗用佐劑混合物佐劑A含5％角鯊烯，20％甘油和0.2％吐溫80的本發(fā)明佐劑混合物。
比較佐劑A僅在PBS緩沖劑中含疫苗的疫苗混合物。
比較佐劑B含2mg膽固醇偏丁二酸酯(CHS)或丁二酸氫膽甾醇酯脂質(zhì)體(通過商業(yè)渠道購于Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri，Catalog no.C6013)。
比較佐劑C含5％角鯊烯、30％丙二醇和0.2％吐溫80的佐劑混合物。
表IICynomolgus猴子體內(nèi)的佐劑對A/Beijing(GMT)的HI效價佐劑 28天42天佐劑A203 645比較佐劑A8 8比較佐劑B51 102比較佐劑C102 25權利要求
1.哺乳動物疫苗組合物，該組合物含滅活完全或亞單位疫苗和有效量佐劑，其中佐劑含角鯊烯的量占組合物總體積的約1％-40％，含甘油的量占組合物總體積的約5％-40％，并且含表面活性劑的量占組合物總體積的約0.1％-4.0％。
2.權利要求1的哺乳動物疫苗組合物，其中佐劑含角鯊烯的量占組合物總體積的約2％-20％，含甘油的量占組合物總體積的約10％-30％，并且含表面活性劑的量占組合物總體積的約0.15％-1.6％。
3.權利要求1的哺乳動物疫苗組合物，其中佐劑含角鯊烯的量占組合物總體積的約3％-7％，含甘油的量占組合物總體積的約15％-25％，并且含表面活性劑的量占組合物總體積的約0.18％-0.22％。
4.權利要求1的哺乳動物疫苗組合物，其中佐劑進一步含可藥用PH緩沖劑。
5.權利要求4的哺乳動物疫苗，其中可藥用PH緩沖劑為PBS。
6.權利要求1的哺乳動物疫苗組合物，其中，佐劑進一步含重量/體積濃度約為0.1％-2.0％的鋁鹽。
7.權利要求5的哺乳動物疫苗組合物，其中鋁鹽為氫氧化鋁。
8.權利要求1的哺乳動物疫苗組合物，其中疫苗是亞單位流感A疫苗。
9.權利要求1的哺乳動物疫苗組合物，其中用等當量的角鯊烷代替角鯊烯。
10.權利要求1的哺乳動物疫苗組合物，其中用等當量的角鯊烯和角鯊烷的混合物來代替角鯊烯。
11.哺乳動物疫苗組合物，該組合物含滅活完全或亞單位疫苗和有效量在可藥用緩沖劑中的佐劑，其中佐劑含角鯊烯的量占組合物總體積的約3％-7％，含甘油的量占組合物總體積的約15％-25％，并且含表面活性劑的量占組合物總體積的約0.18％-0.22％，該哺乳動物疫苗組合物進一步含約0.1％-2.0％的鋁鹽。
12.權利要求12的哺乳動物疫苗組合物，其中鋁鹽為氫氧化鋁。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有有效量佐劑的哺乳動物疫苗組合物，其中佐劑含角鯊烯或角鯊烷、甘油和表面活性劑。非強制性地，這些組合物也含鋁鹽和一種或多種可藥用緩沖劑。
文檔編號A61K39/145GK1141810SQ9611040
公開日1997年2月5日 申請日期1996年6月1日 優(yōu)先權日1995年6月2日
發(fā)明者R·N·希約思 申請人:美國家用產(chǎn)品公司