專利名稱：卵內接種抗球蟲病疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及給家禽接種抗球蟲病疫苗的方法。具體地說，本發(fā)明涉及向家禽的發(fā)育卵內投用活的艾美球蟲(Eimeria spp)子孢子或裂殖子或其混合物以免疫孵化的雞，使之產生抗球蟲病免疫力。
球蟲病是一種由艾美球蟲屬的細胞內原生動物寄生蟲感染引起的家禽腸道疾病。球蟲病是經濟上損害巨大的家禽寄生蟲病。據估計，每年因使用抗球蟲病藥物的花費及由于球蟲病給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成的損失多達數億美元。
早在50年代即已有試圖給家禽接種抗球蟲病疫苗的報導。目前的疫苗接種方法包括通過飼料和水給禽類投用活的艾美球蟲卵囊。然而，由于并不是所有禽類都得到預定劑量的卵囊，并且許多禽類未受到疫苗的保護或者接受病原感染，所以這些方法是很不方便而且無效的。
在J.M.Sharma and B.R.Burmester，Avian Dis，26134-149，1981中，作者報導了卵內接種火雞皰疹病毒的雞發(fā)展了對抗繼后Marek氏病病毒攻擊的免疫力。在歐洲專利公開NO，291173中描述了卵內投用非復制性免疫原的免疫方法。該歐洲專利中具體提到的免疫原是基因工程產生的艾美球蟲抗原和艾美球蟲卵囊提取物。該歐洲專利特別排除了活寄生蟲階段的抗原，例如用于本文要求保護之接種方法中的那些抗原。
本發(fā)明疫苗接種方法包括向家禽的發(fā)育卵內卵內投用活艾美球蟲子孢子或裂殖子，或其混合物?？色@得的文獻提示，這樣的卵內疫苗接種方法是無效的并且應在孵化后應用。在T.K.Jeffers andG.E.Wagenbach，J.Parasit.56(4)656-662，1970中，在保溫第10天卵內注射禽艾美球蟲(E.tenella)子孢子沒有提供對抗繼后E.tenella卵囊攻擊的顯著的免疫學保護作用。事實上，他們報導沒有接受處理的雞在經受繼后E.tenella卵囊攻擊后，比已用子孢子卵內處理的雞有更高的存活率。在K.L.Watkins et al.，Proc.Vl th.InternationalCoccidiosis Conf.，Abstract E1-2，Ontario，Canada，1993中，作者描述了卵內接種活的最大艾美球蟲(E.maxima)孢子囊和形成孢子之卵囊的方法，結論是他們的研究沒有為進行卵內接種可保護家禽在孵化后第10天免于遭受最大艾美球蟲攻擊提供證據。他們還認為，如果在孵化后很快接種而不是卵內接種，可提供顯著的免疫學保護作用。與這一教導相反，本發(fā)明的卵內接種疫苗的方法則提供了不可預見的免疫力，從而保護孵化的家禽免于遭受繼后的球蟲攻擊。
本發(fā)明—本文也稱為″本疫苗接種方法″—涉及給家禽進行疫苗接種以對抗球蟲病的方法，包括在孵育的最后四分之一期間，卵內投用有效免疫劑量的活艾美球蟲子孢子或裂殖子，或其混合物。
本文所使用的術語″家禽″，除另外說明之外，包括雞、火雞、鴨、狩獵野禽(包括但不只限于雉、鵪鶉、及鵝)和平胸鳥(包括但不只限于鴕鳥)。
除特別說明外，術語″卵內″是指進入含有活的發(fā)育期胚胎的家禽卵。
除另有說明之外，本文所使用的術語″卵內投用″是指借助穿透卵殼并導入疫苗的任何方法給含有活的發(fā)育期胚胎的家禽投用本文所述的疫苗。這種投用方法包括但不只限于注射疫苗。
