專(zhuān)利名稱(chēng)：一種口服蛋白類(lèi)藥物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及口服蛋白類(lèi)藥物的制備方法，特別涉及改性殼聚糖作為藥物載體的口 服蛋白類(lèi)藥物制備方法。
背景技術(shù)：
隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展，很多蛋白質(zhì)、酶、多肽等生物活性分子成為商業(yè)藥品投 入臨床應(yīng)用。雖然口服是蛋白質(zhì)類(lèi)藥物最方便、最易被病人接受的給藥方式，但是由于蛋白 質(zhì)類(lèi)藥物在消化道中極易酸變性及酶降解，另外蛋白質(zhì)大分子藥物難以透過(guò)腸壁粘膜吸收 入血，所以目前蛋白質(zhì)及多肽藥物仍主要通過(guò)注射方式給藥，即使這種給藥方式給病人帶 來(lái)痛苦且容易導(dǎo)致感染。近年來(lái)口服蛋白質(zhì)類(lèi)藥物載體成為藥劑學(xué)的研究熱點(diǎn)，PH敏感的 天然高分子水凝膠材料受到了極大的關(guān)注。
殼聚糖是商業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)的一種天然多糖，由于其高度的生物相容性、無(wú)毒、可 生物降解、腸粘膜粘附性及打開(kāi)腸細(xì)胞緊密連接等性能，殼聚糖被廣泛用于制藥領(lǐng)域。殼聚 糖已被用來(lái)作為激素、蛋白質(zhì)、酶和基因的載體。由于其表觀(guān)PKa = 5. 6，殼聚糖僅溶于酸性 環(huán)境中，這限制了它作為蛋白質(zhì)類(lèi)藥物口服載體的應(yīng)用。
海藻酸鈉是海藻酸的一種可溶性鹽，可以在多價(jià)陽(yáng)離子如鈣離子存在或在較低的 酸性環(huán)境下形成凝膠。由于海藻酸鈉凝膠易于制備，加它的多孔性、生物相容性及粘膜粘附 性等內(nèi)在屬性，海藻酸鈉衍生物被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。各種海藻酸鈉，殼聚糖復(fù)合物也已 被用來(lái)作為藥物靶向輸送和控釋的載體。
目前，國(guó)內(nèi)外只要是把殼聚糖和海藻酸鈉用乳化交聯(lián)等方法直接制備水凝膠，這 種方法所制備的水凝膠在酸性環(huán)境下容易崩解。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種在胃液環(huán)境下不溶脹而在小腸環(huán)境溶脹 的藥物制備方法。
本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案為一種口服蛋白類(lèi)藥物的制備方法，包括(a) Ν-α-戊二酸殼聚糖的合成步驟、(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備步驟；
所述的(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備步驟為
將重量濃度為0. 5-3 %的N- α -戊二酸殼聚糖溶液，用0. 5_2Μ的氫氧化鈉溶液 調(diào)節(jié)Ν-α -戊二酸殼聚糖溶液的ρΗ至0. 5-6. 5，再加入重量濃度為0. 5_3%的海藻酸鈉溶 液混勻，加入口服蛋白類(lèi)藥物，滴入到重量濃度1.5-2%氯化鈣溶液中，滴加完畢后，攪拌 交聯(lián)0. 5-3h，過(guò)濾，洗滌，再浸入到重量濃度1. 5-2的％硫酸鈉溶液攪拌交聯(lián)0. 5-4h，過(guò) 濾、洗滌、室溫下干燥至恒重，海藻酸鈉、Ν-α-戊二酸殼聚糖、口服蛋白類(lèi)藥物的質(zhì)量比為 1 0. 3-0. 9 0. 5-1. 5。
所述的口服蛋白類(lèi)藥物為胰島素、牛血清蛋白。
所述的(a) N-α-戊二酸殼聚糖的合成步驟
將殼聚糖溶于的1-2% (ν/ν)乙酸溶液中，再加入α-酮戊二酸，用0.5-2Μ氫氧 化鈉溶液調(diào)節(jié)上述溶液的PH值為3. 5-5. 5，室溫反應(yīng)2-6小時(shí)，再加入硼氫化鈉，用0. I-IM 鹽酸溶液調(diào)節(jié)上述混合物的PH值為4. 5-7. 5，反應(yīng)不小于M小時(shí)，加入90-95% (ν/ν)乙 醇終止反應(yīng)，過(guò)濾，洗滌，干燥，即得到N- α -戊二酸殼聚糖，殼聚糖、α -酮戊二酸、硼氫化 鈉的質(zhì)量比為1 1.5-3.5 0.3-1.5。
