專利名稱：乙型肝炎病毒表面l蛋白相關(guān)肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防、治療こ型肝炎病毒(human hepatitis B virus, HBV)感染的HBV表面L蛋白衍生肽、去除這些多肽抗原性的篩選方法以及通過該方法篩選得到的去抗原性衍生肽。特別是本發(fā)明涉及來源于B基因型adw血清型、C基因型adr血清型以及D基因型ayw血清型HBV的L蛋白pre_Sl區(qū)多肽。同樣特別地，本發(fā)明涉及去除HBV表面L蛋白衍生肽抗原性的篩選方法以及通過該方法獲得的可阻斷HBV感染卻不與抗體結(jié)合的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽。該去抗原性衍生肽可與抗HBV表面L蛋白抗體協(xié)同抑制HBV感染。
背景技術(shù)：
I. HBV的流行病學(xué)HBV感染是全球最為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，是僅次于性病和水痘的第三常見疾病。全球約有20億人感染過HBV，75%的世界人ロ生活在こ型肝炎高發(fā)區(qū)，慢性HBV感染者超過3. 5億。每年與HBV感染相關(guān)的死亡人數(shù)高達100萬(I)，每年新增感染估計是HIV新增感染的2. 5 4倍。世界上75%的HBV慢性感染者集中在亞洲(約為2. 87億)，中國是こ型肝炎的高流行區(qū)，70年代末和90年代初兩次全國肝炎流行病學(xué)調(diào)查的數(shù)據(jù)顯示，我國感染過HBV者6. 9億，感染率為57.6%，全國長期攜帶HBV者I. 2億，HBV表面抗原攜帶率9. 75%，現(xiàn)有的慢性こ型肝炎患者2000余萬，且自1995年開始，中國人群こ型肝炎發(fā)病比例呈逐年升高趨勢，因此在衛(wèi)生部《2005年衛(wèi)生工作要點》中已將こ型肝炎列入我國需要重點控制的四大疾病之一。2. HBV感染的預(yù)防與治療現(xiàn)狀HBV的重要性早已在世界范圍內(nèi)得到廣泛公認(rèn)，其預(yù)防和治療也被置于優(yōu)先地位。但迄今尚缺乏可清除體內(nèi)HBV的藥物，療效相對確切的抗病毒藥物主要是α干擾素和核苷類似物(拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋和特必夫定等)。α干擾素主要通過免疫調(diào)節(jié)和誘生靶細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白而發(fā)揮抗病毒作用；核苷類似物則作用于HBV逆轉(zhuǎn)錄酶，抑制病毒DNA鏈的合成，從而抑制HBV DNA的復(fù)制。經(jīng)過I年的標(biāo)準(zhǔn)療程治療，約33%的α干擾素治療患者和約16%的拉米夫定治療患者可獲得徹底或部分血清學(xué)應(yīng)答(HBsAg轉(zhuǎn)陰、HBeAg均轉(zhuǎn)陰、出現(xiàn)或不出現(xiàn)抗-HBe抗體)、完全的病毒學(xué)應(yīng)答(HBV DNA轉(zhuǎn)陰)和生化應(yīng)答(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶間隔I個月連續(xù)2次檢測均正常，肝功能復(fù)常)。自從1970年Krugman獲得最早的こ型肝炎疫苗后，各國相繼利用無癥狀HBsAg攜帶者的血漿提取血源性HBsAg制備HBV疫苗。血源性HBV疫苗經(jīng)過長期使用被證明安全有效，但由于其來源有限，制備成本高昂，已被基因重組HBV疫苗取代。目前主要的重組疫苗包括酵母和中國倉鼠卵巢細(xì)胞表達的重組こ肝疫苗。這些疫苗免疫原性強，3針全程免疫后抗HBsAg抗體陽轉(zhuǎn)率不低于85%。