專利名稱：一種耐熱保護(hù)劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及活的微生物保存領(lǐng)域，具體涉及耐熱保護(hù)劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
病毒等生物活性物質(zhì)及其相關(guān)制品的熱敏感性一直是活疫苗長(zhǎng)期保存的瓶頸。我國(guó)幅員遼闊，經(jīng)濟(jì)水平差異較大，運(yùn)輸、使用過(guò)程中疫苗短期暴露高溫環(huán)境(甚至45°C以上) 的現(xiàn)象依然存在，所以對(duì)活疫苗的耐熱性能提出了更高的要求。
耐熱凍干保護(hù)劑考慮了活疫苗在較高溫度和較長(zhǎng)保存時(shí)間的情況下，凍干物質(zhì)可能產(chǎn)生的物理和化學(xué)變化對(duì)活疫苗存活的影響。但是，現(xiàn)有耐熱凍干保護(hù)劑僅能使活疫苗在2 8 °C條件下保存24個(gè)月，37 °C條件下保存30天。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種耐熱保護(hù)劑，能夠增強(qiáng)活疫苗的耐熱性能。
本發(fā)明還提供耐熱保護(hù)劑在制備活疫苗凍干粉中的應(yīng)用，采用該耐熱保護(hù)劑制備的活疫苗凍干粉在37°C保存2個(gè)月，15°C條件下保存24個(gè)月。
本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
一種耐熱保護(hù)劑，按照質(zhì)量百分含量由下列物質(zhì)組成低聚糖40% 80%，氨基酸3% 12%，明膠3% 12%,酪蛋白水解物3% 12%，聚乙烯基吡咯烷酮3% 12%，甘油3% 12%,普魯尼克-68 3%-12%ο
所述低聚糖選自海藻糖、蔗糖、乳糖和菊糖中的一種或兩種以上的混合物。
所述氨基酸選自精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、谷氨酸和異亮氨酸中的一種或兩種以上的混合物。
一種所述耐熱保護(hù)劑在制備活疫苗凍干粉中的應(yīng)用。
用溶劑溶解耐熱保護(hù)劑，得到保護(hù)劑溶液；將保護(hù)劑溶液與活病毒液混合，得到活疫苗；將活疫苗進(jìn)行冷凍干燥即得活疫苗凍干粉。
所述溶劑為無(wú)菌的生理鹽水、注射用水、PBS緩沖液、TriS-HCl緩沖液或Hank’ s 液，所述耐熱保護(hù)劑與溶劑的質(zhì)量比為3:6 8。
所述保護(hù)劑溶 液與活病毒液按照質(zhì)量比為1:0. 5 2混合。
所述活病毒液為雞新城疫病毒液或豬繁殖與呼吸綜合征病毒液。
冷凍干燥的方法為將活疫苗在常壓、溫度為_(kāi)40°C _65°C條件下保持2 6小時(shí)，在真空度為O.1 10. Ombar溫度為-10°C 4°C條件下保持10 26小時(shí)，在真空度為O.01 5. Ombar溫度為10°C 28°C條件下保持2 8小時(shí)。
本發(fā)明耐熱保護(hù)劑，由于其成分及含量的合理搭配，使得活疫苗耐熱、耐儲(chǔ)存。耐熱保護(hù)劑中的低聚糖能夠置換毒囊膜或者細(xì)胞壁中的，讓病毒處于休眠狀態(tài)，降低病毒干燥和保存期的生命活動(dòng)，進(jìn)而大大加強(qiáng)其耐熱性能。
采用本發(fā)明耐熱保護(hù)劑制備的活疫苗凍干粉，避免了冰晶的形成，減少病毒囊膜或者細(xì)胞壁的物理?yè)p傷，使得活疫苗凍干粉在37°C保存2個(gè)月，15°C條件下保存24個(gè)月。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。
實(shí)施例1耐熱保護(hù)劑的制備本實(shí)施例中如果無(wú)特殊說(shuō)明，百分?jǐn)?shù)均指重量百分含量。
其中，酪蛋白水解物購(gòu)自ShanHai Richu Bioscience Co. · Ltd,批號(hào) 090901 ;聚乙烯基吡咯烷酮(K-30)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20111009 ;普魯尼克68 (Pluronic F 68)購(gòu)自上海生工生物有限公司，批號(hào)HJ0522B2012。
耐熱保護(hù)劑I配方海藻糖68%，甘氨酸6%，明膠3%，酪蛋白水解物6%，聚乙烯基吡咯烷酮 6%，甘油5%，普魯尼克686%。
耐熱保護(hù)劑2配方海藻糖 38%，蔗糖 20%，精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、谷氨酸和異亮氨酸各2%，明膠6%，酪蛋白水解物10%，聚乙烯基吡咯烷酮 3%，甘油3%，普魯尼克6810 %。
