專利名稱：一種低劑量多價(jià)結(jié)合疫苗組合物及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于疫苗生產(chǎn)制備技術(shù)領(lǐng)域，提供一種低劑量多價(jià)結(jié)合疫苗組合物及用途。
背景技術(shù)：
流行性腦脊髓膜炎簡稱流腦，它是由流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌引起的急性呼吸道傳染病，傳染性強(qiáng)，可大規(guī)模流行，且病情進(jìn)展迅速，即使進(jìn)行了最理想的治療，也常導(dǎo)致在發(fā)病后一到幾天內(nèi)死亡，或引起嚴(yán)重的后遺癥。因此藥物治療對控制大多數(shù)地方性或流行性的流腦來說價(jià)值不大。全球每年流腦發(fā)病人數(shù)約為50萬，死亡5萬。地方性疾病主要發(fā)生在兒童和青少年，3-12月齡的嬰兒發(fā)病率最高，而在流腦流行時，大齡兒童和年輕成人發(fā)病率也會增高。由于5-15%的兒童和年輕成人鼻咽部都攜帶流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏 球菌，因此通過服藥消除鼻咽部攜帶菌來控制流腦幾乎是不可能的，而且由于抗生素的大量使用，目前已經(jīng)出現(xiàn)了耐抗生素的腦膜炎奈瑟菌，因此接種安全有效的疫苗是控制流腦的最有效地措施。目前已經(jīng)有包括A，C，W135，Y群的多價(jià)流腦莢膜多糖疫苗和多價(jià)結(jié)合疫苗。b型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae type b，Hib)是一種革蘭氏陰性短桿菌。人是Hib的唯一宿主，普遍附著在人的鼻、咽部，通常不會引起嚴(yán)重的疾病，但可引發(fā)小兒細(xì)菌性腦膜炎、肺炎、會厭炎、敗血癥、敗血癥關(guān)節(jié)炎等疾病。Hib最容易感染5歲以下的兒童，尤其是4到12月齡的兒童。到5歲時，大部分兒童已產(chǎn)生抗體以抵御疾病，因此，這種細(xì)菌在大年齡兒童和成人中很少引發(fā)嚴(yán)重的疾病。據(jù)國內(nèi)有關(guān)專家的研究，Hib不僅是我國小兒化膿性腦膜炎的首要原因，而且是小兒肺炎的主要病因。全世界每年有超過300萬的兒童感染發(fā)病，七十萬兒童死亡，其中近五萬兒童死于Hib腦膜炎，五十萬以上兒童死于Hib肺炎。在5歲以下兒童中，近1/3-1/2的細(xì)菌性腦膜炎、近1/4的幼兒肺炎都是由Hib感染引起。Hib腦膜炎即使得到適當(dāng)?shù)闹委?，仍會?-25%的患兒死亡，而幸存者中有30-50%會留下終生殘疾后遺癥，如耳聾、學(xué)習(xí)障礙和運(yùn)動障礙等。Hib病菌通過已感染兒童在咳嗽或打噴嚏時噴出的飛沫在兒童間傳播，還可以通過共用兒童放入過口中的玩具或其它物品而傳播。接種Hib疫苗是預(yù)防Hib感染的最有效手段。目前已經(jīng)有多種Hib疫苗，其中采用的載體有CRM197，白喉類毒素，破傷風(fēng)類毒素，b型流行性腦脊髓膜炎球菌外膜蛋白。結(jié)合疫苗有效成分為莢膜多糖與載體蛋白的偶聯(lián)結(jié)合物。莢膜多糖抗原引起的抗體可以與細(xì)菌的莢膜結(jié)合，配合補(bǔ)體來殺死入侵細(xì)菌。結(jié)合蛋白可以促進(jìn)抗體成熟使其親和力增加。同時可以誘導(dǎo)接種者針對莢膜多糖的免疫記憶，使得保護(hù)的有效時間大大延長。為了進(jìn)一步降低疫苗的接種次數(shù)，Hib和流腦的聯(lián)合疫苗正在被研制中。目前GSK的Hib和C，Y群流腦結(jié)合疫苗已經(jīng)上市。目前還有Hib和A，C群的結(jié)合疫苗正在臨床研究中。中國專利ZL 02159032. X公開了一種多糖-蛋白結(jié)合疫苗的制備方法，主要涉及A，C群流腦炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖與多種蛋白質(zhì)載體的偶聯(lián)與純化方法及疫苗的配置方法，該專利所描述的莢膜多糖-蛋白結(jié)合疫苗的價(jià)數(shù)為3種，不包括Y群和W135群流腦莢膜多糖-蛋白結(jié)合疫苗。