除另有說明之外，本文所使用的術語″孵育的最后四分之一期間″是指家禽的發(fā)育卵的最后四分之一孵育期間。
除另有說明之外，本文使用的術語″艾美球蟲″是指感染家禽的一個種或多個種的艾美球蟲屬球蟲。這樣的艾美球蟲種包括發(fā)現于雞中的禽艾美球蟲(E.tenella)、E.acervulina、E.maxima、扁嘴艾美球蟲(E.necatrix)、E.mitis、E.praecox和E.brunetti，以及發(fā)現于火雞中的E.meleagrimitis，E.adenoeides、E.gallopavonis、E.dispersa、E.meleagridis、E.innocua和E.subrotunda，以及還有感染如上文所述其他家禽的其他種的艾美球蟲。術語″艾美球蟲″還包括前述艾美球蟲種的所有品系，包括但不只限于早熟品系、減毒品系、其中又包括經過照射處理或其他處理從而沒有完全發(fā)育的品系。術語″艾美球蟲″還包括新發(fā)現的感染上述家禽的品系或艾美球蟲種。
除另有說明之外，本文所用的術語″子孢子″、″孢子囊″、″卵囊″和″裂殖子″是指活的艾美球蟲子孢子、孢子囊、卵囊和裂殖子。
除非另外指出，本文所用的術語″有效免疫劑量″是指子孢子或裂殖子的數目，或當混合時子孢子和裂殖子的數目足以在孵化的家禽體內提供比非經免疫家禽的固有免疫力更大的免疫學保護作用。本文所使用的術語″免疫″和″疫苗接種″是同義詞并可以相互代用。
按照本發(fā)明的方法投用的優(yōu)選劑量包括10至106個子孢子或裂殖子，或者其中所說子孢子和裂殖子的總數為10至106個的混合物。
更優(yōu)選的劑量包括103至106個子孢子或裂殖子，或者其總數目為103至106個的所說子孢子與裂殖子的混合物。
另一個優(yōu)選劑量包括102至105個子孢子或裂殖子，或者其總數目為102至105的所說子孢子與裂殖子的混合物。
按照本發(fā)明的方法進行疫苗接種的優(yōu)選家禽是雞。
向雞卵內投用的優(yōu)選劑量內包含選自禽艾美球蟲、E.acervulina、E.maxima、扁嘴艾美球蟲、E.mitis、E.praecox和E.brunetti中之兩個種或多個種的艾美球蟲的子孢子或裂殖子，或其混合物。對于包含于每個劑量中的每個種的艾美球蟲而言，優(yōu)選劑量包括10至106個子孢子或裂殖子，或其混合物。
按照本發(fā)明的方法進行疫苗接種的另一種優(yōu)選家禽是火雞。
向火雞卵內投用的優(yōu)選劑量內包含選自E.meleagrimitis、E.adenoeides、E.gallopavonis、E.dispersa、E.meleagridis，E.innocua和E.subrotunda中之兩個種或多個種的艾美球蟲的子孢子或裂殖子，或其混合物。對于包含于每個劑量中的每個種的艾美球蟲而言，優(yōu)選劑量包含10至106個子孢子或裂殖子，或其混合物。
按照本發(fā)明的方法進行疫苗接種的其他優(yōu)選家禽是狩獵野禽、鴨和平胸鳥。
本發(fā)明的方法進一步包括與本疫苗接種方法聯合，在孵育的任何時間卵內投用免疫刺激劑。
投用免疫刺激劑的優(yōu)選方法是在孵育的最后四分之一時間里與卵內投用子孢子或裂殖子，或所說子孢子和裂殖子的混合物的同時進行投用。
本疫苗接種方法包括在孵育的最后四分之一時間里向家禽卵內投用活的艾美球蟲子孢子或裂殖子，或其混合物。就雞來說，卵內投用較好是在孵育的第15-20天進行，最好在孵育的第18天進行。就火雞來說，卵內投用較好是在孵育的第21-26天進行。