耐熱保護(hù)劑3配方海藻糖、蔗糖、乳糖和菊糖各15%，精氨酸、甘氨酸和蛋氨酸各2%，明膠10%，酪蛋白水解物8%，聚乙烯基吡咯烷酮 4%，甘油8%，普魯尼克684%。
耐熱保護(hù)劑4配方鹿糖48%,精氨酸10%，明膠10%，酪蛋白水解物6%，聚乙烯基吡咯烷酮10%，甘油10%， 普魯尼克68 6%。
耐熱保護(hù)劑5配方乳糖77%，蛋氨酸2%，谷氨酸6%，明膠3%，酪蛋白水解物3%，聚乙烯基吡咯烷酮3%，甘油3%，普魯尼克683%。
耐熱保護(hù)劑6配方菊糖40%,谷氨酸和異亮氨酸各6%，明膠12%，酪蛋白水解物11%，聚乙烯基吡咯烷酮11%，甘油11%，普魯尼克683%。
按照各耐熱保護(hù)劑的配方稱取各成分，獲得耐熱保護(hù)劑1-6。
實(shí)施例2 雞新城疫活疫苗凍干粉的制備及其耐熱性能 (O耐熱保護(hù)劑的制備按實(shí)施例1方法制得耐熱保護(hù)劑I 一 6。
( 2 )雞新城疫病毒液(活病毒液)的準(zhǔn)備由南京天邦生物科技有限 公司提供雞新城疫病毒液。具體制備方法按照《獸用生物質(zhì)量質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編》(2006-2008)相關(guān)要求，制備雞新城疫病毒液(La Sota株)，每羽份病毒液病毒含量為107_%id5(i (雞胚檢驗(yàn)法)。
(3)雞新城疫活疫苗凍干粉的制備 ①用溶劑溶解耐熱保護(hù)劑，得到保護(hù)劑溶液；將耐熱保護(hù)劑I與無(wú)菌注射用水按照質(zhì)量比為3 7混合，待耐熱保護(hù)劑I完全溶解后， 用O. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌，得到保護(hù)劑溶液1，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 按照制備保護(hù)劑溶液I的方法，將耐熱保護(hù)劑2-6，分別配制成相應(yīng)的保護(hù)劑溶液。不同之處在于，保護(hù)劑溶液2中溶劑為無(wú)菌PBS緩沖液(pH7. 2)，耐熱保護(hù)劑2與無(wú)菌 PBS緩沖液(pH7. 2)按照質(zhì)量比為3 6 ;保護(hù)劑溶液3中的溶劑為無(wú)菌生理鹽水，耐熱保護(hù)劑3與無(wú)菌生理鹽水按照質(zhì)量比為3 8混合；保護(hù)劑溶液4和5的配制方法同保護(hù)劑溶液 2 ;保護(hù)劑溶液6的配制方法同保護(hù)劑溶液3。
PBS 緩沖液(ρΗ7· 2):將 8. 5g NaCl,3. 5g Na2HPO4 · 12H20 和 O. 25g NaH2PO4 · 2H20 溶于蒸懼水，定容至1000ml。
咨保護(hù)劑溶液I — 6分別與雞新城疫病毒液(活病毒液)混合，得到活疫苗I — 6。
其中活疫苗I中保護(hù)劑溶液I與雞新城疫病毒液(活病毒液)的質(zhì)量比為1:1?；钜呙?中保護(hù)劑溶液2與雞新城疫病毒液(活病毒液)的質(zhì)量比為1:0. 5?；钜呙?中保護(hù)劑溶液3與雞新城疫病毒液(活病毒液)的質(zhì)量比為1:2?；钜呙?中保護(hù)劑溶液4與雞新城疫病毒液(活病毒液)的質(zhì)量比為1:1.5?；钜呙?中保護(hù)劑溶液5與雞新城疫病毒液(活病毒液)的質(zhì)量比為1:0. 5?；钜呙?中保護(hù)劑溶液6與雞新城疫病毒液(活病毒液)的質(zhì)量比為1:2。
③將活疫苗I用真空冷凍干燥機(jī)按照下述方法進(jìn)行干燥將活疫苗I在常壓、溫度為_(kāi)40°C條件下保持2小時(shí)，在真空度為O.1mbar溫度為_(kāi)10°C條件下保持10小時(shí)，在真空度為O. Olmbar溫度為10°C條件下保持2小時(shí)，即得雞新城疫活疫苗凍干粉I。
將活疫苗2用真空冷凍干燥機(jī)按照下述方法進(jìn)行干燥將活疫苗2在常壓、溫度為_(kāi)65°C條件下保持6小時(shí)，在真空度為10. Ombar溫度為4°C條件下保持26小時(shí)，在真空度為5. Ombar溫度為28°C條件下保持8小時(shí)，即得雞新城疫活疫苗凍干粉2。
將活疫苗3用真空冷凍干燥機(jī)按照下述方法進(jìn)行干燥將活疫苗3在常壓、溫度為_(kāi)52°C條件下保持4小時(shí)，在真空度為5. Ombar溫度為_(kāi)3°C條件下保持18小時(shí)，在真空度為2. 5mbar溫度為20°C條件下保持5小時(shí)，即得雞新城疫活疫苗凍干粉3。
按照活疫苗I的干燥方法，將活疫苗4干燥后得到雞新城疫活疫苗凍干粉4。按照活疫苗2的干燥方法，將活疫苗5干燥后得到雞新城疫活疫苗凍干粉5。按照活疫苗3的干燥方法，將活疫苗6干燥后得到雞新城疫活疫苗凍干粉6。