如圖1所示用α-酮戊二酸修飾殼聚糖，可以改善其水溶性，而殼聚糖具有高度 的生物相容性、無(wú)毒、可生物降解、腸粘膜粘附著性及打開(kāi)腸細(xì)胞緊密連接等性能，海藻酸 鈉是海藻酸的一種可溶性鹽，可以在多價(jià)陽(yáng)離子如鈣離子存在或在較低的酸性環(huán)境下形成 凝膠。當(dāng)把兩者混勻之后，再雙重交聯(lián)可能夠得到酸性條件基本不溶脹，而在堿性條件下溶 脹性能。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，所制備的藥物載體，在酸性條件下不易崩解，并且藥物容 易被吸收。


圖1是N-α-戊二酸殼聚糖合成的化學(xué)原理圖。
圖2是海藻酸鈉/N- α -戊二酸殼聚糖凝膠珠、海藻酸鈉及Ν_ α -戊二酸殼聚糖的 紅外光譜。
圖3是模擬胃的ρΗ環(huán)境下凝膠珠(實(shí)施例1、2、3、4、5)的溶脹特性。
圖4是模擬小腸的ρΗ環(huán)境下凝膠珠(實(shí)施例1、2、3、4、5)的溶脹特性。
圖5是模擬結(jié)腸的ρΗ環(huán)境下凝膠珠(實(shí)施例1、2、3、4、5)的溶脹特性。
圖6是牛血清蛋白BSA的包載率。
圖7是凝膠珠中，BSA在模擬胃(pHl. 2)的緩沖液中累積釋放。
圖8是凝膠珠中，BSA在模擬小腸(pH6. 8)的緩沖液中累積釋放。
圖9是凝膠珠中，BSA在模擬結(jié)腸(pH7. 4)的緩沖液中累積釋放。
圖10是凝膠珠放入模擬胃(SGF)緩沖液中池，然后再放入模擬結(jié)腸(SCF)緩沖液 中4h，BSA累積釋放率。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1
(a) N-α-戊二酸殼聚糖的合成
N-α-戊二酸殼聚糖的合成步驟將4. 5克的殼聚糖溶于IOOml的1 % (ν/ν)乙酸 溶液中，再加入7. 2克的α -酮戊二酸，用IM氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的ρΗ值為5，室溫?cái)嚢?4小時(shí)，再加入2克硼氫化鈉，攪拌均勻后，用IM鹽酸溶液調(diào)節(jié)上述混合物的ρΗ值為6. 5， 攪拌反應(yīng)M小時(shí)，加入體積比為95 %乙醇終止反應(yīng)。過(guò)濾獲得N- α -戊二酸殼聚糖聚合 物，分別用乙醇和乙醚洗滌3至4次，于紅外線(xiàn)干燥器中干燥至恒重。
(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備
將重量濃度為2 %的N- α -戊二酸殼聚糖溶液30ml，用IM的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) N- α -戊二酸殼聚糖溶液的ρΗ至5. 0，再加入重量濃度為2 %的海藻酸鈉溶液70ml混勻，滴4入到過(guò)量的重量濃度2%氯化鈣溶液中，滴加完畢后，攪拌交聯(lián)0. 5小時(shí)，過(guò)濾，用蒸餾水沖 洗3至4次除去凝膠珠表面未反應(yīng)的氯化鈣，再浸入到過(guò)量的重量濃度2 %的硫酸鈉溶液攪 拌交聯(lián)lh，過(guò)濾，用蒸餾水反復(fù)沖洗3至4次，室溫下干燥至恒重。
海藻酸鈉/N-α -戊二酸殼聚糖凝膠珠、海藻酸鈉及N-α -戊二酸殼聚糖的紅外光 譜如圖2所示，比較三者的紅外光譜，實(shí)施例1所制的凝膠珠紅外光譜中波數(shù)1609cm—1處海 藻酸鈉羧基的不對(duì)稱(chēng)震動(dòng)吸收峰明顯減弱且向高波數(shù)移動(dòng)(藍(lán)移)，另外波數(shù)1568CHT1處 殼聚糖氨基的特征性剪切震動(dòng)吸收峰明顯減弱。
實(shí)施例2
除(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備中，
“將重量濃度為2%的N- α -戊二酸殼聚糖溶液10ml，用IM的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) N- α -戊二酸殼聚糖溶液的ρΗ至4. 5，再加入重量濃度為2%的海藻酸鈉溶液90ml混勻，，，
