專利名稱：法倔唑在誘導(dǎo)羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途仓械膽?yīng)用及其誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于魚類遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，涉及芳香化酶抑制劑法倔唑(Fadrozole)在 誘導(dǎo)羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途仓械膽?yīng)用，以及利用法倔唑誘導(dǎo)羅非魚已分化卵 巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途驳姆椒ā?br> 背景技術(shù)：
羅非魚又稱非洲鯽魚，具有食性雜、生長快、繁殖強、味道鮮美且肌間刺少等優(yōu)良 特征，現(xiàn)已成為世界性主要養(yǎng)殖魚類之一，主要養(yǎng)殖品種有莫桑比克羅非魚、尼羅羅非魚、 奧利亞羅非魚和吉富羅非魚等。近年來，全球羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年遞增，我國羅非魚產(chǎn)量已 由1987年的不足3. 5萬噸增長到2007年的113萬噸，占世界產(chǎn)量的43. 5%，2010年還有望 達(dá)到120萬噸。目前，我國已成為全球最大的羅非魚生產(chǎn)國和出口國。在羅非魚的養(yǎng)殖過程中，由于雌魚3個月性腺已明顯分化為卵巢，8個月左右達(dá)到 性成熟，每15-20天就要繁殖一次，將會在池塘里產(chǎn)生大量小羅非魚，而小羅非魚會競爭營 養(yǎng)物質(zhì)、溶氧及空間，且在年終不能長成商品規(guī)格，從而會大大影響羅非魚養(yǎng)殖的產(chǎn)量和效 益。因此，如果能夠在養(yǎng)殖過程中人工控制羅非魚的性別，對雌性羅非魚進(jìn)行性逆轉(zhuǎn)，將大 大提高羅非魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量，降低養(yǎng)殖成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。目前，對羅非魚進(jìn)行性逆轉(zhuǎn)大多數(shù)是在羅非魚性別決定與分化的敏感期進(jìn)行激素 處理，以誘導(dǎo)完全的性逆轉(zhuǎn)。但由于羅非魚性別決定與分化的敏感期非常短(通常僅孵化后 3-5天)，不容易把握，且此時魚體較小，抵抗力弱，激素處理會對魚體產(chǎn)生一定損害甚至導(dǎo) 致魚體死亡，從而使性逆轉(zhuǎn)魚的獲得率大大降低。而如何通過人為因素在雌性羅非魚性腺 已明顯分化為卵巢后，再誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途?，尚未見文獻(xiàn)報道。芳香化酶是類固醇激素合成的末端限速酶，直接參與調(diào)控雌激素的合成。有文獻(xiàn) 報道，在魚類性腺分化前，注射芳香化酶抑制劑能夠阻斷魚體內(nèi)雌激素合成，將遺傳性別為 雌性的個體逆轉(zhuǎn)為表型性別為雄性的個體，使性腺發(fā)育為功能性精巢。但在雌魚性腺已分 化為卵巢后，芳香化酶抑制劑還能否誘導(dǎo)其已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途?，迄今為止國?nèi) 外尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于考察芳香化酶抑制劑是否能夠誘導(dǎo)羅非魚已分化卵 巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途?，從而建立一種誘導(dǎo)羅非魚由雌性個體向雄性個體性逆轉(zhuǎn)的新方法， 為研究羅非魚性別決定與分化的分子機制提供可靠的實驗?zāi)Ｐ停瑫r為羅非魚性別控制和 單性育種研究開辟新的技術(shù)途徑。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明考察了芳香化酶抑制劑法倔唑(Fadrozole)對誘導(dǎo)尼羅 羅非魚(flreocAroffiis niloticus)已分化卵巢向功能型精巢轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果顯示，向性腺 已明顯分化為卵巢的3月齡雌性尼羅羅非魚投喂含有法倔唑的餌料，法倔唑含量為400μβ/g，連續(xù)投喂90天，可以誘導(dǎo)尼羅羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途?。由此，本發(fā)明提供 如下技術(shù)方案
1、 法倔唑在誘導(dǎo)羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途仓械膽?yīng)用。進(jìn)一步，所述羅非魚為尼羅羅非魚。2、利用法倔唑誘導(dǎo)羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途驳姆椒?，是向性腺已分?為卵巢的雌性羅非魚連續(xù)投喂含有法倔唑的餌料，直至卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途病．?dāng)所述羅非魚為尼羅羅非魚時，上述方法可以具體為向3月齡的雌性尼羅羅非 魚投喂含有法倔唑的餌料，法倔唑含量為40(^g/g，連續(xù)投喂90天。3、用于誘導(dǎo)羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途驳酿D料，其中含有法倔唑。當(dāng)所述羅非魚為尼羅羅非魚時，上述餌料中法倔唑的含量為40(^g/g。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明利用芳香化酶抑制劑法倔唑誘導(dǎo)羅非魚已分化 卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄跃?，這是在整個脊椎動物除了天然性逆轉(zhuǎn)種類外，首次通過人為因素 實現(xiàn)已分化卵巢再分化為功能型精巢，建立了誘導(dǎo)羅非魚由雌性個體向雄性個體性逆轉(zhuǎn)的 新方法，不僅為研究羅非魚性別決定與分化的分子機制提供了可靠的實驗?zāi)Ｐ?，而且為羅 非魚性別控制和單性育種開辟了新的技術(shù)途徑，適宜在羅非魚以及其他養(yǎng)殖魚類上推廣應(yīng) 用，對養(yǎng)殖魚類性別控制和單性育種具有重要意義和應(yīng)用價值。


