專利名稱：一種蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥制造領(lǐng)域，具體涉及一種蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊制備方法及其用于鎮(zhèn)痛藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
疼痛是機(jī)體受到傷害性刺激后的一種保護(hù)性反應(yīng)，也是許多疾病常見的癥狀之一。疼痛不僅使患者感到痛苦.還可能引起生理功能紊亂，劇烈的疼痛甚至可導(dǎo)致休克，故須合理使用藥物緩解疼痛，防止可能產(chǎn)生的生理功能紊亂。目前臨床上所用的鎮(zhèn)痛藥主要有阿片類鎮(zhèn)痛藥和非阿片類鎮(zhèn)痛藥，前者雖然具有較好的鎮(zhèn)痛效果，但長期使用后容易產(chǎn)生依賴性，故在臨床應(yīng)用上受到嚴(yán)格的限制；后者主要是阿司匹林等解熱鎮(zhèn)痛藥，僅限于輕度疼痛的治療。蛇毒是所發(fā)現(xiàn)的非成癮性鎮(zhèn)痛藥，由于蛇毒中含有多種生物活性蛋白，且蛇毒種類眾多，是天然蛋白的貯藏庫，為鎮(zhèn)痛多肽的篩選提供了較大的可能。眼鏡蛇神經(jīng)毒素是最早發(fā)現(xiàn)的眼鏡蛇毒中鎮(zhèn)痛多肽。王曉輝等報道自尖吻蝮蛇毒中分離出鎮(zhèn)痛組分(王曉輝， 王化麗，李旭.尖吻蝮蛇蛇毒中鎮(zhèn)痛成分的研究.中國生化藥物雜志，2001,22 ) :198 199)，葉勇等報道了從江浙蝮蛇毒中分離出一種堿性多肽，發(fā)現(xiàn)其毒性低，無耐受和依賴性，并有中樞鎮(zhèn)痛作用(葉勇，姚廣濤，王澤時.江浙蝮蛇毒鎮(zhèn)痛組分的分離純化和理化性質(zhì).中國藥理與毒理學(xué)雜志，2004，18 (6) =453-459) 申請?zhí)?011100656 . 1公開了一種眼鏡蛇毒直接加熱制成鎮(zhèn)痛藥物的方法，但蛇毒未經(jīng)純化，鎮(zhèn)痛多肽含量低。由于蛇毒多肽在體內(nèi)易于降解，加上分子量較大，難以透膜吸收，因此其生物利用率不高，鎮(zhèn)痛效果欠佳。目前尚無將蛇毒多肽分離純化，制成納米囊的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊及其制備方法和應(yīng)用。該方法是針對蛇毒鎮(zhèn)痛多肽，利用高分子囊材的自組裝作用，制備蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊，提高了蛇毒多肽的穩(wěn)定性，并易被細(xì)胞直接吸收，發(fā)揮更好的鎮(zhèn)痛效果。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—種蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊的制備方法，包括如下步驟(1)將囊材用溶劑制成2 10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的囊材溶液，加入0. 5 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳化劑制成混合液，所述乳化劑為非離子表面活性劑；(2)將蛇毒鎮(zhèn)痛多肽用pH4. 5 7. 5的磷酸緩沖液溶解，配制成5 20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液，與囊材混合液按體積比1 3 10混合，攪拌乳化0.5 2小時，形成初乳，再與含0.1 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的另一囊材的水溶液按體積比1 1 10混合，攪拌乳化0.5 2小時，形成復(fù)乳；(3)調(diào)節(jié)復(fù)乳PH為2 6，過微孔濾膜，加入復(fù)乳體積5 20倍的水，靜置分離， 沉淀部分冷凍干燥，即制得蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊。