中國專利CN 1709595B公開了一種多糖-蛋白結(jié)合疫苗制劑及其制備方法，包括了及A，C，Y和W135群流腦炎球菌莢膜多糖、b型嗜血流感桿菌莢膜多糖與多種蛋白質(zhì)載體的偶聯(lián)月純化方法及疫苗的配置方法，該專利所描述每種結(jié)合物的莢膜多糖量在5-25ug之間。該專利描述的多價(jià)結(jié)合疫苗中采取的蛋白載體為破傷風(fēng)類毒素(TT)，白喉類毒素(DT)，人血清免疫球蛋白，b型流行性腦脊髓膜炎球菌外膜蛋白。載體的免疫抑制是阻礙開發(fā)多價(jià)結(jié)合疫苗的技術(shù)困難。當(dāng)連接在單一的載體的上的多糖的數(shù)量和質(zhì)量增多的情況下，針對多糖的抗體反應(yīng)會消減。這種抑制作用不可能被簡單的預(yù)測，而是和疫苗中的載體蛋白的選擇，疫苗的多糖蛋白結(jié)合比，多糖的種類相關(guān)。
盡管在上述專利中，各種不同的載體蛋白被提及。目前用于Hib和流腦進(jìn)行聯(lián)合疫苗制備的載體蛋白均為破傷風(fēng)類毒素，這包括GSK的Hib和流腦C，Y的聯(lián)合疫苗，以及國內(nèi)羅益和綠竹公司正在臨床研究的Hib和流腦A，C的結(jié)合疫苗。由于結(jié)合工藝的限制目前A群流腦多糖，C群流腦多糖以及Hib多糖和TT載體進(jìn)行鏈接時，其多糖和蛋白的質(zhì)量比一般分布為O. 4-0. 5。為了達(dá)到有效的多糖劑量，其中包含的載體的蛋白的質(zhì)量一般是多糖質(zhì)量的2到2. 5倍。目前唯一公開的包括4價(jià)流腦結(jié)合疫苗和Hib結(jié)合疫苗的多糖劑量為5_25ug每個血清群或血清型，也就是多糖的總量為25ug-125ug，而相應(yīng)的載體蛋白至少為50ug-250ugoHib和流腦的結(jié)合疫苗在應(yīng)用于3-6月的嬰幼兒的免疫接種時，將可能和無細(xì)胞百日咳疫苗以及肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗共同接種。無細(xì)胞百白破疫苗已經(jīng)納入到計(jì)劃免疫，而其中含有約15ug的破傷風(fēng)類毒素將進(jìn)一步抑制對含高劑量破傷風(fēng)類毒素載體的結(jié)合疫苗的免疫應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種低劑量多價(jià)結(jié)合疫苗。一種低劑量多價(jià)結(jié)合疫苗組合物，包含A群流腦莢膜多糖為2. 0-4. 8 μ g的A群流腦莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物，C群流腦莢膜多糖為2. 0-4. 8 μ g的C群流腦莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物，Y群流腦莢膜多糖為2. 0-4. 8 μ g的Y群流腦莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物，W135群流腦莢膜多糖為2. 0-4. 8 μ g的W135群流腦莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物，和b型流感嗜血桿菌莢膜多糖為2. 0-4. 8 μ g的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物。所述載體蛋白為白喉CRM197蛋白或破傷風(fēng)類毒素。還包括佐劑氫氧化鋁或磷酸鋁，所述氫氧化鋁或磷酸鋁中的鋁含量為O. 1-1. Smg0一種低劑量多價(jià)結(jié)合疫苗組合物在配制預(yù)防A群、C群、Y群、W135群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌、b型流感嗜血桿菌引起的感染的疫苗制劑中的用途。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的低劑量的結(jié)合疫苗組合物在各成分采用2. 