可以使用任何一種適用卵內給藥的方法完成本疫苗接種方法。本疫苗較好是通過注射投用。按照一種注射方法，使用18號針頭在卵的大端卵殼上刺一個孔以暴露卵的氣室?？赏ㄟ^該孔并通過氣室的膜插入一個連接到適當大小(1-3ml)之注射器上的1.0-1.5英寸22號針頭。將適當數目的子孢子或裂殖子，或當兩者混合時將適當數量的子孢子和裂殖子懸浮于適當的液體載體，例如10-500μl磷酸鹽緩沖鹽水中，然后注入卵內。適宜的體積將取決于被處理卵的大小，顯然駝鳥卵可比雞卵攝取更大的體積。注射部位可在卵或胚胎的任何區(qū)域內。進行注射時較好是通過卵之大端的中心軸向進入羊膜內。
另外，本疫苗接種方法中也可使用自動卵注射系統。美國專利No，4,681,063、4,040,388、4,469,047和4,593,646(均列為本文參考文獻)中描述了這樣的系統。其他適當的注射方法是本領域技術人員已知的。
可用本領域技術人員已知的幾種方法中的任何一種方法制備卵囊，其中包括J.F.Ryley et al.，Parasitology 73311-326，1976和P.L.Long et al.，Folia Veterinaria Latina V1#3，201-217，1976(均列為本文參考文獻)中所描述的方法。按照一種方法，經管飼法口服適當量的形成孢子的卵囊，用特定種的艾美球蟲感染約2周齡的市售肉用子雞。例如，禽艾美球蟲(E.tenella)的典型使用劑量為200,000個形成孢子的卵囊/家禽。然后按照已知的方法收集和純化被感染家禽的卵囊。對于大多數種的艾美球蟲來說，感染后5-7天收集被感染家禽糞便，攪拌并過濾除去殘渣，然后以足以沉淀余留糞便材料的速度離心。對于禽艾美球蟲也使用相似的方法，但在感染后第6天取盲核(cecal cores)。將離心沉淀物重新懸浮在飽和鹽溶液中，在其中可經離心除去卵囊懸浮物和大部分污染的碎片。然后將卵囊懸液稀釋到較低的鹽濃度。反復洗卵囊以除去鹽并再次懸浮于重鉻酸鉀溶液(2.5％W/V)中。振蕩下(如140rpm)于29℃將卵囊懸液保溫約72小時以誘導卵囊的孢子形成?；蛘?，也可使用次氯酸鈉溶液處理卵囊，然后使之形成孢子。使用血細胞計數器直接計數以確定每毫升中形成孢子之卵囊的數目，優(yōu)選在冷凍條件下貯存培養(yǎng)物備用。
為了制備孢子囊，經反復清洗卵囊而從上述卵囊懸液中除去重鉻酸鉀，清洗方法包括離心收集卵囊并重新懸浮于去離子水或蒸餾水中。在根據沒有澄黃顏色判定已去掉了重鉻酸鹽之后，將卵囊懸液與等體積次氯酸鈉(漂白劑)混合并于室溫下孵育15分鐘。經反復洗滌除去漂白劑，并將卵囊重新懸浮在生理鹽水或去離子水中。可使用各種已知技術破壞卵囊以釋放出孢子囊。例如，可將卵囊與直徑1-4mm的玻璃珠混合，并用手動、渦旋混合器、或振蕩孵育器振蕩，或者使用手動勻漿器破壞卵囊以釋放孢子囊。可以按Dulski etal.，Avian Diseases，32235-239，1988中所述的方法，在50％PercollTM(由Pharmacia Biotech出售)或1M蔗糖中經差速離心從釋放的孢子囊中分離出未被破壞的卵囊和卵囊壁。
