專利名稱：防治肝病的鯊魚肝多肽結(jié)構(gòu)及純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種源于鯊魚肝臟的防治肝病的多肽結(jié)構(gòu)及其純化方法，具體的講，其涉及一種從幼齡鯊魚的新鮮肝臟中提取的純肝細胞再生刺激因子結(jié)構(gòu)特征及其純化方法，可用于治療乙型肝炎、遷慢性肝炎、肝硬化、免疫性肝炎等肝臟疾病。
肝病是威脅人類生命和健康的主要疾病之一。國內(nèi)外學者一般利用陸地生長的動物肝臟研究和開發(fā)治療肝病的藥物。自Lebrecque首先從斷乳大鼠的肝臟發(fā)現(xiàn)肝細胞再生刺激因子(Hepatic Stimulator Substance，簡稱HSS)，并經(jīng)臨床證實治療各類肝病有較好療效以來，國內(nèi)外有關(guān)HSS的基礎(chǔ)和臨床工作已開展許多，關(guān)于HSS的純化、理化性質(zhì)、氨基酸組成、作用機理均有相應(yīng)報道，但不同研究者純化的HSS性質(zhì)有所差異，這可能是由于HSS來源不同，提取方法各異及樣品不純等原因所致。如美國Lebrecque等，從斷乳大鼠的肝臟中提取的HSS，因為提取過程中采用了乙醇沉淀方法，使得HSS活性降低，且工藝煩瑣、收率低，不宜批量生產(chǎn)，所以至今仍停留在實驗室研究階段(DOUGLA R．LABRECQUE etc，Purification and Physical-Chemical Characterization of HepaticStimulator Substance．Hepatology，Vo1．7，No1，pp．100～106，1987)。
國內(nèi)已在臨床上廣泛應(yīng)用的肝細胞活性物質(zhì)均是從陸地生長的胎、幼動物肝臟中提取的混合物，成份不明確。如鼠、豬、牛、狗等動物的胎、幼肝分離提取的肝細胞活性物質(zhì)，純度都較低，雖然在體內(nèi)外有專一地刺激肝細胞生長的能力，但實驗表明，當劑量加大到一定程度后，其抗肝細胞損傷和促進肝細胞生長的作用反而下降(黃才國、彭敏、魏善健等，人肝細胞生長刺激因子的部分純化及活性測定，第二軍醫(yī)大學學報1996，4月；17(2)184～186)。粗制品中難免含有一些雜質(zhì)，其抑制肝細胞生長。CN1096053A公開的“低分子量肝細胞生長素的制備方法”，它采用乳豬肝臟為原料，經(jīng)勻漿、加熱、離心沉淀、降解、純化、凍干等步驟制備，其特征在于用胰蛋白酶降解，用超濾進行純化，這種方法雖能得到分子量小于1萬的活性多肽，但用超濾仍很難準確控制分子量，而且純度較低，仍然是混合物。我們在中國專利申請CN1250780A中公開了可防治肝病的鯊魚肝刺激物質(zhì)及其提取、純化方法，其除去了抑制肝細胞生長的雜質(zhì)，純度較高，活性也較高。但該鯊魚肝刺激物質(zhì)的純度仍不足以確定其精確分子量及其氨基酸組成和N-端氨基酸序列。
本發(fā)明的目的是提供治療乙型肝炎、遷慢性肝炎、免疫性肝損傷等肝病的純的鯊魚肝多肽，確定其準確的物理化學性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征。
本發(fā)明的目的還在于提供純化鯊肝刺激物質(zhì)的方法，尤其是柱層析的條件。
為解決上述任務(wù)，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種防治肝病的多肽，其分子量為16950Da，等電點為5．60，紫外特征吸收峰為276nm。
用液相色譜法測氨基酸組成為(pmol／μg)114．39Glu，82．86Ala，101．43Asp，78．25Gly，38．21Val，34．1Ser，28．99Cys-Cys，13．21Phe，11．29His，11．13Arg，6．89Thr，5．92Lys，2．75Tyr，32．41Leu，23．75Ilu，14．58Trp。
用PE-ABD491A蛋白質(zhì)N-端測序儀測其N-末端氨基酸殘基的排列順序為N-Met-Arg-Thr-Gln-Glu-His-Thr-Lys-Ser-Val。
該防治肝病的多肽的純化方法，包括取鯊魚肝臟，絞碎，離心，超濾，陰離子交換層析，F(xiàn)PLC Mono Q層析，其特征在于將鯊魚肝刺激物質(zhì)采用FPLCMono Q色譜進行純化，層析柱溫度25℃，流速2ml／min，流動相A0．01～0．03mol／L，pH8．0～8．6的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合的雜蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～10％)，5min，B(10％～30％)，20-25min，B(30％～100％)，10-15min。