0-4. 8可以有效地預(yù)防A群、C群、Y群、W135群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌、b型流感嗜血桿菌引起的感染。該疫苗也適用于與無細(xì)胞百白破疫苗的共同接種。一般情況下，隨著抗原含量的降低，對于該抗原的免疫反應(yīng)將會減弱。但是，在本發(fā)明研究中發(fā)現(xiàn)，降低聯(lián)合疫苗中莢膜多糖的劑量至2. 0-4. Sug/劑，對各種莢膜多糖抗原的免疫反應(yīng)不弱于專利發(fā)明CN1709595B所描述的高劑量組(5-25ug/劑)。而且在和無細(xì)胞百白破疫苗同時注射實(shí)驗(yàn)動物是發(fā)現(xiàn)，低劑量聯(lián)合疫苗的免疫反應(yīng)強(qiáng)于高劑量組。除了上述優(yōu)點(diǎn)之外，該疫苗降低了生產(chǎn)成本，而且同時降低了產(chǎn)品中有毒副作用的雜質(zhì)含量(細(xì)菌 來源的雜質(zhì)蛋白，DNA，內(nèi)毒素等)，因此提高了疫苗的安全性。相對于單獨(dú)配制的4價(jià)流腦結(jié)合疫苗和單價(jià)的Hib結(jié)合疫苗，本發(fā)明的優(yōu)勢是明確的，即減少了幼兒的接種次數(shù)，降低漏接率。
具體實(shí)施例方式低劑量的結(jié)合疫苗組合物可以由分別發(fā)酵純化Hib，A, C，Y和W135群流腦莢膜多糖和載體蛋白，并用已知的化學(xué)偶聯(lián)方法將各種莢膜多糖和載體蛋白共價(jià)連接，然后按照發(fā)明公示的劑量進(jìn)行組合物的配置。具體例子見實(shí)施例1-4。用于本發(fā)明所描述疫苗的載體蛋白可以是破傷風(fēng)類毒素和白喉CRM197蛋白，優(yōu)選是CRM197蛋白或者是在同一疫苗中同時采用兩種載體蛋白來偶聯(lián)不同的莢膜多糖。將Hib多糖和載體蛋白TT或CRM197制備H1-TT及Hib_CRM197結(jié)合疫苗的方法已經(jīng)有報(bào)道。一般的科研人員參照技術(shù)文獻(xiàn)即可實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明中流腦莢膜多糖和CRM197的結(jié)合可以采用專利CN1889975A中描述的過程實(shí)現(xiàn)。上述的方法同樣可以用于流腦莢膜多糖和TT的結(jié)合。而且，流腦莢膜多糖和TT的結(jié)合還可以采用CN 1709595B所報(bào)道方法實(shí)現(xiàn)。這些方法所實(shí)現(xiàn)的結(jié)合產(chǎn)物均可以用于配制5價(jià)結(jié)合疫苗的聯(lián)合疫苗。流腦莢膜多糖或流腦多糖是流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖的簡稱。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明疫苗中與流腦莢膜多糖相鏈接的蛋白載體選自白喉?xiàng)U菌生產(chǎn)的白喉毒素?zé)o毒突變體CRM197或破傷風(fēng)類毒素TT。C群流腦莢膜多糖與載體CRM197的結(jié)合是利用高碘酸鈉將將莢膜多糖切斷成末端帶有醛基的寡糖；截取大小合適的片段；在適當(dāng)條件下與CRM197中的游離氨基發(fā)生成酰胺反應(yīng)；多余醛基用硼氫化鈉封閉；去除游離多糖和游離蛋白；最終得到結(jié)合產(chǎn)品。也可以利用專利CN1889975A描述的方法實(shí)現(xiàn)。Y，W135流腦莢膜多糖是利用高碘酸鈉在流腦莢膜多糖氧化得到醛基；在適當(dāng)條件下與CRM197中的游離氨基發(fā)生成酰胺反應(yīng)；多余醛基用硼氫化鈉封閉；去除游離流腦莢膜多糖和游離蛋白；最終得到結(jié)合產(chǎn)品。也可以利用專利CN1889975A描述的方法實(shí)現(xiàn)。A群流腦莢膜多糖通過水解得到寡糖后用己二酸二肼酰(ADH)進(jìn)行衍生，然后與CRM197進(jìn)行連接；去除游離流腦莢膜多糖和游離蛋白；最終得到結(jié)合產(chǎn)品。也可以利用專利CN1889975A描述的方法實(shí)現(xiàn)。流腦莢膜多糖和載體蛋白TT的結(jié)合可以參見已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)和專利(CN1709595B)，由一般的實(shí)驗(yàn)人員實(shí)現(xiàn)制備。