為了制備將按照本發(fā)明使用的子孢子或富含子孢子的制劑，使子孢子從上述孢子囊制劑中脫囊。一種方法是，離心沉淀按上述方法制備的孢子囊，重新懸浮于脫囊緩沖液(0.5％牛脫氧磺膽酸和0.25％胰蛋白酶，加在磷酸鹽緩沖鹽水(pH8.0中)中并于41℃振蕩孵育1小時。計數所得懸液的樣品以確定子孢子的數目，將子孢子洗一次以除去脫囊緩沖液，并以卵內注射所需的濃度重新懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水中。該制劑含有子孢子、孢子囊及卵囊，并且不經進一步純化即可按本發(fā)明接種方法使用?？梢杂肈.M.Schmatz et al.，J.Protozool.31181-183，1984(列為本文參考文獻)中所述的DE-52陰離子交換層析法從孢子囊和卵囊中分離出純化的子孢子。用于本疫苗接種方法中之子孢子的劑量將依據被接種之家禽的類型和用于疫苗中之艾美球蟲的品種的不同而有所變化。一般說來，該劑量范圍可以為每只卵10至106個子孢子，較好是每只卵10至105個子孢子，最好是每只卵102至105個子孢子。
可用本領域技術人員已知多種方法制備裂殖子。一種方法是，使用D.J.Doran.，J.Parasit.57891-900，1971(列為本文參考文獻)中描述的改進方法，將子孢子感染到作為細胞凝集體生長于培養(yǎng)基中的初級雞腎細胞(PCK)中。PCK細胞在3％CO2環(huán)境下于40℃生長于如S.D.Chung et al.，J.Cell Biol.95118-126，1982中所述的添加了胎牛血清、青霉素-鏈霉素、15mM碳酸氫鈉、10ng/ml表皮生長因子、5μg/ml胰島素、5μg/ml轉鐵蛋白、5ng/ml亞硒酸和0.01μM鹽酸氫化可的松的含L-谷氨酰胺及15mMHEPES的改良RK2培養(yǎng)基-DMEM/F12中。經切碎雞腎臟，然后用加在磷酸鹽緩沖鹽水溶液中的0.2mg/ml膠原酶(由Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ出售)于37℃將組織處理幾次，以從2至3周齡雞的腎臟制備PCK。洗滌上清液中的細胞聚集體，重新懸浮在含有5％胎牛血清的改良的RK2培養(yǎng)基中，并用于以每cm2含105個聚集體的密度接種組織培養(yǎng)瓶。于3％CO2環(huán)境中將PCK細胞40℃保溫18小時，然后用4×105子孢子/cm2感染之。在含有2％胎牛血清的改良的RK2培養(yǎng)基中培養(yǎng)被感染的培養(yǎng)物。保溫24小時后，使之侵染，攪動培養(yǎng)物并除去培養(yǎng)基來除去未受侵染的子孢子。用含有2％胎牛血清的改良的RK2培養(yǎng)基將細胞層洗一次并再次棄去培養(yǎng)基。加入新鮮RK2培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)物繼續(xù)保溫48至54小時，直到裂殖子釋放到培養(yǎng)基中。
可用本領域技術人員已知的多種已知方法純化裂殖子以除去宿主細胞碎片。按照如J.A.Olson，Antimicrob.AgentsChemother.341435-1439，1990中所述的方法，收集含有釋放之裂殖子的培養(yǎng)基，并以450xg旋轉10分鐘以濃縮裂殖子。將含有裂殖子和宿主細胞碎片的沉淀物懸浮在0.1M NaCl-0.05M KCl-20％牛血清白蛋白中，并加樣于用75mM Tris-40mMNaH2PO4-86mM NaCl-100mM葡萄糖(pH8.2)平衡的DE-52陰離子交換柱上。裂殖子流經層析柱?？砂碅.Kilejian，J.Biol.Chem.2494650-4655，1974中所述的方法，用電子顯微鏡檢查從柱上收集之裂殖子的純度。一般說來，裂殖子劑量可在每只卵10至106個裂殖子范圍內，較好為每只卵10至105個裂殖子，最好每只卵102至105個裂殖子。當子孢子和裂殖子混合時，該劑量一般包含每只卵總共10至106個裂殖子和子孢子，較好為每只卵共10至105個裂殖子和子孢子，最好為每只卵共102至105個裂殖子和子孢子。