該多肽的較好的純化方法，其特征在于將鯊魚肝刺激物質(zhì)采用FPLC Mono Q色譜進行純化，層析柱溫度25℃，流速2ml／min，流動相A0．01～0．02mol／L，pH8．1～8．4的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合的雜蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～7％)，5min，B(7％～25％)，21-23min，B(25％～100％)，11-14min。
該多肽的較好的純化方法還有，將鯊魚肝刺激物質(zhì)采用FPLC Mono Q色譜進行純化，層析柱溫度25℃，流速2ml／min，流動相A0．01～0．02mol／L，pH8．2～8．3的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合的雜蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～7％)，5min，B(7％～25％)，21-23min，B(25％～100％)，11-14min。
純鯊魚肝多肽的制備方法，實際上包括兩部分1、先采用CN1250780A中公開的提取純化方法，獲得較純的防治肝病的鯊魚肝刺激物質(zhì)；2、再用本發(fā)明提供的純化方法，得純的鯊魚肝多肽。
具體制備純鯊魚肝多肽的方法是首先，取經(jīng)檢疫的幼鯊肝臟，去除肝膜及血液，用蒸餾水洗滌，絞碎后，加入蒸餾水在高速搗碎機中制成勻漿。在90℃～100℃水浴中保持5～10分鐘，然后在8000rpm-1下離心20分鐘，取上清液，棄沉淀以去除雜蛋白。用截留分子量30KD的中空纖維素膜進行超濾，收集濾出液。然后用DEAE-Sephadex A25陰離子交換柱進行陰離子交換層析，用0．005～0．02mol／L pH6．8～7．5的PBS緩沖液洗滌未結(jié)合雜蛋白，用含0～0．3mol／LNaCl的PBS緩沖液洗脫鯊魚肝刺激物質(zhì)。
用上述CN1250780A專利方法制備的鯊魚肝刺激物質(zhì)，經(jīng)FPLC的Mono Q柱純化，流動相A0．01～0．03mol／L pH8．0～8．6的Tris-HCl緩沖液，B含1mol／LNaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～10％)5min，B(10％～30％)25min，B(30％～100％)15min，即可得到鯊魚肝的純多肽。
將鯊魚肝刺激物質(zhì)采用FPLC Mono Q色譜進行純化時，也可選擇層析柱溫度25℃，流速2ml／min，流動相A0．01～0．02mol／L，pH8．1～8．4或pH8．2～8．3的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合的雜蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～7％)，5min，B(7％～25％)，25min，B(25％～100％)，10min。
純化后的鯊魚肝多肽，用質(zhì)譜測其分子量為16950Da，等電點為5．60，紫外特征吸收峰為276nm。用液相色譜法測氨基酸組成為(pmol／μg)114．39Glu，82．86Ala，101．43Asp，78．25Gly，38．21Val，34．1Ser，28．99Cys-Cys，13．21Phe，11．29His，11．13Arg，6．89Thr，5．92Lys，2．75Tyr，32．41Leu，23．75Ilu，14．58Trp。
用PE-ABD491A蛋白質(zhì)N-端測序儀測其N-末端氨基酸殘基的排列順序為N-Met-Arg-Thr-Gln-Glu-His-Thr-Lys-Ser-Val。
體內(nèi)藥效學試驗證明純化后的鯊魚肝多肽在鴨乙型肝炎病毒感染鴨體內(nèi)進行的實驗治療中，能有效抑制鴨乙型肝炎病毒的復(fù)制。實驗采用一日齡北京鴨，靜脈注射鴨乙型肝炎病毒，七天后分組，每組5-6只，鯊魚肝多肽實驗用2．5、5．0和10mg／Kg，3個劑量組，腹腔注射1天2次，給藥10天(Bid×10)，并與阿昔洛韋(ACV)比較，100mg／Kg作陽性對照，同時設(shè)病毒對照組，以生理鹽水代替藥物。給藥前(T0)，給藥后第5天(T5)和10天(T10)及停藥后3天(P3)取血，分離血清，同時進行斑點雜交，測定鴨血清DHBV-DNA的OD值。計算血清DHBV-DNA抑制率，觀察藥效。(見表1，表2)結(jié)果表明純鯊魚肝多肽治療組能顯著降低鴨血清中DHBV-DNA水平。