夕卜，其余與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例3
除(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備中，
“將重量濃度為2%的N- α -戊二酸殼聚糖溶液20ml，用IM的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) N- α -戊二酸殼聚糖溶液的ρΗ至4. 8，再加入重量濃度為2%的海藻酸鈉溶液80ml混勻，”
夕卜，其余與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例4
除(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備中，
“將重量濃度為2%的N- α -戊二酸殼聚糖溶液40ml，用IM的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) N-α -戊二酸殼聚糖溶液的ρΗ至4. 5，再加入重量濃度為2%的海藻酸鈉溶液60ml混勻，，，
夕卜，其余與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例5
除(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備中，
“將重量濃度為2%的N- α -戊二酸殼聚糖溶液50ml，用IM的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) N- α -戊二酸殼聚糖溶液的ρΗ至4. 5，再加入重量濃度為2%的海藻酸鈉溶液50ml混勻，，，
夕卜，其余與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例6
1.凝膠珠的溶脹測(cè)定
稱(chēng)取一定量(Wtl)的干凝膠珠分別置于37°C緩慢振搖的緩沖溶液中，緩沖溶液分別 模擬胃、小腸及結(jié)腸的PH環(huán)境。在特定的時(shí)間間隔取出凝膠珠，用紙吸去凝膠珠表面多余 的水，在電子天平稱(chēng)重(Wt)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。凝膠珠的溶脹率用以下的公式計(jì)算
S(t) = (Wt-W0) /W0
Wt與Wtl分別為是凝膠珠濕重和干重。
2.凝膠珠的溶脹特性
模擬胃、小腸及結(jié)腸的ρΗ環(huán)境下實(shí)施例1、2、3、4、5的溶脹特性如圖3、4、5所示，凝膠珠子的溶脹率隨著Ν-α -戊二酸殼聚糖在海藻酸鈉/Ν-α -戊二酸殼聚糖中的比例的 增加而增加，而實(shí)施例5所制的凝膠珠在45min后就崩解了，這種現(xiàn)象是因?yàn)镹- α -戊二酸 殼聚糖比海藻酸鈉有較多的負(fù)電荷，且殼聚糖側(cè)鏈基團(tuán)α-戊二酸減弱了聚合物之間的作用力。實(shí)施例5所制的凝膠珠的高溶脹率和崩解速度導(dǎo)致在胃腸道的上部的低pH環(huán)境下 很難保護(hù)藥物，包載的藥物在胃腸道的下部會(huì)快速釋放。
結(jié)果表明實(shí)施例1、2、3、4在ρΗ6· 8及7. 4時(shí)的溶脹率分別是pHl. 2時(shí)的6倍和11 倍。這是因?yàn)樵诤Ｔ逅徕c/Ν-α -戊二酸殼聚糖中，羧基是主要官能團(tuán)，在pHl. 2的時(shí)候處于 非離子狀態(tài)，靜電斥力較弱，因此膨脹比例較小。隨著PH值增加到6. 8和7. 4，高于其pKa =4. 75，羧基(-C00H)完全變成離子形式(_C00_)。在C00_之間有強(qiáng)大的靜電斥力導(dǎo)致高 吸水性和高溶脹率。
實(shí)施例7
包載牛血清蛋白的雙重交聯(lián)凝膠珠的制備
(a) N-α-戊二酸殼聚糖的合成
