專利名稱：：一種水紅花子提取物的用途及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥中間體水紅花子總黃酮提取物及其提取方法，特別是從水紅花子中提取的黃酮類化合物用于抗癌作用。
背景技術(shù)：
：水紅花子為寥科植物紅寥(Polygonumorien2taleL.)的干燥成熟果實(shí)，呈棕黑色扁圓形，有光澤，雙面微凹，中部略有縱向隆起.水紅花子歸肝、胃經(jīng)，具有散血消徽、消積止痛的功效，善消氣血水互結(jié)之癥瘕積聚。主要含有槲皮素、花旗松素及三羥基二氫黃酮等。黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，作為一種功能成分，其主要作用有抗腫瘤，延緩衰老，增強(qiáng)心血管功能，治療慢性前列腺炎，增強(qiáng)免疫力，調(diào)解內(nèi)分泌系統(tǒng)，護(hù)肝，抗炎，抗過敏，抑菌，抗病毒等.所以黃酮類化合物的研究日益引起了人們的重視。其中水紅花子中黃酮類成分槲皮素具有較強(qiáng)的抗癌活性，對(duì)惡性腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有良好的抑制作用，被認(rèn)為是已知最強(qiáng)的抗癌劑之一，特別是作為化學(xué)預(yù)防劑能全面地作用于癌發(fā)生的始發(fā)、促癌和演進(jìn)3個(gè)階段，兼有抗致癌、抗促癌和誘導(dǎo)分化的作用?；ㄆ焖伤鼐哂休^強(qiáng)的抗氧化，抗影射作用。具有再生，解毒和抗體逆流的作用。能抑制過酸氧化脂化合物及細(xì)胞膜的病變。阻滯自由基的破壞作用，阻礙細(xì)胞老化及各種疾病的發(fā)展過程。臨床上主要用于抗菌消炎、保護(hù)肝臟性能治療和預(yù)防心腦血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病糖尿病的預(yù)防和治療等。經(jīng)過我們檢索還得到以下的關(guān)于水紅花子的研究?jī)?nèi)容，例如謝周濤，何再安，樓一層，劉焱文在《中藥材》發(fā)表了"水紅花子黃酮類成分的HPLC指紋圖譜研究"的文章，該文章對(duì)不同產(chǎn)地水紅花子進(jìn)行HPLC指紋圖譜比較研究，可以對(duì)不同產(chǎn)地水紅花子藥材進(jìn)行鑒別，并可在一定程度上進(jìn)行質(zhì)量控制。葛斌，張振明，許愛霞，高湘，雷曉燕在《第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)》發(fā)表了"水紅花子醇提物抑制大鼠組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的體外作用研究"的文章，研究了水紅花子醇提物的抗氧化活性。方法用，OH生成系統(tǒng)Fe"+抗壞血酸誘導(dǎo)大鼠心、肝、腎組織勻漿脂質(zhì)過氧化，用TBA比色法測(cè)定MDA含量；用NBT還原法測(cè)酵母多糖A剌激大鼠中性白細(xì)胞產(chǎn)生的02—;用分光光度法測(cè)H202誘發(fā)的大鼠紅細(xì)胞溶血度。結(jié)果6.3、12.5、25、50、100、200iig/LEFPO能不同程度抑制Fe"+抗壞血酸誘導(dǎo)的大鼠心、肝、腎脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成，其抑制心、肝、腎MDA生成的IC5。分別為31.8、32.5、40.2yg/L，量效關(guān)系均呈負(fù)相關(guān)，r分別為-0.886、-0.874及-0.918(P<0.01);能不同程度抑制酵母多糖A剌激中性粒細(xì)胞生成02—，IC5。為31.9iig/L，量效關(guān)系呈負(fù)相關(guān)，r-O.873(P<0.01);能不同程度抑制H202誘發(fā)的紅細(xì)胞氧化溶血，IC5。為56.2iig/L，量效關(guān)系呈負(fù)相關(guān)，r為-0.888(P<0.01)。結(jié)論水紅花子醇提物通過清除0H、02—及H202發(fā)揮抗氧化活性。翟延君，張淑榮，郝寧，康廷國(guó)在《遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)》發(fā)表了"水紅花子研究概況"的文章，通過對(duì)水紅花子的研究綜述，為該藥的開發(fā)、臨床應(yīng)用及進(jìn)一步深入研究提供參考，經(jīng)查閱水紅花子近40年的有關(guān)文獻(xiàn)資料總結(jié)了水紅花子在本草考證、生藥鑒別、化學(xué)成分、藥理作用及現(xiàn)代臨床應(yīng)用的研究現(xiàn)狀。結(jié)論該藥的研究缺少質(zhì)量控制指標(biāo)，藥用機(jī)理、藥效學(xué)方面的研究還處于初步探索階段，現(xiàn)代科技手段的應(yīng)用則處于空白。對(duì)水紅花子還應(yīng)進(jìn)行深入研究。謝周濤，何再安，劉焱文在《時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥》發(fā)表了"紅寥的化學(xué)成分及藥理研究"的文章，紅寥性味涼辛有毒，具有祛風(fēng)除濕，清熱解毒，活血戧瘧之功效。