本發(fā)明疫苗中Hib莢膜多糖相鏈接的蛋白載體選自白喉?xiàng)U菌生產(chǎn)的白喉毒素?zé)o毒突變體CRM197或者TT。該疫苗可以參見已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)和專利，由一般的實(shí)驗(yàn)人員實(shí)現(xiàn)制備。本發(fā)明疫苗中開可以加入磷酸鋁或氫氧化鋁作為佐劑，單位鋁佐劑加入量為
O.Γ1. 8mg/ 劑。本發(fā)明疫苗可通過以下制備工藝制備(I)莢膜多糖選用A、C、Y、W135群腦膜炎球菌菌種、b型流感嗜血桿菌菌種經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)出A、C、Y、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖、b型流感嗜血桿菌莢膜多糖。(2)載體蛋白CRM197 :選用表達(dá)CRM197的白喉?xiàng)U菌(ATCC39255)，發(fā)酵并通過柱層析生產(chǎn)出白喉毒素?zé)o毒突變體CRM197。 (3)載體蛋白破傷風(fēng)類毒素選用破傷風(fēng)桿菌(中國醫(yī)學(xué)菌種保存中心)，發(fā)酵生產(chǎn)出破傷風(fēng)毒素，脫毒純化得到破傷風(fēng)類毒素。(4)結(jié)合疫苗制備方法Hib和C群流腦莢膜多糖與載體蛋白CRM197的結(jié)合是利用高碘酸鈉將流腦莢膜多糖切斷成末端帶有醛基的寡糖；截取大小合適的片段；在適當(dāng)條件下與CRM197中的游離氨基發(fā)生成酰胺反應(yīng)；多余醛基用硼氫化鈉封閉；去除游離流腦莢膜多糖和游離蛋白；最終得到結(jié)合產(chǎn)品。Y，W135流腦莢膜多糖是利用高碘酸鈉在流腦莢膜多糖氧化得到醛基；在適當(dāng)條件下與CRM197中的游離氨基發(fā)生成酰胺反應(yīng)；多余醛基用硼氫化鈉封閉；去除游離流腦莢膜多糖和游離蛋白；最終得到結(jié)合產(chǎn)品。A群流腦莢膜多糖通過水解得到寡糖后用己二酸二肼酰(ADH)進(jìn)行衍生，然后與CRM197進(jìn)行連接；去除游離流腦莢膜多糖和游離蛋白；最終得到結(jié)合產(chǎn)品。A，C，Y，W135群流腦莢膜多糖和Hib多糖也可以用蛋白載體TT進(jìn)行結(jié)合疫苗的制備。該疫苗可以參見已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)和專利，由一般的實(shí)驗(yàn)人員實(shí)現(xiàn)制備。此處不再描述。將制備的5中流腦莢膜多糖結(jié)合產(chǎn)品按本發(fā)明規(guī)定的比例混合，制備流腦莢膜多糖蛋白結(jié)合疫苗。根據(jù)需要，加入氫氧化鋁或磷酸鋁即成為含鋁佐劑的疫苗制劑。本發(fā)明疫苗可用于免疫3個月齡以上各年齡段的兒童，預(yù)防A群、C群、Y群、W135群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌、b型流感嗜血桿菌引起的感染性疾病。本發(fā)明既能增強(qiáng)多糖抗原的免疫原性，又能減少嬰幼兒接種疫苗的次數(shù)，減輕嬰幼兒的痛苦和家長的負(fù)擔(dān)，降低接種成本，提高免疫覆蓋率。本發(fā)明最大的特點(diǎn)為有效的低劑量的多價(jià)結(jié)合疫苗，疫苗組分含量減少，效價(jià)不變，既可以提供較強(qiáng)的免疫功能，又能夠減少嬰幼兒使用該疫苗時產(chǎn)生的不良反應(yīng)。在評價(jià)本發(fā)明所描述的多價(jià)結(jié)合疫苗中，該疫苗具有比高劑量疫苗更好或者不低于高劑量疫苗的免疫原性，證明了免疫抑制被消減。