N-α-戊二酸殼聚糖的合成步驟將4. 5克的殼聚糖溶于IOOml的1 % (ν/ν)乙酸 溶液中，再加入7. 2克的α -酮戊二酸，用IM氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值為5，室溫?cái)嚢?4小時(shí)，再加入2克硼氫化鈉，攪拌均勻后，用IM鹽酸溶液調(diào)節(jié)上述混合物的pH值為6. 5， 攪拌反應(yīng)M小時(shí)，加入體積比為95 %乙醇終止反應(yīng)。過(guò)濾獲得N- α -戊二酸殼聚糖聚合 物，分別用乙醇和乙醚洗滌3至4次，于紅外線(xiàn)干燥器中干燥至恒重。
(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備
將重量濃度為2%的N-α -戊二酸殼聚糖溶液30ml，用IM的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) N- α -戊二酸殼聚糖溶液的pH至5. 0，再加入重量濃度為2 %的海藻酸鈉溶液70ml混勻，然 后將0. 4克的牛血清蛋白(BSA)添加到混合溶液中溶解，滴入到過(guò)量的重量濃度2%氯化鈣 溶液中，滴加完畢后，攪拌交聯(lián)0. 5小時(shí)，過(guò)濾，用蒸餾水沖洗3至4次除去凝膠珠表面未反 應(yīng)的氯化鈣，再浸入到過(guò)量的重量濃度2%的硫酸鈉溶液攪拌交聯(lián)lh，過(guò)濾，用蒸餾水反復(fù) 沖洗3至4次，室溫下干燥至恒重。
實(shí)施例8
除(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備中，
“將重量濃度為2%的N- α -戊二酸殼聚糖溶液10ml，用IM的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) N- α -戊二酸殼聚糖溶液的pH至4. 5，再加入重量濃度為2 %的海藻酸鈉溶液90ml混勻，然 后將0.4克的牛血清蛋白(BSA)添加到混合溶液中溶解，”
夕卜，其余與實(shí)施例7相同。
實(shí)施例9
除(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備中，
“將重量濃度為2%的N- α -戊二酸殼聚糖溶液20ml，用IM的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) N- α -戊二酸殼聚糖溶液的pH至4. 5，再加入重量濃度為2 %的海藻酸鈉溶液80ml混勻，然 后將0.4克的牛血清蛋白(BSA)添加到混合溶液中溶解，”
夕卜，其余與實(shí)施例7相同。
實(shí)施例10
除(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備中，
“將重量濃度為2%的N- α -戊二酸殼聚糖溶液40ml，用IM的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) N-α-戊二酸殼聚糖溶液的pH至4. 5，再加入重量濃度為2 %的海藻酸鈉溶液60ml混勻，然 后將0.4克的牛血清蛋白(BSA)添加到混合溶液中溶解，”
夕卜，其余與實(shí)施例7相同。
實(shí)施例11
BSA包載率(LE)的測(cè)定
將25mg實(shí)施例7、8、9、10所制的凝膠珠粉碎，倒入50ml、PH6. 8磷酸鹽緩沖溶液 中，室溫條件下攪拌Mh。將溶液離心后用紫外分光光度計(jì)在280nm處測(cè)定上清液中BSA 的釋放量，以實(shí)施例1所制的凝膠珠的上清液作對(duì)照。假設(shè)在24h的時(shí)間內(nèi)，珠子中包載的 BSA均已釋放。
包載率(LE)按下式計(jì)算
LE(% )=(珠子中包載的BSA的總量/實(shí)驗(yàn)中使用的BSA的總量)X 100%
BSA 的包載率(LE)
BSA的包載率如圖6所示。從圖中我們可以看到，當(dāng)BSA的重量占到凝膠珠質(zhì)量 的20%時(shí)，包載率可達(dá)到92%以上。同時(shí)，隨著N-α-戊二酸殼聚糖在凝膠珠總量中的增 加，BSA的包載率也會(huì)不斷上升，因?yàn)锽SA包載進(jìn)凝膠珠時(shí)的酸性條件(ρΗ5. 0)高于BSA的 等電點(diǎn)7)，卻低于殼聚糖鏈上氨基的pKa值(6.3)。在這種情況下，帶負(fù)電荷的BSA就 會(huì)和殼聚糖鏈上帶正電荷的氨基通過(guò)靜電吸引完成包
實(shí)施例12
BSA體外釋放率的測(cè)定