主治風(fēng)濕痹痛，痢疾，腹瀉，吐瀉轉(zhuǎn)筋，水腫.腳氣，癰瘡疔癤，蛇蟲咬傷，小兒疳積疝氣，跌打損傷，瘧疾。有文獻(xiàn)報(bào)道分別從紅寥的葉、果實(shí)和全草中分離得到黃酮類化合物，其全草中還分離得到木脂素類和二苯乙烯類化合物。現(xiàn)代藥理研究表明該藥具有抗急性心肌缺血，擴(kuò)張血管，降血壓，抗菌和抗腫瘤等廣泛的藥理活性。翟延君，初正云，程嘉藝，康廷國(guó)在《中藥材》發(fā)表了"水紅花子消積止痛藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究"的文章，通過藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，比較水紅花子生品與制品的水提物與醇提物消積止痛作用藥效學(xué)差異。利用離體腸管法、小腸炭末推進(jìn)法、熱板法、醋酸扭體法結(jié)果表明水紅花子生品與制品的水溶性與醇溶性提取物的消積止痛作用藥效不同，制品水提物的消積止痛作用佳，與傳統(tǒng)中醫(yī)用藥理論一致。魏艷，陳曉青，馬志祥，蔣新宇在《中成藥》發(fā)表了"紅寥不同提取部位花旗松素和總黃酮含量的測(cè)定"的文章，該實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了紅寥生藥果實(shí)、莖、葉等部位中花旗松素和總黃酮的含量，為紅寥資源開發(fā)和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是從水紅花子中分離出有抗癌作用的有效物質(zhì)組分(水紅花子總黃酮)，為抗癌藥物的研發(fā)提供中間體，為更合理的開發(fā)和利用水紅花子奠定基礎(chǔ)，為更好的利用我國(guó)的中草藥資源豐富中草藥治療疾病的領(lǐng)域提供條件。本發(fā)明通過對(duì)水紅花子的乙醇提取液通過大孔吸附樹脂梯度洗脫的提取物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)具有抗癌作用的成分為黃酮類化合物。在體外的抗癌試驗(yàn)研究表明，其黃酮類化合物具有良好的抗癌效果。從水紅花子中提取的抗癌有效成分黃酮類化合物，其化學(xué)鑒別反應(yīng)和光譜特征如下(1)金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)①鹽酸-鎂粉反應(yīng)在水紅花子提取液中加入少量鎂粉，再加1-2滴濃鹽酸，在水浴中加熱3分鐘，溶液顏色變?yōu)榧t色；②A1C^顯色反應(yīng)將水紅花子提取液滴于濾紙上形成斑點(diǎn)，再往斑點(diǎn)上噴1%A1C13乙醇溶液，置紫外燈下檢示，斑點(diǎn)顯黃色；(2)堿性試劑顯色反應(yīng)常溫下往提取液中滴加NaOH水溶液，搖勻，溶液顏色變?yōu)槌燃t色；(3)紫外吸收光譜特征樣品液中用甲醇或乙醇溶解，在紫外段波長(zhǎng)測(cè)定吸收峰，結(jié)果表明，在290nm和371nm出現(xiàn)最大吸收峰。具體實(shí)施例—、水紅花子有效物質(zhì)組的提取提取前處理水紅花子藥材(以下簡(jiǎn)稱藥材)烘干、粉碎制成粗粉。提取方法藥材粗粉，加乙醇溶液加熱回流提取，合并醇提液，過濾，濃縮，濃縮液用大孔樹脂吸附，水洗柱后不同濃度的乙醇溶液依次洗脫，洗脫液回收溶劑，干燥，即得水紅花子總黃酮提取物。二、水紅花子有效物質(zhì)組的藥理研究本發(fā)明通過對(duì)水紅花子總黃酮的提取物藥理實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，水紅花子總黃酮提取物體外、體內(nèi)的抗癌作用試驗(yàn)中，具有良好的效果。1、實(shí)驗(yàn)材料1.1水紅花子總黃酮提取物自制，臨用前溶解后除菌過濾備用。1.2腫瘤細(xì)胞株肝癌細(xì)胞株H印G2、人宮頸癌細(xì)胞株Hela、人大腸腺癌細(xì)胞株SW-480均購(gòu)自于上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)。1.3實(shí)驗(yàn)試劑溴化四氮唑藍(lán)(MTT)，Sigma公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胰酶為美國(guó)GIBC0公司；匿S0為天津市博迪化工有限公司。1.4實(shí)驗(yàn)儀器C02培養(yǎng)箱，長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司；低溫冰箱.(-8(TC，InnovaU570)，武漢理想科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；低速離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；倒置顯微鏡，上海萬衡精密儀器有限公司；酶標(biāo)儀(Sunrise)，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。