對(duì)照疫苗A按照名稱為“雞新城疫活疫苗耐熱凍干保護(hù)劑、其制備方法及應(yīng)用”、 專利號(hào)為ZL200510115162. O發(fā)明專利，實(shí)施例3中“A組試驗(yàn)疫苗”的制備方法。保護(hù)劑配方為明膠1. 2g，乳糖Sg，精氨酸lg，山梨醇4g，蒸餾水定容100ml，蒸汽滅菌后與雞新城疫病毒液(活病毒液)的質(zhì)量比為1:1混合，_30°C入箱，預(yù)凍在_45°C以下5小時(shí)后升溫，曲線全程共計(jì)48小時(shí)，升華過(guò)程中真空度控制在IOmHg以下，冷凝器保持在_70°C，得到雞新城疫活疫苗對(duì)照疫苗A。
(4)雞新城疫活疫苗凍干粉耐熱性能的比較按照《中國(guó)獸藥典》(2010版)中雞胚檢測(cè)法檢測(cè)雞新城疫活疫苗凍干粉1-6和對(duì)照疫苗A在不同條件下保存后的毒價(jià)。
表I雞新城疫活 疫苗凍干粉與對(duì)照疫苗A的比較
權(quán)利要求
1.一種耐熱保護(hù)劑，按照質(zhì)量百分含量由下列物質(zhì)組成 低聚糖40% 80%， 氨基酸3% 12%， 明膠3% 12%, 酪蛋白水解物3% 12%， 聚乙烯基吡咯烷酮3% 12%， 甘油3% 12%, 普魯尼克-68 3%-12%ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述耐熱保護(hù)劑，其特征在于所述低聚糖選自海藻糖、蔗糖、乳糖和菊糖中的一種或兩種以上的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述耐熱保護(hù)劑，其特征在于所述氨基酸選自精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、谷氨酸和異亮氨酸中的一種或兩種以上的混合物。
4.一種權(quán)利要求1 一 3之一所述耐熱保護(hù)劑在制備活疫苗凍干粉中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于用溶劑溶解耐熱保護(hù)劑，得到保護(hù)劑溶液；將保護(hù)劑溶液與活病毒液混合，得到活疫苗；將活疫苗進(jìn)行冷凍干燥即得活疫苗凍干粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于所述溶劑為無(wú)菌的生理鹽水、注射用水、PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液或Hank’ s液，所述耐熱保護(hù)劑與溶劑的質(zhì)量比為3:6 8。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于所述保護(hù)劑溶液與活病毒液按照質(zhì)量比為1:0. 5 2混合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于所述活病毒液為雞新城疫病毒液或豬繁殖與呼吸綜合征病毒液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述應(yīng)用，其特征在于冷凍干燥的方法為將活疫苗在常壓、溫度為-40°C _65°C條件下保持2 6小時(shí)，在真空度為O.1 10. Ombar溫度為-10°C 4°C條件下保持10 26小時(shí)，在真空度為O. 01 5. Ombar溫度為I (TC 28 °C條件下保持2 8小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種耐熱保護(hù)劑及其應(yīng)用，涉及活的微生物保存領(lǐng)域。所述耐熱保護(hù)劑，由下列物質(zhì)組成低聚糖40%～80%，氨基酸3%～12%，明膠3%～12%，酪蛋白水解物3%～12%，聚乙烯基吡咯烷酮3%～12%，甘油3%～12%，普魯尼克-683%-12%。本發(fā)明還提供耐熱保護(hù)劑在制備活疫苗凍干粉中的應(yīng)用。用溶劑溶解耐熱保護(hù)劑，得到保護(hù)劑溶液；將保護(hù)劑溶液與活病毒液混合，得到活疫苗；將活疫苗進(jìn)行冷凍干燥即得活疫苗凍干粉。本發(fā)明耐熱保護(hù)劑能提高活疫苗的耐熱性能，采用該耐熱保護(hù)劑制備的活疫苗凍干粉在37℃保存2個(gè)月，15℃條件下保存24個(gè)月。
文檔編號(hào)A61K47/42GK103041399SQ20131000460
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月7日
發(fā)明者盧宇, 呂芳, 鄧碧華, 張金秋, 侯繼波 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院