但其主要缺點是抗體應(yīng)答較遲，HBV感染產(chǎn)婦的新生兒初次免疫若超過7天以上，則失去HBV疫苗對新生兒阻斷垂直傳播的作用。而且10% 15%接種者不產(chǎn)生應(yīng)答或低應(yīng)答，該人群仍可被HBV感染。こ型肝炎免疫球蛋白(HBIG)系用經(jīng)こ型肝炎疫苗免疫健康人后，采集的高效價血漿或血清分離提取制備的免疫球蛋白制劑，其抗體效價在100IU/ml以上。適用于突發(fā)意外感染人群、免疫功能低下者以及HBV感染產(chǎn)婦新生兒的被動免疫預(yù)防。我國的慢性HBV感染者約有30%-50%通過母嬰傳播，為阻斷HBV母嬰圍產(chǎn)期傳播，普遍將HBIG與こ肝疫苗聯(lián)合應(yīng)用，雖然保護率可達80%以上，但HBIG提供的阻斷貢獻并不明顯，聯(lián)合應(yīng)用僅較こ肝疫苗單用提高5% 10%的阻斷率，而且聯(lián)合應(yīng)用后HBV感染產(chǎn)婦新生兒HBV感染率仍較健康產(chǎn)婦新生兒高4倍。近年發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)感染可能是母嬰傳播的重要途徑，HBV感染孕婦引產(chǎn)胎兒肝臟或血液的HBV感染標(biāo)志檢出率可達40%，HBsAg陽性母親的嬰兒的宮內(nèi)感染率約16%。因此國內(nèi)有些醫(yī)院在妊娠的最后3 4個月中對HBV感染孕婦每月一 次注射大于200IU的HBIG，以期預(yù)防胎兒HBV宮內(nèi)感染。但該方法宮內(nèi)傳播阻斷效果并不理想，且可能導(dǎo)致HBVS區(qū)變異株的出現(xiàn)和免疫復(fù)合物病理免疫反應(yīng)的發(fā)生。HBIG還廣泛應(yīng)用于こ型肝炎相關(guān)肝移植術(shù)后HBV感染復(fù)發(fā)的預(yù)防。在沒有預(yù)防措施的情況下，こ型肝炎相關(guān)肝移植術(shù)后6個月內(nèi)HBV再感染率高達約40%，2年內(nèi)再感染率高達約60%。多數(shù)再感染病例歷經(jīng)急性、慢性肝炎而發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭，遠(yuǎn)期預(yù)后不佳，需再次肝移植。単獨采用拉米夫定預(yù)防肝移植術(shù)后こ型肝炎復(fù)發(fā)，其長期HBV-DNA、HBeAg及HBsAg轉(zhuǎn)陰率約60 70%，且易發(fā)生HBV基因突變，YMDD耐藥變異率高達21%。加之患者移植前多長期使用抗病毒藥物，多數(shù)出現(xiàn)抗病毒藥物抵抗現(xiàn)象，増加了移植后病毒感染復(fù)發(fā)率和預(yù)防的難度。因此國外加用大劑量HBIG以預(yù)防こ型肝炎相關(guān)肝移植術(shù)后こ肝復(fù)發(fā)。肝移植術(shù)后沒有接受HBIG治療的受者中，術(shù)后早期體內(nèi)出現(xiàn)不同滴度的HBsAb，隨后血清HBsAb逐漸消失，而使用HBIG的患者血清HBsAb能長期維持較高滴度。高劑量無限制性HBIG單一治療能阻止65% 80%患者復(fù)發(fā)，但HBIG價格昂貴，費用每年高達約130萬元人民幣。國內(nèi)采用拉米夫定與小劑量HBIG聯(lián)合應(yīng)用阻止移植后HBV感染復(fù)發(fā)的療效雖然顯示良好，但未經(jīng)大樣本臨床試驗證實。且長期應(yīng)用HBIG帶來的免疫壓カ會造成HBV基因變異而出現(xiàn)免疫逃逸現(xiàn)象，使HBIG用于こ型肝炎相關(guān)肝移植術(shù)后HBV再感染的預(yù)防受到很大限制。綜上所述，目前用于防治HBV感染的手段主要限于核苷酸類似抑制物、抗病毒細(xì)胞因子和中和性抗體的主動被動免疫，缺少對HBV病毒其他感染環(huán)節(jié)的抑制手段。