在對四氯化碳所致大鼠慢性肝損傷的治療作用實驗中，用大鼠72只，除正常對照組外，其余大鼠每周sc25％CCl4花生油溶液2．0ml／kg，連續(xù)三個月。造型8周時，眼眶取血，分離血清，測定血清ALT、AST的含量，按血清ALT含量，將大鼠隨機分組(見表3)，按表中劑量給藥，每天一次。結(jié)果表明純鯊魚肝多肽用藥8周，對四氯化碳引起的肝損傷大鼠血清中AST活性的升高、羥脯氨酸含量的升高均有抑制作用，能增加白蛋白含量，降低球蛋白含量，使白／球比有一定的升高。說明鯊肝肽對肝細胞生成膠原纖維的變化有一定抑制，有減輕肝臟纖維化的作用，即對四氯化碳致大鼠慢性肝損傷有一定的治療作用。(見表3)(實驗方法參見《現(xiàn)代藥理實驗方法學》，張均田，北大協(xié)和聯(lián)合出版社，1998。)鯊魚肝多肽在小鼠免疫性肝損傷模型中對肝損傷具有改善作用的實驗。用健康小鼠隨機分組(具體見表4)(實驗方法參見《中藥新藥與臨床藥理》1999，9(1)30，清肝沖劑對免疫性肝炎模型小鼠的保護作用及免疫調(diào)節(jié)作用，林培英，張丹，肖柳英等)。除正常對照組外，其余各組小鼠均予以靜脈注射卡介苗1mg／只，次日起環(huán)磷酰胺組小鼠以30mg／kg劑量隔天腹腔注射給藥，其它給藥組于免疫第8天開始腹腔給藥，每天一次，連續(xù)三天，正常對照和模型對照給予相應(yīng)體積的生理鹽水。至免疫第10天，給藥1小時后，除正常對照組外，其余各組均靜脈注射內(nèi)毒素10g／只，攻擊后6小時，小鼠眼眶靜脈叢取血，分別測AST和ALT。結(jié)果表明鯊魚肝多肽能減輕免疫反應(yīng)介導的肝細胞損害。
本發(fā)明的多肽可以與藥物載體組合，或與有生理活性的其它藥物成份組合，制成治療乙型肝炎、遷慢性肝炎、免疫性肝損傷等肝病的藥物組合物。這種藥物組合物可以通過常用技術(shù)配制，載體的形式可以根據(jù)所選擇的施用途徑而變化，常用施用途徑有口服、靜脈注射、肌肉注射等。表1鯊魚肝多肽治療組與病毒感染前鴨血清DHBV-DNA OD值比較表表2鯊魚肝多肽治療組與病毒感染對照組鴨血清DHBV-DNA水平抑制率的比較表表3鯊魚肝多肽對四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的治療作用(X±S)表表4鯊魚肝多肽對小鼠免疫性肝損傷的保護作用(x±s)表實例一取經(jīng)檢疫的幼鯊肝臟，去除肝膜及血液，用蒸餾水洗滌，絞碎后，加入蒸餾水在高速搗碎機中制成勻漿。在90℃～100℃水浴中保持5～10分鐘，然后在8000rpm-1下離心20分鐘，取上清液，棄沉淀以去除雜蛋白。用截留分子量30KD的中空纖維素膜進行超濾，收集濾出液。然后用DEAE-Sephadex A25陰離子交換柱進行陰離子交換層析，用0．005～0．02mol／L pH6．8～7．5的PBS緩沖液洗滌未結(jié)合雜蛋白，用含0～0．3mol／L NaCl的PBS緩沖液洗脫鯊魚肝刺激物質(zhì)。
取5mg的鯊魚肝刺激物質(zhì)，溶于5ml的0．01mol／L pH8．0的Tris-HCl緩沖液中，經(jīng)FPLC的Mono Q 1ml柱，層柱溫度25℃，流速2ml／min，流動相A0．01mol／L pH8．0的Tris-HCl緩沖液，B含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～10％)5min，B(10％～30％)25min，B(30％～100％)15min，即可得到鯊肝純多肽0．5mg。
純化后的鯊魚肝多肽，用質(zhì)譜測其分子量為16950Da，等電點為5．60，紫外特征吸收峰為276nm。用液相色譜法測氨基酸組成為(pmol／μg)114．39Glu，82．86Ala，101．43Asp，78．25Gly，38．21Val，34．1Ser，28．99Cys-Cys，13．21Phe，11．29His，11．13Arg，6．89Thr，5．92Lys，2．75Tyr，32．41Leu，23．75Ilu，14．58Trp。
用PE-ABD491A蛋白質(zhì)N-端測序儀測其N-末端氨基酸殘基的排列順序為N-Met-Arg-Thr-Gln-Glu-His-Thr-Lys-Ser-Val。
藥效學見表1～表4。實例二取6mg的鯊魚肝刺激物質(zhì)(見專利CN1250780A)，溶于6ml的0．02mol／LpH8．6的Tris-HCl緩沖液中，經(jīng)FPLC的Mono Q 1ml，層柱溫度25℃，流速2ml／min，流動相A0．02mol／L pH8．6的Tris-HCl緩沖液，B含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～7％)5min，B(7％～25％)20min，B(25％～100％)10min，即可得到鯊魚肝的純多肽0．60mg。純化后的鯊魚肝多肽，用質(zhì)譜測其分子量為16950Da，等電點為5．60，紫外特征吸收峰為276nm。用液相色譜法測氨基酸組成為(pmol／μg)114．39Glu，82．86Ala，101．43Asp，78．25Gly，38．21Val，34．1Ser，28．99Cys-Cys，13．21Phe，11．29His，11．13Arg，6．89Thr，5．92Lys，2．75Tyr，32．41Leu，23．75Ilu，14．58Trp。