可以將子孢子或裂殖子或其混合物加在任何適當的生理介質中進行卵內注射。較好將其加在生理平衡鹽水如磷酸鹽緩沖鹽水中。選用介質可選擇地包含包括生理上適用的凝膠、白明膠、水溶膠、纖維素或多糖樹膠等的一種或多種懸浮劑。
在本疫苗接種方法中，較好在同一時間卵內注射兩個或多個艾美球蟲種的子孢子或裂殖子或其混合物。按照本疫苗接種方法，可以在同一時間或連續(xù)以適當的劑量卵內注射感染特定家禽如雞的所有已鑒定種之艾美球蟲的子孢子或裂殖子，或其混合物，以提供對抗所有種之艾美球蟲的免疫學保護作用。
在本疫苗接種方法中可聯合使用免疫刺激劑。適用的免疫刺激劑包括但不只限于細胞因子、生長因子、趨化因子、淋巴細胞、單核細胞或淋巴樣器官之細胞培養(yǎng)物的上清液，細胞制劑或細胞提取物(例如金黃色葡萄球菌或脂多糖制劑)、促細胞分裂原、或包括低分子量藥物的佐劑?？梢栽诜跤陂g的任何時候卵內投用免疫刺激劑。較好將免疫刺激劑加在含有艾美球蟲子孢子或裂殖子或其混合物的介質中投用。
下列實施例舉例說明了本發(fā)明抗球蟲病疫苗接種的效力。將每劑疫苗加于上述生理上可接受的鹽水內進行卵內注射。經監(jiān)測其對孵化率和雞破殼體重、以及攻擊感染、卵囊產生、體重增加和病原性(損傷記分)的影響，以確定特定制劑的效力。按照J.K.Johnson andW.M.Reid，Exp.Parasitol.2830-36，1970中所述的方法確定損傷分數，其中O值代表沒有疾病，4分代表最大病理學改變。
實施例1于孵育的第18天用每只卵含有105個禽艾美球蟲子孢子的制劑對雞卵進行卵內注射。該制劑沒有經純化除去孢子囊和卵囊。各劑還含有大約104個禽艾美球蟲孢子囊和大約104個禽艾美球蟲卵囊。作為對照卵，只注射磷酸鹽緩沖鹽水溶液。在子孢子處理的家禽群體中，孵化后第7天平均脫出的卵囊為每只家禽1.1×106個卵囊。在孵化后第7、14或21天經口內管飼法用各種不同劑量的禽艾美球蟲形成孢子的卵囊，攻擊未經免疫的和子孢子處理的家禽。數據示于表1中。
表1免疫的對未免疫的家禽在孵化后不同時間對不同攻擊劑量的反應
1.孵化后第7、14或21天對各組進行形成孢子之卵囊的單一攻擊。例如，在孵化后第21天攻擊的家禽未在孵化后第7或14天受到攻擊。*與未經免疫的家禽有顯著性差異(P＜0.05，ANOVA)。
如由經免疫的家禽減少了損傷數并改善了體重增加量所指示的，表1的數據表明經免疫的家禽比未經免疫的對照家禽對感染的敏感性小。數據還證明，本發(fā)明的方法可在相對早的齡期(孵化后7天之內)給雞賦予了免疫力。再者，數據表明隨著雞的生長和發(fā)育，免疫力仍持續(xù)存在。由于肉用子雞通常在6周齡上市，所以在較早齡期給雞賦予免疫力在肉用子雞生產工業(yè)中具有重要意義。
實施例2如提供了預攻擊結果的表2中所指出的，在孵育的第18天，對雞卵注射鹽水(對照組)或含有不同劑量禽艾美球蟲子孢子的制劑。所使用的子孢子制劑每劑含有62％子孢子、9％孢子囊和29％卵囊。含105個子孢子的每一劑量中包含總共1.6×105個不同生活階段的寄生蟲(子孢子、孢子囊和卵囊)。