由于低劑量的疫苗有更好的效果，更小的毒副反應(yīng)并且顯著降低醫(yī)療成本，因此是更優(yōu)的疫苗組合。以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1A，C，Y，W_135群流腦莢膜多糖的制備用于生產(chǎn)A, C, Y, W-135群奈瑟氏腦膜炎球菌(Neisseria meningitides)莢膜多糖的菌種均來源于中國醫(yī)學(xué)菌種保藏管理中心(菌種號分別為CMCC (B) 29201，CMCC (B)29205，CMCC (B) 29028，CMCC (B) 29037)。在 50L 發(fā)酵罐中分別對 A，C，Y, W-135 群奈瑟氏腦膜炎球菌進(jìn)行分別發(fā)酵培養(yǎng)。將獲得的30L發(fā)酵液離心后取得上清并置于一不銹鋼罐中，使用IOOKD膜包超濾濃縮至3L，向濃縮液中加入300ml質(zhì)量濃度為10%的十六烷基三甲基溴化銨水溶液，攪拌均勻后于4°C靜止2小時。將靜止后的溶液離心以獲得沉淀，向沉淀中加無菌IM氯化鈉水溶液至1L，在40°C下實(shí)現(xiàn)沉淀的溶解。向溶解液中加入無水乙醇至最終體積濃度為25%，攪拌均勻后于_20°C靜止2小時后，離心獲得上清；向離心上清中補(bǔ)加無水乙醇至最終體積濃度為80%，攪拌均勻后于-20°C靜止2小時后，離心獲得沉淀。將沉淀復(fù)溶于2L純化水中，加入來源于林伯氏白色念球菌(Tritirachiumalbum limber)的蛋白酶K至反應(yīng)濃度為3U/ml，在37°C下反應(yīng)2小時后，使用100KD膜包超濾15倍體積后最終得到2L超濾液。將超濾液通過O. 22um過濾后進(jìn)行冰凍干燥處理以得到純化的流腦莢膜多糖粉末，將粉末保存于帶有干燥劑的器皿中。
A群流腦莢膜多糖由P元素來確定含量，C，Y，W-135群流腦莢膜多糖由唾液酸來確定含量。流腦莢膜多糖的分子大小的確定利用凝膠過濾層析柱及利用多角度激光光散射來進(jìn)行，利用葡聚糖分子大小標(biāo)準(zhǔn)來校準(zhǔn)。流腦莢膜多糖的結(jié)構(gòu)完整性由質(zhì)子IH和13C NMR確定。實(shí)施例2載體蛋白CRM197的制備生產(chǎn)菌種白喉?xiàng)U菌(Corynebacterium diphtheriae)由美國菌種保藏中心(ATCC)購買，菌種號為菌種編號為39255。將凍干的生產(chǎn)白喉CRM197蛋白的種子接種到含培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)16小時。取一份培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有生長培養(yǎng)基的O. 5升搖瓶中，并將培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)搖床上34. 5-36. 5°C孵育8小時，從培養(yǎng)瓶取一份培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有生長培養(yǎng)基的4升搖瓶中，并將培養(yǎng)瓶在旋轉(zhuǎn)搖床上34. 5-36. 5°C孵育18小時。用此4升搖瓶的培養(yǎng)物接種含有30L生長培養(yǎng)基的發(fā)酵罐。將發(fā)酵罐在30-36. 5°C，pH 7. 4下培養(yǎng)28小時。發(fā)酵罐內(nèi)容物通過離心和深層濾器過濾至收集器中。將獲得的30L發(fā)酵液用30KD膜包濃縮至2L，向濃縮液中加入500mM磷酸緩沖液(鈉鹽)至最終濃度為10mM。將DEAE層析柱使用IOmM磷酸緩沖液平衡后，將濃縮液上樣后，使用O.1N氯化鈉溶液洗脫得到目的蛋白。利用10，000NIWC0再生纖維素濾柱，將蛋白質(zhì)溶液濃縮至5克/升并用10倍體積5%蔗糖溶液超濾透析。濃縮的蛋白質(zhì)溶液通過O. 2微米濾膜過濾。在凍干機(jī)中凍干蛋白。蛋白質(zhì)濃度通過Lowry, O. H.