優(yōu)選地，步驟(1)、(2)所述囊材選自聚乳酸、聚羥基乙酸、多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、聚酸酐、聚乙二醇、聚己內(nèi)酯、殼聚糖和海藻酸鹽中的一種或幾種。優(yōu)選地，步驟(1)所述溶劑為丙酮、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯和二氯甲烷中的一種或幾種。優(yōu)選地，步驟(1)所述乳化劑為單甘酯、吐溫20、吐溫80、司盤60、蔗糖脂肪酸酯和泊洛沙姆中的一種或幾種。優(yōu)選地，步驟⑴所述的蛇毒多肽為眼鏡蛇或蝮蛇中分離的鎮(zhèn)痛多肽。優(yōu)選地，所述蛇毒鎮(zhèn)痛多肽的制備方法為將眼鏡蛇毒或蝮蛇毒用10倍重量、 PH4. 5 7. 5的磷酸緩沖液溶解后，過陽離子交換樹脂柱CM-S印hadexC-25，用含Imol氯化鈉的pH4. 5 7. 5的磷酸緩沖液洗脫，收集洗脫液，將其冷凍濃縮后過凝膠層析柱kphadex G-50，用0. Imol氯化鈉的pH4. 5 7. 5的磷酸緩沖液洗脫，收集色譜峰，脫鹽后冷凍干燥， 得蛇毒鎮(zhèn)痛多肽。所述的蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊可制成鎮(zhèn)痛藥品，可制成外用、口服或注射用藥劑型的任何一種。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果(1)本發(fā)明將蛇毒鎮(zhèn)痛多肽分離純化并制成鎮(zhèn)痛藥物，增強(qiáng)了藥物的鎮(zhèn)痛效果，并避免了其它成分引起的毒副作用。(2)本發(fā)明的蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊制劑，組織相容性好，易被組織細(xì)胞吸收，并提高了蛇毒鎮(zhèn)痛多肽的穩(wěn)定性。(3)本發(fā)明的蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊制備方法簡單易行，可以快速、批量生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1(1)蛇毒鎮(zhèn)痛多肽的制備方法眼鏡蛇毒10g，用IOOg pH4. 5的磷酸緩沖液溶解后，過陽離子交換樹脂柱CM-kphadex C_25，用含IM氯化鈉的pH4. 5的磷酸緩沖液洗脫。 收集洗脫液冷凍濃縮后過凝膠層析柱kphadex G-50，用0. IM氯化鈉的pH4. 5的磷酸緩沖液洗脫，收集色譜峰，脫鹽后冷凍干燥，得蛇毒鎮(zhèn)痛多肽2. 3g。(2)將聚乳酸用乙醇制成2%囊材溶液，加入0. 5%單甘酯制成囊材混合液；蛇毒鎮(zhèn)痛多肽用PH4. 5的磷酸緩沖液溶解，配制成5%溶液，與囊材混合液按體積比1 3混合， 攪拌乳化0.5小時，形成初乳。再與含聚羥基乙酸的水溶液按體積比1 1混合，攪拌乳化2小時，形成復(fù)乳。(3)調(diào)節(jié)pH為2，過微孔濾膜，加入復(fù)乳體積5倍量的水，靜置分離，沉淀部分冷凍干燥，即制得蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊。實(shí)施例2(1)蛇毒鎮(zhèn)痛多肽的制備方法蝮蛇毒10g，用IOOg pH4. 5的磷酸緩沖液溶解后， 過陽離子交換樹脂柱CM-kphadex C_25，用含IM氯化鈉的pH4. 5的磷酸緩沖液洗脫。收集洗脫液冷凍濃縮后過凝膠層析柱kphadex G-50，用0. IM氯化鈉的pH4. 5的磷酸緩沖液洗脫，收集色譜峰，脫鹽后冷凍干燥，得蛇毒鎮(zhèn)痛多肽2. 3g。
(2)將多聚賴氨酸用二氯甲烷制成10%囊材溶液，加入5%吐溫20制成混合液； 蛇毒鎮(zhèn)痛多肽用PH5. 5的磷酸緩沖液溶解，配制成10%溶液，與囊材混合液按體積比1 5 混合，攪拌乳化1小時，形成初乳。再與含0.5%殼聚糖的水溶液按體積比1 5混合，攪拌乳化1小時，形成復(fù)乳。(3)調(diào)節(jié)pH為3，過微孔濾膜，加入復(fù)乳體積10倍量的水，靜置分離，沉淀部分冷凍干燥，即制得蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊。實(shí)施例3(1)蛇毒鎮(zhèn)痛多肽的制備方法同實(shí)施例1。(2)將聚酸酐用丙酮制成5%囊材溶液，加入吐溫80制成混合液；蛇毒鎮(zhèn)痛多肽用PH6.0的磷酸緩沖液溶解，配制成8%溶液，與囊材混合液按體積比1 10混合，攪拌乳化2小時，形成初乳。再與含0.3%聚乙二醇的水溶液按體積比1 10混合，攪拌乳化1 小時，形成復(fù)乳。(3)調(diào)節(jié)pH為6，過微孔濾膜，加入復(fù)乳體積20倍量的水，靜置分離，沉淀部分冷凍干燥，即制得蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊。實(shí)施例4(1)蛇毒鎮(zhèn)痛多肽的制備方法同實(shí)施例2。(2)將聚己內(nèi)酯用乙酸乙酯制成3%囊材溶液，加入2%司盤60制成混合液；蛇毒鎮(zhèn)痛多肽用PH7. 5的磷酸緩沖液溶解，配制成6%溶液，與囊材混合液按體積比1 6混合， 攪拌乳化1小時，形成初乳。