表2卵內疫苗接種對孵化率和體重的影響
表2中所示數據表明，就孵化率和孵化體重來說，從注射了活子孢子的卵孵化的雞實質上與未經免疫的卵孵化出的對照雞相同。然后于孵化后第14天用每只卵1.25×104個禽艾美球蟲形成孢子的卵囊，以經口管飼投用的方法攻擊雞。攻擊后的結果示于表3中。
表3未經免疫的家禽與用不同劑量子孢子卵內處理的家禽對攻擊感染的反應的比較
*與受到攻擊的未經免疫組(接受了鹽水的)有顯著性差異(P＜0.05，ANOVA)。
表3中的數據顯示，從注射了不同劑量子孢子制劑的卵孵化之雞的各參數(體重增加、損傷分數、卵囊脫出)均提供了其產生免疫力的證據。與只用鹽水處理并受到攻擊感染的對照組家禽相比，用子孢子制劑卵內免疫的家禽顯示更大的體重增加和減少了的損傷分數。另外，用子孢子制劑卵內免疫的家禽在攻擊感染后比對照組家禽排出了較少的卵囊，表明經免疫的家禽遭受感染的程度較小。
權利要求
1.給家禽接種抗球蟲病疫苗的方法，其包括在孵育的最后四分之一期間內卵內投入有效免疫劑量的活艾美球蟲子孢子或裂殖子，或其混合物。
2.如權利要求1的方法，其中劑量包含10到106個子孢子或裂殖子，或其中所說的子孢子和裂殖子總數范圍為10到106個的混合物。
3.如權利要求1的方法，其中劑量包含103到106個子孢子或裂殖子，或其中所說的子孢子和裂殖子總數范圍為103到106個的混合物。
4，如權利要求1的方法，其中劑量包含102到105個子孢子或裂殖子，或其中所說的子孢子和裂殖子總數范圍為102到105個的混合物。
5，如權利要求2的方法，其中家禽是雞。
6，如權利要求5的方法，其中所說的劑量中包含選自禽艾美球蟲、E.acervulina、E.maxima、扁嘴艾美球蟲、E.mitis、E.Praecox和E.brunetti之兩個或多個種的艾美球蟲的子孢子或裂殖子或其混合物。
7.如權利要求6的方法，其中所說的劑量是經卵內注射投用的。
8.如權利要求2的方法，其進一步包括在孵育期間的任何時候卵內投用免疫刺激劑。
9.如權利要求8的方法，其中與子孢子或裂殖子或所說子孢子和裂殖子的混合物同時卵內投用免疫刺激劑。
10.如權利要求2的方法，其中所說的劑量包含裂殖子。
11.如權利要求2的方法，其中所說的劑量包含子孢子。
12.如權利要求11的方法，其中子孢子已經過純化而除去了孢子囊和卵囊。
13.如權利要求2的方法，其中家禽是火雞。
14.如權利要求13的方法，其中所說的劑量中包含選自E.meleagrimitis、E.adenoeides、E.gallopavonis、E.dispersa、E.meleagridis、E.innocua和E.subrotunda之兩個或多個種的艾美球蟲的子孢子或裂殖子，或其混合物。
15.如權利要求14的方法，其中所說的劑量是經卵內注射投用的。
16.如權利要求2的方法，其中家禽是狩獵野禽、鴨或平胸鳥。
全文摘要
本發(fā)明涉及給家禽投用疫苗以對抗球蟲病的方法，包括卵內投用有效免疫劑量的活的艾美球蟲子孢子或裂殖子，或其混合物。在一優(yōu)選實施方案中，進行疫苗接種的家禽是雞或火雞。
文檔編號A61K35/00GK1145168SQ9611038
公開日1997年3月19日 申請日期1996年6月6日 優(yōu)先權日1995年6月7日
發(fā)明者N·A·埃文斯, R·C·芬德利, F·H·韋伯 申請人:輝瑞大藥廠