等人(1951)生物化學(xué)雜志(Journal ofBiologicalChemistry) 193, 265-275頁的方法確定。蛋白質(zhì)純度通過測定無菌度、LAL (內(nèi)毒素)含量和電泳方法確定。實(shí)施例3A群流腦莢膜多糖粉末的解聚和衍化向反應(yīng)器中裝入2. 5g純化的A群流腦莢膜多糖粉末，加入無菌乙酸鈉緩沖液(50mM pH6. 0)至流腦莢膜多糖濃度為4g/L時在4°C的溫度下使流腦莢膜多糖的溶解。再將反應(yīng)罐加熱升溫，再補(bǔ)加一些乙酸鈉緩沖液(50mM pH6. 0)稀釋流腦莢膜多糖使其濃度至1.25g/L的用于后續(xù)的反應(yīng)濃度。將流腦莢膜多糖溶液加熱至55°C，加入30%過氧化氫至其反應(yīng)濃度為1% ;保持溫度讓反應(yīng)2小時后，關(guān)閉加熱器并通過冰水浴循環(huán)將流腦莢膜多糖溶液迅速冷卻至室溫。用HPSEC-MALLS (高壓分子篩一MALLS系統(tǒng))測定解聚的流腦莢膜多糖的分子量，然后將反應(yīng)罐中的反應(yīng)液用裝有10KDMWC0規(guī)格的濾膜的超濾系統(tǒng)用無菌生理鹽水(O. 85%氯化鈉)等體積10次換液并將解聚的流腦莢膜多糖濃度濃縮至15g/L，結(jié)束后將解聚的流腦莢膜多糖在I至5°C貯存直至下一工序。將不同批次的純化解聚的流腦莢膜多糖分別加入反應(yīng)三角瓶中，并用純化水將其稀釋到反應(yīng)所需要的濃度6g/L。加入己二酸二肼酰(ADH)使其濃度達(dá)到反應(yīng)所需的lg/L，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)使其濃度達(dá)到反應(yīng)所需的Ig/L，利用酸堿調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值至5. O,并將其控制此pH值，在室溫環(huán)境下反應(yīng)I小時，結(jié)束后加入氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)，使其最終濃度達(dá)到2g/L，再次調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值至5. 0±0. 5，在室溫環(huán)境中，在攪拌的條件下反應(yīng)48小時。反應(yīng)結(jié)束后,使用裝有10000MWC0規(guī)格的濾膜的超濾系統(tǒng)以純化水進(jìn)行等體積超濾，超濾20次使小分子物質(zhì)(未反應(yīng)的EDAC、ADH及中間體等)能夠充分的濾除。最終，將衍生的流腦莢膜多糖濃縮至約15g/L，4°C保存。實(shí)施例4制備A群流腦莢膜多糖與CRM197蛋白質(zhì)的單價(jià)結(jié)合物向三角瓶中裝入實(shí)施例3獲得的衍生的流腦莢膜多糖(反應(yīng)濃度為800ρπιΟ1/μ L活性酰肼)以及純化的CRM197蛋白質(zhì)(反應(yīng)濃度為3g/L蛋白質(zhì))。利用生理鹽水(O. 85%NaCl溶液)稀釋這些原料至目標(biāo)反應(yīng)濃度，并將PH調(diào)至6. O。向衍生的流腦莢膜多糖，蛋白質(zhì)混合物中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)并使其最終反應(yīng)濃度為
2.25g/L，調(diào)節(jié)pH至6. O并在室溫環(huán)境反應(yīng)，保持2個小時。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)物在4°C貯存過夜，然后再進(jìn)行純化。用硫酸銨進(jìn)行鹽析沉淀以純化衍生的A群流腦莢膜多糖與CRM197蛋白質(zhì)的單價(jià)結(jié)合物，向反應(yīng)混合物中加入硫酸銨晶體，使硫酸銨最終濃度達(dá)到300g/L，在過程中要多次少量的加入硫酸銨并同時用磁力攪拌器不停緩慢攪拌，待硫酸銨溶解充分，且反應(yīng)體系中蛋白沉淀均勻穩(wěn)定時，停止攪拌，用離心機(jī)以IlOOOg的速度將硫酸銨沉淀后的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離。