本發(fā)明所涉及的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽則可直接作用于HBV與肝細(xì)胞表面受體結(jié)合的最初感染環(huán)節(jié)，直接阻斷病毒對肝細(xì)胞的感染，為HBV感染的治療和預(yù)防提供新的手段。 3. HBV 病韋學(xué)I)概述HBV屬嗜肝DNA病毒科非細(xì)胞溶破性病毒。其基因組為部分雙鏈的環(huán)狀DNA，僅長約3. 2kb，是已知最小的DNA病毒。高度重疊的4個基因區(qū)編碼至少8種蛋白，即S區(qū)基因編碼的L、M、S表面抗原HBs ；C基因編碼的pre-C、HBc, HBe ；P基因編碼的聚合酶和X基因編碼的HBx。通常情況下HBV的感染和復(fù)制不引起肝細(xì)胞明顯的病理性改變，產(chǎn)生的病毒顆粒以分泌方式釋放。HBV產(chǎn)生的相關(guān)顆粒主要有3種形態(tài)，包括直徑42-47nm的Dane顆粒、豐度高于Dane顆粒10，000-1, 000，000倍的20nm球狀顆粒和少量直徑20nm長度不等的絲狀纖維。其中只有Dane顆粒由基因組DNA、病毒DNA聚合酶、核衣殼和被膜構(gòu)成，是HBV唯一具有感染活性的病毒性顆粒。2) HBV基因型、血清型及其流行病學(xué)分布目前HBV存在血清型和基因型兩種不同的分型體系。1972年Lebouvier等根據(jù)HBV表面蛋白HBsAg的共同抗原決定簇a以及相互排斥的兩對抗原決定簇d/y和w/r，將HBV分為adw, adr, ayw和ayr四個血清型。1978年Courouce Pauty等又將抗原決定簇w分為wl 4,加上新發(fā)現(xiàn)的抗原決定簇q,將HBV進ー步分為aywl, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2,adw4, adrq+和adrq-等9個血清型(2)。1988年以來，依據(jù)HBV全基因系統(tǒng)進化分析的結(jié)果，以全基因核苷酸異源性彡8%為分型標(biāo)準(zhǔn)，將HBV分為8個基因型(A H) (3，4)。各基因型之間的組合還可產(chǎn)生A/D、B/C、Ba和Bj等不同重組體。HBV血清 型和基因型之間的對應(yīng)關(guān)系見表I。雖然HBV感染在世界各地均有不同程度的流行，國家間和國內(nèi)地區(qū)間卻存在非常明顯的差異(表I)。我國A、B、C、D等基因型HBV感染均呈不同程度的存在，北方地區(qū)以C基因型為主，由北至南B基因型感染率逐漸增高，深圳B基因型和C基因型感染率比例相當(dāng)，西藏等少數(shù)民族地區(qū)D基因型有較高的感染率。我國adr、adw2、ayr、aywl、ayw2和ayw3等血清型HBV均有分布，但以adr和adw2為優(yōu)勢血清型。在我國B基因型與adw2血清型、C基因型與adr血清型存在明顯對應(yīng)關(guān)系。表I. HBV基因型和血清學(xué)亞型、HBV蛋白、PC/BCP突變的關(guān)系及主要流行地域基因型血清學(xué)型基因組長度(nt) HBVsAgPre-Sl氨基酸數(shù)主要流行地域
權(quán)利要求
1.ー種HBV表面L蛋白的多肽，其特征在于，所述多肽為B基因型adw血清型或C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白的第13到第59個氨基酸序列，其中，所述多肽的N末端被豆蘧酰化。
2.如權(quán)利要求I所述的多肽，其特征在于，所述B基因型adw血清型或C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。
3.如權(quán)利要求I所述的多肽，其特征在于，所述多肽選自SEQID N0:3-7，其中SEQ IDNO :3-7的第I個氨基酸甘氨酸被豆蘧?；揎?。