用PE-ABD491A蛋白質(zhì)N-端測序儀測其N-末端氨基酸殘基的排列順序為N-Met-Arg-Thr-Gln-Glu-His-Thr-Lys-Ser-Val。
藥效學見表1～表4。表1鯊魚肝多肽治療組與病毒感染對照組鴨血清DHBV-DNA OD值比較
*P＜0．05，**P＜0．01表2鯊魚肝多肽治療組與病毒感染對照組鴨血清DHBV-DNA水平抑制率的比較
*P＜0．05，**P＜0．01表3、鯊魚肝多肽對CCl4致大鼠慢性肝損傷的治療作用(±SD)
與模型對照相比，*p＞0.05，**p＜0.05表4 鯊魚肝多肽對小鼠免疫性肝損傷的保護作用( X±S)
與模型對照組相比，*P＜0．05，**P＜0．0權(quán)利要求
1．一種防治肝病的多肽，其特征在于其分子量為16950Da，等電點為5．60，紫外特征吸收峰為276nm。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治肝病的多肽，其特征在于氨基酸組成為(pmol／μg)114．39Glu，82．86Ala，101．43Asp，78．25Gly，38．21Val，34．1Ser，28．99Cys-Cys，13．21Phe，11．29His，11．13Arg，6．89Thr，5．92Lys，2．75Tyr，32．41Leu，23．75Ilu，14．58Trp。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治肝病的多肽，其特征在于N-末端氨基酸殘基的排列順序為N-Met-Arg-Thr-Gln-Glu-His-Thr-Lys-Ser-Val。
4．一種防治肝病的多肽的純化方法，包括取鯊魚肝臟，絞碎，離心，超濾，陰離子交換層析，F(xiàn)PLC Mono Q層析其特征在于將鯊魚肝刺激物質(zhì)采用FPLCMono Q色譜進行純化時，流動相A0．01～0．03mol／L，pH8．0～8．6的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合的雜蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～10％)，5min，B(10％～30％)，20-25min，B(30％～100％)，10-15min。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述防治肝病多肽的純化方法，其特征在于將鯊魚肝刺激物質(zhì)采用FPLC Mono Q色譜進行純化，流動相A0．01～0．02mol／L，pH8．1～8．4的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合的雜蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～7％)，5min，B(7％～25％)，21-23min，B(25％～100％)，11-14min。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述防治肝病多肽的純化方法，其特征在于將鯊魚肝刺激物質(zhì)采用FPLC Mono Q色譜進行純化，流動相A0．01～0．02mol／L，pH8．2～8．3的Tris-HCl緩沖液，B為含1mol／L NaCl的A液，用A液洗滌未結(jié)合的雜蛋白，多肽的洗脫梯度為B(0～7％)，5min，B(7％～25％)，21-23min，B(25％～100％)，11-14min。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述防治肝病的多肽，其特征在于可治療乙型肝炎、遷慢性肝炎、肝硬化、免疫性肝炎。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述防治肝病的多肽，其特征在于可與藥物載體組合制成藥物組合物。
9．根據(jù)權(quán)利要求1所述防治肝病的多肽，其特征在于可與其它藥物活性成份組合制成藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種源于鯊魚肝臟的刺激肝細胞再生的純的多肽的氨基酸組成和N－端氨基酸序列及其純化方法,其精確分子量為16950Da,等電點為5.60,紫外特征吸收峰為276nm,該多肽能治療鴨乙型肝炎病毒感染、減輕四氯化碳所致大鼠慢性肝損傷、緩解纖維化、保護小鼠免疫性損傷肝臟,其藥物組合物可作為治療乙型肝炎、遷慢性肝炎、肝硬化等嚴重肝病的有效藥物。
文檔編號A61K38/10GK1294134SQ0011906
公開日2001年5月9日 申請日期2000年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月24日
發(fā)明者吳梧桐, 郭昱, 吳文俊 申請人:中國藥科大學