專利名稱：一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組合物，具體涉及一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
卵巢早衰是指是指女性40歲前由于卵巢內(nèi)卵泡耗竭或醫(yī)源性損傷導(dǎo)致卵巢功能衰竭，以低雌激素及高促性腺激素為特征，病因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)此病與自身免疫、染色體異常、促性腺激素及受體異常、放射線等密切相關(guān)?，F(xiàn)有技術(shù)中治療卵巢早衰常用的激素類藥物，不良反應(yīng)較大，中醫(yī)在治療卵巢早衰方面具有獨特的優(yōu)勢，認為該病以腎虛為主，肝郁、脾 虛、氣血失調(diào)也是此病的重要病機。目前，尚沒有資料顯示二至丸和雞腰子的中藥組合臨床上用于治療卵巢功能早衰；因此，很有必要在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上研發(fā)出一種具有更好防治卵巢早衰功效，且不良反應(yīng)低的中藥組合物。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，本發(fā)明另一個目的是提供具有防治卵巢功能早衰作用制劑的制備方法。技術(shù)方案為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，它是由以下重量份數(shù)的原料制成女貞子2(Γ50份、墨旱蓮3(Γ50份、雞腰子10 60份。作為優(yōu)選方案，以上所述的具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，它是由以下重量份數(shù)的原料制成女貞子3(Γ40份、墨旱蓮3(Γ40份、雞腰子20 40份。本發(fā)明提供的具有防治卵巢功能早衰作用制劑的制備方法，其包括以下步驟(I)按重量份數(shù)比例取墨旱蓮，加6至12倍重量的水，煎煮I至3次，每次I至2小時，合并煎液，過濾，濃縮，濃縮液中加乙醇使乙醇的濃度達60%飛5%，靜置24小時，過濾，取上清液，減壓濃縮至稠膏，真空干燥，得墨旱蓮提取物；(2)取步驟(I)制備得到的墨旱蓮提取物，于女貞子、雞腰子混合均勻，粉碎成細粉；(3)取步驟(2)制備得到的細粉與藥學(xué)上可接受的載體制備成丸劑、顆粒劑、膠囊劑或片劑劑型的藥物。本發(fā)明在制成片劑時把有效成分細粉添加載體乳糖或玉米淀粉，需要時加入潤滑劑硬脂酸鎂，混合均勻，然后壓片制成片劑。在制成膠囊劑時，把有效成分細粉添加載體乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，然后裝膠囊制成膠囊劑。本發(fā)明在制成顆粒劑時，把有效成分細粉和稀釋劑乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，干燥，制成顆粒劑。
作為優(yōu)選方案，以上所述的具有防治卵巢功能早衰作用的組合物在制備防治卵巢功能早衰藥物中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明提供的具有防治卵巢功能早衰作用的組合物和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(I)本發(fā)明提供的具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，根據(jù)卵巢功能早衰的發(fā)病機制，在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，辨證論治通過大量實驗篩選中藥組方，實驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的組合物，可以明顯提高卵巢功能早衰小鼠的發(fā)育中卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)和黃體數(shù)，提高血清E2水平，并且能抑制卵巢功能早衰小鼠的卵巢PI3K和akt的表達，顯示出了比二至丸(女貞子和墨旱蓮)更好的抗卵巢功能早衰的功效，并且實驗過程中未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用安全。
(2)本發(fā)明提供的具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，可以方便和藥學(xué)載體制備成多種劑型，臨床上服用方便，且實驗結(jié)果表明本發(fā)明提供的組合物，療效可靠，使用安全，長期服用無毒副作用。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例II、一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，它是由以下重量份數(shù)的原料制成女貞子50份、墨旱蓮50份、雞腰子40份。2、具有防治卵巢功能早衰作用制劑的制備方法，其包括以下步驟(I)取墨旱蓮50份，加12倍重量的水，煎煮3次，每次2小時，合并煎液，過濾，濃縮至相對密度I. 