2、實(shí)驗(yàn)方法MTT法將細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后計(jì)數(shù)，制成6X104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，以100yL/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后，每孔加藥物溶液100iiL，每孔總液量為200yL，每個(gè)藥物濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照(DMEM培養(yǎng)液)。培養(yǎng)48h后，棄去原培養(yǎng)液，在96孔板中每孔加入100iiLDMEM培養(yǎng)液，再加入5mg/mL的MTT20yL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，每孔加入DMSO150iiL，振蕩5min后，在酶標(biāo)儀測(cè)0D490nm值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組0D值-試驗(yàn)組0D值)/對(duì)照組0DX100%。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果MTT法測(cè)定水紅花子總黃酮提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞H印Gy人宮頸癌細(xì)胞Hela、人大腸腺癌細(xì)胞SW-480生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果如下。表1以MTT法檢測(cè)水紅花子總黃酮提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞株IfepG2的生長(zhǎng)抑制作用(%)(n=5)提取物濃度(mg/ml)24h48h72h26].2769.7571.23141.3659.2763.190.526.7946.9157.190.2523.9535.2638.430.12511.5318.7918.83IC50(mg/ml)1.32880.63850.5242表2以MTT法檢測(cè)水紅花子總黃酮提取物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株Hela的生長(zhǎng)抑制率(%)(n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3以MTT法檢測(cè)水紅花子總黃酮提取物對(duì)人大腸腺癌細(xì)胞株SW-480的生長(zhǎng)抑制作用(%)(n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4、水紅花子總黃酮提取物對(duì)小鼠肝腫瘤H22的體內(nèi)抗癌活性研究。4.1H22腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代H22細(xì)胞接種前與DMEM+10X小牛血清培養(yǎng)液中37°C、5%C02傳代培養(yǎng)至狀態(tài)良好，制成2X107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于健康昆明種小鼠腹腔，腹水傳代。4.2建立H22肝癌小鼠實(shí)體瘤模型無菌條件下用注射器抽取接種7-9天的H22小鼠腹水，以滅菌生理鹽水稀釋調(diào)整細(xì)胞量為1X107個(gè)/ml，接種到30只小鼠腋下，每只0.2ml，觀察小鼠生長(zhǎng)情況，制作實(shí)體瘤模型。4.3動(dòng)物分組與給藥24h后隨機(jī)分成3組，每組10只①陰性對(duì)照組，每天上午生理鹽水0.2ml灌胃。②陽(yáng)性對(duì)照組，每天上午環(huán)磷酰胺(20mg/kg)灌胃O.2mL;③給藥組，依據(jù)人的給藥劑量折合每天上午水紅花子總黃酮提取物(4.5mg/kg)，各組連續(xù)灌胃10d，每天觀察實(shí)體瘤的生長(zhǎng)情況。4.4抑瘤率檢測(cè)小鼠經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理后，于第lld脫頸椎處死，鑷子鑷住小鼠右腋腫瘤生長(zhǎng)部位皮膚后，用手術(shù)剪子剪開皮膚，暴露腫瘤，手術(shù)剪鈍性剝離腫瘤，用天平稱瘤重，計(jì)算抑制率。以抑瘤率來判斷抑瘤作用。腫瘤抑制率(％)=平均實(shí)驗(yàn)組瘤重/平均對(duì)照組瘤重)]X100%4.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件中D皿ent單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理若P<0.01表明組間有顯著性差異，結(jié)果如下表。