再與含0.8%多聚谷氨酸的水溶液按體積比1 8混合，攪拌乳化0.5小時，形成復(fù)乳。(3)調(diào)節(jié)pH為5，過微孔濾膜，加入復(fù)乳體積12倍量的水，靜置分離，沉淀部分冷凍干燥，即制得蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊。實(shí)施例5(1)蛇毒鎮(zhèn)痛多肽的制備方法同實(shí)施例2。(2)將海藻酸鈉用異丙醇制成7%囊材溶液，加入蔗糖脂肪酸酯制成混合液； 蛇毒鎮(zhèn)痛多肽用PH5.0的磷酸緩沖液溶解，配制成15%溶液，與囊材混合液按體積比1 8 混合，攪拌乳化1.5小時，形成初乳。再與含殼聚糖的水溶液按體積比1 3混合，攪拌乳化1.5小時，形成復(fù)乳。(3)調(diào)節(jié)pH為2. 5，過微孔濾膜，加入復(fù)乳體積8倍量的水，靜置分離，沉淀部分冷凍干燥，即制得蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊。實(shí)施例6(1)蛇毒鎮(zhèn)痛多肽的制備方法同實(shí)施例2。(2)將多聚賴氨酸用二氯甲烷制成6%囊材溶液，加入0. 5%泊洛沙姆制成混合液；蛇毒鎮(zhèn)痛多肽用PH7. 0的磷酸緩沖液溶解，配制成8%溶液，與囊材混合液按體積比 1 8混合，攪拌乳化1小時，形成初乳。再與含0.1%聚乳酸的水溶液按體積比1 5混合，攪拌乳化0. 5小時，形成復(fù)乳。(3)調(diào)節(jié)pH為4，過微孔濾膜，加入復(fù)乳體積10倍量的水，靜置分離，沉淀部分冷凍干燥，即制得蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊。實(shí)施例7
稱取實(shí)施例1 6制得的蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊10g，加入500ml水分散，再加入IOg 卡波姆和0. 5g尼泊金，攪拌均勻，即得蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊凝膠劑。實(shí)施例8稱取實(shí)施例1 6制得的蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊10g，加入藥用微晶纖維素90g，混合均勻，濕法制粒，用水調(diào)節(jié)，制得顆粒松散過20目篩，晾干。干燥后填充膠囊。即得蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊的膠囊劑。實(shí)施例9稱取實(shí)施例1 6制得的蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊10g，加入20g甘露醇，用滅菌水溶解后，過0. 3 μ m微孔濾膜，罐裝入安培瓶中，-50°C冷凍干燥M小時，即得蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊的凍干粉針注射劑。實(shí)施例10實(shí)施例1-6制得的蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊的急性毒性實(shí)驗(yàn)方法小鼠ip(腹腔注射)不同劑量蛇毒鎮(zhèn)痛多肽原藥和蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊，觀察Mh內(nèi)小鼠死亡數(shù)，按Bliss法計算LD5Q。結(jié)果蛇毒鎮(zhèn)痛多肽原藥LD5tl為5. 2 10. 7mg/kg,而蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊的LD5tl 為15. 4 20. 6mg/kg，表明其毒性顯著降低。實(shí)施例11實(shí)施例1-6制得的蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊的粒徑和包封率實(shí)驗(yàn)方法采用2000年中國藥典第二部附錄IXE粒度和粒度分布測定方法第三法光散射法測定納米囊粒徑；采用丙酮溶解囊材，過濾，稱量揮發(fā)丙酮后的物質(zhì)重量，包封率= (納米囊重量-丙酮揮發(fā)后物質(zhì)重量)/納米囊重量。結(jié)果蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊粒徑范圍在200 IOOOnm之間，包封率在81 88%。 結(jié)果見表一。這表明該采用實(shí)施例1 6法制得的蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊粒徑較小，具有較高的包封率。表一葉下珠有效部位微囊粒徑分布和包封率