4.ー種HBV表面L蛋白的多肽，其特征在干，該多肽具有通式y(tǒng)-ζ，其中， y表示D基因型ayr血清型HBV表面L蛋白的第2到第32個氨基酸序列，其中，y的N末端被豆蘧?；? z表示D基因型ayr血清型HBV表面L蛋白第33到第47氨基酸序列，或自該序列C末端縮短的序列或完全缺失。
5.如權(quán)利4所述的多肽，其特征在于，所述D基因型ayr血清型HBV病毒表面L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。
6.如權(quán)利4或5所述的多肽，其特征在于，所述多肽的序列為SEQID NO :9，其第I位氨基酸甘氨酸被豆蘧?；揎?。
7.—種蛋白去抗原性衍生肽的篩選方法，用于去除抗原性而保留蛋白的特定屬性，其特征在于，該方法包括 (A)在待篩選的病毒蛋白中引入隨機序列，建立該蛋白特定區(qū)域或全部蛋白隨機編碼的重組病毒庫； (B)在待篩選蛋白抗體存在的條件下，篩選仍具有感染能力的重組病毒亞群，并獲得該重組病毒亞群中該蛋白的氨基酸序列，即獲得該蛋白去抗原性候選肽序列； (C)按獲得的去抗原性候選肽序列合成相應(yīng)的去抗原性候選肽，篩選可調(diào)節(jié)病毒感染能力卻不與該病毒蛋白抗體結(jié)合的去抗原性的多肽，即獲得蛋白去抗原性衍生肽。
8.—種HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽，它通過權(quán)利7所述方法對權(quán)利I所述的B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV表面L蛋白多肽進行篩選而得到，其特征在干，它具有通式 α - β 式中， α表示HBV表面L蛋白的第I到13位氨基酸序列，或自該序列N末端縮短的序列或僅為第13位氨基酸甘氨酸，其中，所述N末端和/或第13位氨基酸甘氨酸可被修飾； β表示應(yīng)用權(quán)利要求7所述的篩選方法對B基因型adw血清型和C基因型adr血清型HBV病毒表面L蛋白第14到第58氨基酸序列進行篩選獲得的氨基酸序列，其中，所獲得的氨基酸序列的N末端可被修飾和/或其C末端可被縮短或修飾。
9.ー種藥物組合物，其特征在于，它含有權(quán)利要求I 一 6中任一項所述的多肽或權(quán)利要求8所述的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽和藥學(xué)上可接受的載體。
10.權(quán)利要求I一 6中任一項任ー項所述的多肽或權(quán)利要求8所述的HBV表面L蛋白去抗原性衍生肽在制備預(yù)防和/或治療こ型肝炎的藥劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防、治療乙型肝炎病毒(HBV)感染的HBV表面L蛋白衍生肽、去除這些多肽抗原性的篩選方法以及通過該方法篩選得到的去抗原性衍生肽。HBV表面L蛋白pre-S1區(qū)含有病毒黏附細(xì)胞表面受體的關(guān)鍵性氨基酸序列以及與抗L蛋白抗體結(jié)合的抗原性氨基酸序列。本申請?zhí)峁┑腍BV表面L蛋白pre-S1區(qū)的多肽可抑制HBV對細(xì)胞的感染。本發(fā)明同時提供了去除這些多肽抗原性的篩選方法，并篩選出既可抑制HBV感染又不與抗體結(jié)合的去抗原性衍生肽，不僅解決了天然L蛋白衍生肽與抗L蛋白抗體之間在抑制HBV感染時的相互干擾，而且使去抗原性衍生肽與抗HBV表面L蛋白抗體發(fā)揮協(xié)同抑制HBV感染的作用。
文檔編號A61K39/29GK102675430SQ201210177978
公開日2012年9月19日 申請日期2005年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月12日
發(fā)明者劉宏利, 尹穎, 汪裕 申請人:上海賀普生物科技有限公司