表1水紅花子總黃酮提取物對(duì)H22小鼠的瘤重的影響(X士s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>**P<0.01實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，水紅花子總黃酮提取物給藥組與H22陰性對(duì)照組瘤重差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，水紅花子總黃酮提取物給藥組對(duì)H22肝癌小鼠腫瘤抑制率高于30%(中藥的瘤重抑制率>30%，評(píng)定藥物具有抑瘤作用)，表明水紅花子總黃酮提取物對(duì)H22肝癌實(shí)體瘤具有明顯的抑制作用。3、結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，水紅花子總黃酮提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。水紅花子總黃酮提取物作為一種醫(yī)藥中間體在制備治療抗癌藥物應(yīng)用方面可以做成以下制劑或劑型口服給藥制劑口服液、片劑、膠囊、含片、丸劑；注射給藥制劑注射劑；噴霧給藥制劑等。權(quán)利要求一種水紅花子提取物的用途，其特征在于水紅花子提取物為水紅花子總黃酮，用于制備抗癌藥物；能制成以下劑型口服給藥制劑口服液、片劑、膠囊、含片、丸劑；注射給藥制劑注射劑；噴霧給藥制劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水紅花子提取物的用途，其特征在于所述的具有抗癌作用的水紅花子提取物的化學(xué)物質(zhì)組，其化學(xué)鑒別反應(yīng)和光譜學(xué)特征如下(1)金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)①鹽酸_鎂粉反應(yīng)在水紅花子提取液中加入少量鎂粉，再加1-2滴濃鹽酸，在水浴中加熱3分鐘，溶液顏色變?yōu)榧t色；②A1C13顯色反應(yīng)將水紅花子提取液滴于濾紙上形成斑點(diǎn)，再往斑點(diǎn)上噴1%A1C13乙醇溶液，置紫外燈下檢示，斑點(diǎn)顯黃色；(2)堿性試劑顯色反應(yīng)常溫下往提取液中滴加NaOH水溶液，搖勻，溶液顏色變?yōu)槌燃t色；(3)紫外吸收光譜特征樣品液中用甲醇或乙醇溶解，在紫外段波長(zhǎng)測(cè)定吸收峰，結(jié)果表明，在290nm和371nm出現(xiàn)最大吸收峰。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水紅花子提取物的制備方法，其特征在于所述的具有抗癌活性的水紅花子總黃酮提取工藝包含以下步驟水紅花子藥材的前處理；溶劑提取；樹脂吸附純化處理；濃縮、干燥藥液得到總黃酮固體產(chǎn)物。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種水紅花子提取物的制備方法，其特征在于所述的該工藝包含將藥材干燥，粉碎過程。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種水紅花子提取物的制備方法，其特征在于所述的該工藝包含將經(jīng)過前處理的藥材用溶劑加熱回流法提取。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種水紅花子提取物的制備方法，其特征在于該工藝加熱回流提取的溶劑為乙醇溶液。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種水紅花子提取物的制備方法，其特征在于該工藝純化處理為利用大孔吸附樹脂對(duì)提取液進(jìn)行吸附，再用水_乙醇溶液洗滌、解吸附，得到純化提取液；該工藝樹脂液洗滌、解吸附步驟所用溶液為水和乙醇溶液。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種水紅花子提取物的制備方法，其特征在于該工藝干燥步驟可用減壓干燥、冷凍干燥、噴霧干燥。全文摘要一種水紅花子提取物的用途及制備方法，本發(fā)明公開了一種從水紅花子中提取的具有抗癌作用的黃酮類化合物，其提取方法為醇提法，再用大孔樹脂層析分離，依次用水、不同濃度的乙醇溶液洗脫，通過大孔樹脂吸附技術(shù)富集其有效成分黃酮類化合物，得水紅花子總黃酮提取物。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)MTT法驗(yàn)證水紅花子總黃酮具有較好的抗肝癌、宮頸癌、腺癌的作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了水紅花子總黃酮提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。文檔編號(hào)A61P35/00GK101732419SQ20101001002公開日2010年6月16日申請(qǐng)日期2010年1月6日優(yōu)先權(quán)日2010年1月6日發(fā)明者丑靜,盧秉久,孟憲生,康廷國(guó),曹愛民,翟延君申請(qǐng)人:遼寧中醫(yī)藥大學(xué)