權(quán)利要求
1.一種蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將囊材用溶劑制成2 10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的囊材溶液，加入0.5 5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳化劑制成混合液，所述乳化劑為非離子表面活性劑；(2)將蛇毒鎮(zhèn)痛多肽用pH4.5 7. 5的磷酸緩沖液溶解，配制成5 20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液，與囊材混合液按體積比1 3 10混合，攪拌乳化0.5 2小時，形成初乳，再與含0.1 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的另一囊材的水溶液按體積比1 1 10混合，攪拌乳化0.5 2小時，形成復(fù)乳；(3)調(diào)節(jié)復(fù)乳pH為2 6，過微孔濾膜，加入復(fù)乳體積5 20倍的水，靜置分離，沉淀部分冷凍干燥，即制得蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)、(幻所述囊材選自聚乳酸、聚羥基乙酸、多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、聚酸酐、聚乙二醇、聚己內(nèi)酯、殼聚糖和海藻酸鹽中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述溶劑為丙酮、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯和二氯甲烷中的一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述乳化劑為單甘酯、吐溫20、吐溫80、司盤60、蔗糖脂肪酸酯和泊洛沙姆中的一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的蛇毒多肽為眼鏡蛇或蝮蛇中分離的鎮(zhèn)痛多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述蛇毒鎮(zhèn)痛多肽的制備方法為將眼鏡蛇毒或蝮蛇毒用10倍重量、pH4. 5 7. 5的磷酸緩沖液溶解后，過陽離子交換樹脂柱CM-Sephadex C-25，用含Imol氯化鈉的pH4. 5 7. 5的磷酸緩沖液洗脫，收集洗脫液，將其冷凍濃縮后過凝膠層析柱kphadex G-50，用0. Imol氯化鈉的pH4. 5 7. 5的磷酸緩沖液洗脫，收集色譜峰，脫鹽后冷凍干燥，得蛇毒鎮(zhèn)痛多肽。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述方法制備的蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊的應(yīng)用，其特征在于，將其制成鎮(zhèn)痛藥品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛇毒鎮(zhèn)痛多肽納米囊及其制備方法和應(yīng)用，制備步驟如下(1)將囊材用溶劑制成2～10％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的囊材溶液，加入0.5～5％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳化劑制成混合液；(2)將蛇毒鎮(zhèn)痛多肽用pH4.5～7.5的磷酸緩沖液溶解，配制成5～20％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液，與囊材混合液按體積比1∶3～10混合，攪拌乳化0.5～2小時，形成初乳，再與含0.1～1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的另一囊材的水溶液按體積比1∶1～10混合，攪拌乳化0.5～2小時，形成復(fù)乳；(3)調(diào)節(jié)復(fù)乳pH為2～6，過微孔濾膜，加入復(fù)乳體積5～20倍的水，靜置分離，沉淀部分冷凍干燥，即制得納米囊，其用于鎮(zhèn)痛藥品，提高了蛇毒鎮(zhèn)痛多肽的穩(wěn)定性和鎮(zhèn)痛效果。
文檔編號A61P29/00GK102552216SQ20121003288
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月14日
發(fā)明者葉勇, 郭亞 申請人:華南理工大學(xué)