10左右，濃縮液中加乙醇使乙醇的濃度達60%，靜置24小時，過濾，取上清液，減壓濃縮至稠膏，真空干燥，得墨旱蓮提取物；(2)取步驟(I)制備得到的墨旱蓮提取物，加入女貞子50份、雞腰子40份混合均勻，粉碎成細粉；(3)取步驟(2)制備得到的細粉加煉蜜適量，加水稀釋，作為粘合劑，制丸，干燥，即得。實施例2I、一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，它是由以下重量份數(shù)的原料制成女貞子50份、墨旱蓮50份、雞腰子50份。2、具有防治卵巢功能早衰作用制劑的制備方法，其包括以下步驟(I)取墨旱蓮50份，加10倍重量的水，煎煮2次，每次3小時，合并煎液，過濾，濃縮至相對密度I. 10左右，濃縮液中加乙醇使乙醇的濃度達60%，靜置24小時，過濾，取上清液，減壓濃縮至稠膏，真空干燥，得墨旱蓮提取物；(2)取步驟(I)制備得到的墨旱蓮提取物，加入女貞子50份、雞腰子50份混合均勻，粉碎成細粉；(3)取步驟(2)制備得到的細粉，加60%乙醇適量，作為粘合劑，制粒，干燥，整粒，壓片，即得片劑。實施例3I、一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，它是由以下重量份數(shù)的原料制成女貞子20份、墨旱蓮30份、雞腰子10份。2、具有防治卵巢功能早衰作用制劑的制備方法，其包括以下步驟(I)取墨旱蓮30份，加10倍重量的水，煎煮2次，每次2小時，合并煎液，過濾，濃縮至相對密度I. 10左右，濃縮液中加乙醇使乙醇的濃度達60%，靜置24小時，過濾，取上清液，減壓濃縮至稠膏，真空干燥，得墨旱蓮提取物；(2)取步驟(I)制備得到的墨旱蓮提取物，加入女貞子20份、雞腰子10份混合均勻，粉碎成細粉； (3)取步驟(2)制備得到的細粉，加60%乙醇適量，作為粘合劑，制粒，干燥，整粒，即得顆粒劑。實施例4I、一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，它是由以下重量份數(shù)的原料制成女貞子30份、墨旱蓮30份、雞腰子20份。2、具有防治卵巢功能早衰作用制劑的制備方法，其包括以下步驟(I)取墨旱蓮30份，加12倍重量的水，煎煮2次，每次I小時，合并煎液，過濾，濃縮至相對密度I. 10左右，濃縮液中加乙醇使乙醇的濃度達60%，靜置24小時，過濾，取上清液，減壓濃縮至稠膏，真空干燥，得墨旱蓮提取物；(2)取步驟(I)制備得到的墨旱蓮提取物，加入女貞子30份、雞腰子20份混合均勻，粉碎成細粉；(3)取步驟(2)制備得到的細粉，加60%乙醇適量，作為粘合劑，制粒，干燥，整粒，裝膠囊制成膠囊劑。實施例5藥理學(xué)實驗I實驗材料I. I藥物與試劑戊酸雌二醇片，拜耳醫(yī)藥保健廣州分公司；E2檢測試劑盒，美國R&D公司；PI3K，akt抗體購自Bioworld ;受試藥物本發(fā)明實施例I制備所得的丸劑，二至丸(蒸女貞子50份、墨旱蓮50份)由江蘇省中醫(yī)院制劑部提供。I. 2實驗動物Balb/c小鼠，雌性，由蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司提供，動物許可證號SCXK(蘇)2009-0001。I. 3儀器TP1020自動脫水機和RM2235型石蠟切片機均為德國LEICA公司產(chǎn)品；CS-VI型攤片烤片機湖北孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司；TiSSUe-TekTEL組織包埋中心，日本SAKURA公司產(chǎn)品；LEICADM1000光學(xué)顯微鏡，德國Leica公司產(chǎn)品；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海市躍進醫(yī)療器械一廠；微波爐，TCL有限公司；MiniSee圖像采集系統(tǒng)。2、實驗方法2. I各實驗組對放射致卵巢早衰小鼠的影響取Balb/c雌性小鼠60只，6-8周齡，適應(yīng)性飼養(yǎng)I周后，隨機分為5組，即正常對照組、模型組、戊酸雌二醇組(O. 015mg/kg)、二至丸組(7. 8g/kg)和本發(fā)明實施例I制備得到的組合物(5.9g/kg)。除正常對照組外，其余各組小鼠均采用6tlCo Y射線照射造模，照射總量為O. 5Gy，總劑量為O. 5Gy，照射率60cGy/min，照射野20cmX 20cm，距離80cm，照射后在無特殊致病原(SPF)級條件下飼養(yǎng)。照射后第二天，各組小鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物，每日I次，共28日。正常對照組和模型組給予等體積蒸餾水(10ml/kg)。末次給藥后lh，各組小鼠眼眶后靜脈叢取血，離心，取血清測雌二醇水平。同時取部分卵巢固定，常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，制片，染色，封片，在光學(xué)顯微鏡下閱片，計數(shù)卵巢中各種卵泡和黃體的數(shù)量；部分卵巢固定用于免疫組織化學(xué)檢測卵巢PI3K表達。2. 2血清E2水平測定血清E2水平測定采用ELISA法，測定方法嚴格按照試劑盒說明書。