圖1為投喂含有法倔唑的餌料誘導(dǎo)3月齡雌性尼羅羅非魚性逆轉(zhuǎn)過程中不同階 段的性腺組織學(xué)觀察(H. E染色)，其中圖A為3月齡正常雌魚卵巢結(jié)構(gòu)；圖B為3月齡正常 雄魚精巢結(jié)構(gòu)；圖C為3月齡正常雌魚經(jīng)法倔唑誘導(dǎo)70天后的性腺結(jié)構(gòu)；圖D為3月齡正 常雌魚經(jīng)法倔唑誘導(dǎo)90天后的性腺結(jié)構(gòu)；圖A和圖B的標(biāo)尺為20Mm，圖C和圖D的標(biāo)尺為 IOMm0
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu) 選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。1、含有法倔唑的餌料的配制
稱取法倔唑0. 5g，用無水乙醇50ml溶解制成濃度為10mg/ml的母液，再吸取上述母液 8ml，用無水乙醇稀釋至100ml，再加至尼羅羅非魚養(yǎng)殖餌料200g中，攪拌混勻，自然晾干或 37°C烘干，即得含有法倔唑的餌料，法倔唑含量為40(^g/g。同時配制空白對照餌料，向尼羅 羅非魚養(yǎng)殖餌料200g中加入無水乙醇100ml，攪拌混勻，自然晾干或37°C烘干，即得。2、投喂誘導(dǎo)尼羅羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄跃?br> 將尼羅羅非魚假雄魚(XX 與正常尼羅羅非魚雌性(XX早)繁殖，獲得全雌尼羅羅非 魚種群，投喂正常餌料在水溫27°c的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中將其養(yǎng)至3月齡，隨機分為空白對 照組和實驗組，空白對照組投喂上述制備的空白對照餌料，實驗組投喂上述制備的含有法 倔唑的餌料，連續(xù)投喂90天。3、尼羅羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)榫驳臋z測 (1)顯微鏡下鏡檢精液取經(jīng)法倔唑誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)90天后的實驗組尼羅羅非魚，輕壓其腹部，收集精液，采用平 板載片法，滴1滴實驗液于平板載片上，用解剖針針尖蘸取少許精液與實驗液調(diào)勻，在低倍 鏡下觀察。結(jié)果顯示，實驗組尼羅羅非魚精液中含有大量精子，說明雌性尼羅羅非魚的卵巢 已轉(zhuǎn)變?yōu)榫病?br>
(2)組織學(xué)觀察性腺結(jié)構(gòu)
分別在法倔唑誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)前以及誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)70天和90天后，解剖取出空白對照組和 實驗組尼羅羅非魚的性腺，Bouin's液固定，石蠟切片，經(jīng)各級乙醇脫水、二甲苯透明和石蠟 包埋，作連續(xù)橫切5Mm切片，H. E染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其性腺結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖1所示，3 月齡正常雌性尼羅羅非魚的性腺中含有大量的卵原細(xì)胞和各級卵母細(xì)胞，說明性腺已明顯 分化為卵巢(圖1A)；對比3月齡正常雄性尼羅羅非魚的性腺，可見其性腺中含有大量的精 原細(xì)胞、各級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子性腺，說明性腺已明顯分化為精巢(圖1B);3月齡正 常雌性尼羅羅非魚經(jīng)法倔唑誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)70天后，其性腺大部分轉(zhuǎn)變?yōu)榫步Y(jié)構(gòu)，含精原細(xì) 胞、各級精母細(xì)胞和精子細(xì)胞，僅在性腺的背部與身體連接處存在正在退化的卵母細(xì)胞(圖 1C);經(jīng)法倔唑誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)90天后，其性腺完全轉(zhuǎn)變?yōu)榫步Y(jié)構(gòu)，含精原細(xì)胞、各級精母細(xì)胞 和精子細(xì)胞(圖1D)。4、性逆轉(zhuǎn)雄魚的精巢功能性驗證 (1)人工授精驗證性逆轉(zhuǎn)雄魚的精巢功能
取上述法倔唑誘導(dǎo)的性逆轉(zhuǎn)雄魚，輕壓其腹部，收集精液；另外，收集正常發(fā)育即將產(chǎn) 卵的雌性尼羅羅非魚卵子；將收集的精液和卵子混合，采用干法授精技術(shù)進(jìn)行人工授精，將 受精卵在水溫27°C的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行孵化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述受精卵可以孵化出正常 發(fā)育的子代尼羅羅非魚，表明經(jīng)法倔唑誘導(dǎo)的由卵巢轉(zhuǎn)變而來的精巢具有正常功能，產(chǎn)生 的精子能夠正常受精。(2)與正常雌魚混養(yǎng)雜交驗證精巢功能