移除上清收集沉淀，用對沉淀進(jìn)行復(fù)溶，待沉淀完全溶解后，用囊式濾器對結(jié)合原液開始過濾，過濾后連接好裝有50KDa濾膜的超濾系統(tǒng)用生理鹽水(O. 85%NaCl溶液)對結(jié)合原液進(jìn)行20次等體積超濾，濾除硫酸銨沉淀過程中殘留的硫酸銨等小分子，收集回流并用囊式濾器再一次過濾除菌，最終將過濾好的結(jié)合產(chǎn)物保存于4°C冰箱中。表I結(jié)合反應(yīng)的條件和產(chǎn)物中結(jié)合比及結(jié)合產(chǎn)物分子量
權(quán)利要求
1.一種低劑量多價(jià)結(jié)合疫苗組合物，其特征是包含A群流腦莢膜多糖為2. 0-4. g的A群流腦莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物，C群流腦莢膜多糖為2. 0-4. 8 ii g的C群流腦莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物，Y群流腦莢膜多糖為2. 0-4. 8 ii g的Y群流腦莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物，W135群流腦莢膜多糖為2. 0-4. 8 ii g的W135群流腦莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物，和b型流感嗜血桿菌莢膜多糖為2. 0-4. 8 ii g的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低劑量多價(jià)結(jié)合疫苗組合物，其特征是所述載體蛋白為白喉CRM197蛋白或破傷風(fēng)類毒素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低劑量多價(jià)結(jié)合疫苗組合物，其特征是還包括佐劑氫氧化鋁或磷酸鋁，所述氫氧化鋁或磷酸鋁中的鋁含量為0. 1-1. Smg0
4.權(quán)利要求1-3之一的一種低劑量多價(jià)結(jié)合疫苗組合物在配制預(yù)防A群、C群、Y群、W135群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌、b型流感嗜血桿菌引起的感染的疫苗制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種低劑量多價(jià)結(jié)合疫苗組合物及用途，低劑量多價(jià)結(jié)合疫苗組合物包含A群流腦莢膜多糖為2.0-4.8μg的A群流腦莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物，C群流腦莢膜多糖為2.0-4.8μg的C群流腦莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物，Y群流腦莢膜多糖為2.0-4.8μg的Y群流腦莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物，W135群流腦莢膜多糖為2.0-4.8μg的W135群流腦莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物，和b型流感嗜血桿菌莢膜多糖為2.0-4.8μg的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物。本發(fā)明降低了生產(chǎn)成本，同時降低了產(chǎn)品中有毒副作用的雜質(zhì)含量，因此提高了疫苗的安全性。減少了幼兒的接種次數(shù)，降低漏接率。
文檔編號A61K39/116GK103007268SQ201210576290
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者朱濤, 宇學(xué)鋒, 毛慧華, 邵忠琦, 司偉雪, 常云松 申請人:天津康希諾生物技術(shù)有限公司