2. 3卵巢PI3K和akt表達檢測采用免疫組化方法測定模型小鼠卵巢PI3K和akt表達。小鼠取血后處死，取 出卵巢，盡量分離脂肪組織，用中性福爾馬林固定24h后，逐級酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，常規(guī)切片4μπι，45τ水浴中撈片，80°C烤箱烤片，40min。采用快速免疫組化方法檢測小鼠卵巢PI3K表達。石蠟切片脫蠟水化，微波中檔抗原修復(fù)10分鐘。自然冷卻，用PBS液(O. 01mol/LPH7. 4)沖洗3次X2min。正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加抗體，37°C孵育I小時。PBS沖洗，2分鐘X 3次。滴加即用型快速免疫組化MaxVisionTM 二抗，37°C或室溫孵育10至15分鐘。PBS沖洗，2分鐘X 3次。滴加新鮮配制的顯色劑(DAB)3至5分鐘，顯微鏡下觀察。自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗返藍。梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。免疫組化標(biāo)記結(jié)果各種蛋白陽性細胞以胞漿胞膜呈棕黃色為主，陰性不著色。2. 4統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果采用又±S表示，樣本統(tǒng)計分析采用獨立樣本t檢驗。3、實驗結(jié)果3. I本發(fā)明提供的組合物對放射致卵巢早衰小鼠一般情況的影響所有采用照射造模后動物均精神萎靡、活動明顯減少，脫毛，體重下降約2. (Γ4. Og，但各組小鼠均無死亡，灌胃本發(fā)明實施例I組合物I周后上述癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，體重逐漸增加，恢復(fù)正常生長狀態(tài)。3. 2本發(fā)明提供的組合物和其它各實驗組對放射致卵巢早衰小鼠卵巢組織病理的影響，具體實驗如表I所示表I中藥組合物對放射致卵巢早衰小鼠卵巢組織病理的影響(文士S, n=10)
,—卵泡總數(shù)發(fā)育中卵泡成熟卵泡黃體數(shù)
組別劑量(g/kg)
_(個) 數(shù)(個) 數(shù)(個) (個)
.丨 K 常對照組一25.6 士 4.6 15.2 士4.91.8士0.51.5 士 0.7
模型組一19.5士7 86.4±1.9##0.6 士 0.2#0.4士 0.2#
戊酸雌二醇組 0.015*10-324.4±3.812.8±3.3*1.8±0.4*1.1 士 0.5*
7.822.5士4.910.1+4. Γ'1.1±0.2'0.9士0.2a'
實施例 I 組合物組 5.923.8士6.213.1±2.ΓΑ1.7士0.3*Α1.1±0.4*A
與正常對照組相比，#P〈0. 05，##P〈0. 01 ;與模型組相比，*P<0. 05，；與二至丸組比較ΔΡ<0. 05。由表I的實驗結(jié)果表明，模型組小鼠發(fā)育中卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)和黃體數(shù)與正常組相比明顯下降有統(tǒng)計學(xué)差異(Ρ〈0. 01);各給藥組小鼠發(fā)育中卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)和黃體數(shù)與模型組比較顯著升高(ρ〈0. 05 ；Ρ<0. 01)。且實驗結(jié)果表明本發(fā)明實施例I提供的組合物組與二至丸組比較具有更好的促進卵巢卵泡發(fā)育成熟的作用，表現(xiàn)顯著增加小鼠發(fā)育中卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)和黃體數(shù)(Ρ〈0. 05)，表明女貞子、墨旱蓮和雞腰子配伍后具有很好的協(xié)同增效的功效。3. 3各組對放射致卵巢早衰小鼠血清Ε2水平的影響，具體實驗結(jié)果如表2所示表2中藥組合物對放射致卵巢早衰小鼠血清Ε2水平的影響(文土S，η=10) _MM_劑量 Cg/kg)_E2 (pg/ml)
正常對照組一112.2±10.6
廠^模型組一78.9±6.3她
戊酸雌二醇組0.015x10-3107.3±13.5*
二至丸組7.890.5±8.5*
實施例I組合物組__104.6±9.Q**A與正常對照組相比，##，P〈0. 01 ;與模型組相比，*P〈0. 05,**P<0. 01 ;與二至丸組比較ΔΡ<0. 05。由表2的實驗結(jié)果表明，與正常對照組相比，模型組小鼠血清Ε2水平顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)差異(ρ〈0. 01)。戊酸雌二醇組、二至丸組和本發(fā)明實施例I提供的組合物組小鼠血清Ε2水平增高，和模型組相比，有統(tǒng)計學(xué)差異(Ρ〈0. 05 ;Ρ〈0.01)。且實驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的實施例I組合物組小鼠血清Ε2水平顯著高于二至丸組(Ρ〈0. 05)，顯示出更強的提高放射致卵巢早衰小鼠血清Ε2水平的作用，進一步顯示出了很好的協(xié)同增效的作用。3. 4各組對放射致卵巢早衰小鼠卵巢ΡΙ3Κ和akt表達的影響，具體實驗結(jié)果如表3所示表3中藥組合物對放射致卵巢早衰小鼠卵巢PI3K和akt表達的影響(又士S n=10) _MM_(g/kg)_PI3K (%)_akt (%)