將上述法倔唑誘導(dǎo)的性逆轉(zhuǎn)雄魚與已性成熟且性腺發(fā)育正常的雌性尼羅羅非魚混合 飼養(yǎng)，投喂正常餌料，水溫26-27°C，自然光周期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述混養(yǎng)的雌、雄魚可以繁殖出 正常發(fā)育的子代尼羅羅非魚，表明經(jīng)法倔唑誘導(dǎo)的由卵巢轉(zhuǎn)變而來的精巢所產(chǎn)生的精子能 夠正常受精，繁育后代。綜合上述實驗結(jié)果，可以得出如下結(jié)論芳香化酶抑制劑法倔唑能夠用于誘導(dǎo)尼 羅羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄跃?，鑒于不同品種羅非魚之間性質(zhì)相似，因此，本領(lǐng)域 技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的記載，可以推知本發(fā)明也適用于其它品種的羅非魚，即法倔唑能夠 用于誘導(dǎo)羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄跃玻湔T導(dǎo)方法是向性腺已分化為卵巢的雌性 羅非魚連續(xù)投喂含有法倔唑的餌料，直至卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途?。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可 以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.法倔唑在誘導(dǎo)羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途仓械膽?yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的法倔唑的應(yīng)用，其特征在于所述羅非魚為尼羅羅非魚。
3.利用法倔唑誘導(dǎo)羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途驳姆椒?，其特征在于向性?已分化為卵巢的雌性羅非魚連續(xù)投喂含有法倔唑的餌料，直至卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途病?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用法倔唑誘導(dǎo)羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途驳姆?法，其特征在于所述羅非魚為尼羅羅非魚。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用法倔唑誘導(dǎo)羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途驳姆?法，其特征在于向3月齡的雌性尼羅羅非魚投喂含有法倔唑的餌料，法倔唑含量為400μβ/ g，連續(xù)投喂90天。
6.用于誘導(dǎo)羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途驳酿D料，其特征在于含有法倔唑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于誘導(dǎo)羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途驳酿D料，其 特征在于所述羅非魚為尼羅羅非魚。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于誘導(dǎo)羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途驳酿D料，其 特征在于所述餌料中法倔唑的含量為40(^g/g。
全文摘要
本發(fā)明屬于魚類遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，涉及法倔唑(Fadrozole)在誘導(dǎo)羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途仓械膽?yīng)用，還涉及利用法倔唑誘導(dǎo)羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途驳姆椒?，即向性腺已分化為卵巢的雌性羅非魚連續(xù)投喂含有法倔唑的餌料，直至卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄途?；本發(fā)明利用芳香化酶抑制劑法倔唑誘導(dǎo)羅非魚已分化卵巢轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄跃?，這是在整個脊椎動物除了天然性逆轉(zhuǎn)種類外，首次通過人為因素實現(xiàn)已分化卵巢再分化為功能型精巢，建立了誘導(dǎo)羅非魚由雌性個體向雄性個體性逆轉(zhuǎn)的新方法，不僅為研究羅非魚性別決定與分化的分子機制提供了可靠的實驗?zāi)Ｐ?，而且為羅非魚性別控制和單性育種開辟了新的技術(shù)途徑。
文檔編號A61P5/32GK102068429SQ20101060941
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月28日
發(fā)明者劉智皓, 孫運侶, 楊世杰, 王德壽, 黃寶鋒 申請人:西南大學(xué)