Iii 常對照組一2.2±1.51.9±0.8
「 模型組一11.9±4.3Μ17.3士7.9##
戊酸雌二醇組0.015x10-37.3 士 3.5*9.1 士2.9*
二至丸組 7.8 8.5±3.0* 10.7±3.8* 實施例 I 組合物組_Χ9_4.6士2.1**Α_6.0±2.7**A與正常對照組相比，##，Ρ〈0. 01 ;與模型組相比，*P〈0. 05,**P<0. 01 ;與二至丸組比較ΔΡ<0. 05。PI3K/akt信號通路在早期卵泡發(fā)育中起重要作用。表3結(jié)果表明，正常對照組小鼠卵巢PI3K和akt表達均較低，約為2%左右，6tlCo照射后小鼠卵巢PI3K和akt表達顯著增高，分別達到11. 9%和17. 3%。二至丸及實施例I組合物組給藥后均顯著降低模型小鼠卵巢高表達的PI3K和akt，和模型組相比，有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0. 05，P〈0. 01),且實驗結(jié)果表明本發(fā)明實施例I提供的組合物組與二至丸組比較具有較強的抑制6tlCo照射引起的小鼠卵巢PI3K/akt信號通路的激活，從而抑制卵泡的大量活化。由上述實驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，能明顯提高卵巢功能早衰小鼠的發(fā)育中卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)及黃體數(shù)，提高血清E2水平，并且能抑制卵巢功能早衰小鼠的卵巢PI3K和akt的表達，顯示出了比二至丸(女貞子和墨旱蓮)更好的抗卵巢功能早衰的功效，具有更好的臨床療效，且用藥安全。以上實施方式只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人了解本發(fā)明內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍，凡根據(jù)本發(fā)明精神實 質(zhì)所做的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，其特征在于，它是由以下重量份數(shù)的原料制成 女貞子2(Γ50份、墨旱蓮3(Γ50份、雞腰子1(Γ60份。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的具有防治卵巢功能早衰作用的組合物，其特征在于，它是由以下重量份數(shù)的原料制成 女貞子3(Γ40份、墨旱蓮3(Γ40份、雞腰子2(Γ40份。
3.一種具有防治卵巢功能早衰作用制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)取權(quán)利要求I或2所述重量份數(shù)的墨旱蓮，加6至12倍重量的水，煎煮I至3次，每次I至2小時，合并煎液，過濾，濃縮，濃縮液中加乙醇使乙醇的濃度達60%飛5%，靜置24小時，過濾，取上清液，減壓濃縮至稠膏，真空干燥，得墨旱蓮提取物； (2)取步驟(I)制備得到的墨旱蓮提取物與權(quán)利要求I或2所述重量份數(shù)的女貞子、雞腰子混合均勻，粉碎成細粉； (3)取步驟(2)制備得到的細粉與藥學(xué)上可接受的載體制備成丸劑、顆粒劑、膠囊劑或片劑劑型的藥物。
4.權(quán)利要求I或2所述的具有防治卵巢功能早衰作用的組合物在制備防治卵巢功能早衰藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有防治卵巢功能早衰作用的組合物及其制備方法，它是由以下重量份數(shù)的原料制成女貞子20~50份、墨旱蓮30~50份、雞腰子10~60份。本發(fā)明根據(jù)卵巢功能早衰的發(fā)病機制，在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，辨證論治通過大量實驗篩選中藥組方，實驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的組合物，可以明顯提高卵巢功能早衰小鼠的發(fā)育中卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)及黃體數(shù)，提高血清E2水平，并且能抑制卵巢功能早衰小鼠的卵巢PI3K和akt的表達，顯示出了比二至丸更好的抗卵巢功能早衰的功效，并且實驗過程中未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用安全。
文檔編號A61K36/638GK102961448SQ20121055145
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者劉志輝, 王瓊, 李爽, 袁雪晶, 李俊生, 范玲, 馬興苗 申請人:江蘇省中醫(yī)院