在體外用下面的方法測(cè)定BSA的釋放率將IOOmg實(shí)施例7、8、9、10所制的凝膠珠 分別加入20ml模擬胃(pHl.2)、模擬小腸(pH6.8)、模擬結(jié)腸(ρΗ7· 4)的緩沖液中，37°C條 件下持續(xù)緩慢振搖。每隔15分鐘，取5ml上清液(同時(shí)向溶液中補(bǔ)入相同體積的新鮮緩沖 液)用紫外分光光度計(jì)在^Onm處，測(cè)定其中所含的BSA的量。BSA的累積釋放量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
其結(jié)果如圖7、8、9所示，在pHl. 2緩沖液中，BSA的釋放率相對(duì)較低，75min內(nèi)只有 約14-18%的BSA從凝膠珠中釋放出來(lái)，隨后其累積釋放量達(dá)到平衡，這與凝膠珠在pHl. 2 的溶液中膨脹率較低有關(guān)，當(dāng)PH達(dá)到6. 8和7. 4時(shí)，隨著凝膠珠不斷膨脹，BSA的釋放率迅 速提高，三個(gè)小時(shí)內(nèi)達(dá)到約100%。
實(shí)施例13
把實(shí)施例7、8、9、10所制的凝膠珠放入模擬胃(SGF)緩沖液(pHl. 2)中池，然后再 放入模擬結(jié)腸(SCF)緩沖液pH7. 4中4h，測(cè)量BSA累積釋放率。BSA在SCF中的累積釋放 率高于在SGF中的，如圖10。這是因?yàn)锽SA釋放的與凝膠珠的溶脹有關(guān)，藥物是從溶脹的凝 膠珠的孔隙中擴(kuò)散出來(lái)的。
權(quán)利要求
1.一種口服蛋白類(lèi)藥物的制備方法，其特征在于包括(a)N-α-戊二酸殼聚糖的合成 步驟、(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備步驟；所述的(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備步驟為將重量濃度為0. 5-3 %的N- α -戊二酸殼聚糖溶液，用0. 5-2Μ的氫氧化鈉溶液調(diào) 節(jié)N- α -戊二酸殼聚糖溶液的ρΗ至0. 5-6. 5，再加入重量濃度為0. 5-3 %的海藻酸鈉溶 液混勻，加入口服蛋白類(lèi)藥物，滴入到重量濃度1.5-2%氯化鈣溶液中，滴加完畢后，攪拌 交聯(lián)0. 5-3h，過(guò)濾，洗滌，再浸入到重量濃度1. 5-2的％硫酸鈉溶液攪拌交聯(lián)0. 5-4h，過(guò) 濾、洗滌、室溫下干燥至恒重，海藻酸鈉、Ν-α-戊二酸殼聚糖、口服蛋白類(lèi)藥物的質(zhì)量比為 1 0. 3-0. 9 0. 5-1. 5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種口服蛋白類(lèi)藥物的制備方法，其特征在于所述的口服 蛋白類(lèi)藥物為胰島素、牛血清蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種口服蛋白類(lèi)藥物的制備方法，其特征在于所述的(a) N- α -戊二酸殼聚糖的合成步驟將殼聚糖溶于的1-2% (ν/ν)乙酸溶液中，再加入α-酮戊二酸，用0. 5-2Μ氫氧化鈉溶 液調(diào)節(jié)上述溶液的PH值為3. 5-5. 5，室溫反應(yīng)2-6小時(shí)，再加入硼氫化鈉，用0. I-IM鹽酸溶 液調(diào)節(jié)上述混合物的PH值為4. 5-7. 5，反應(yīng)不小于M小時(shí)，加入90-95% (ν/ν)乙醇終止 反應(yīng)，過(guò)濾，洗滌，干燥，即得到N- α -戊二酸殼聚糖，殼聚糖、α -酮戊二酸、硼氫化鈉的質(zhì) 量比為 1 1. 5-3. 5 0. 3-1. 5。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種口服蛋白類(lèi)藥物的制備方法，包括(a)N-α-戊二酸殼聚糖的合成步驟、(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備步驟；所述的(b)雙重交聯(lián)水凝膠的制備步驟為將N-α-戊二酸殼聚糖溶液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)N-α-戊二酸殼聚糖溶液的pH至0.5-6.5，再加入海藻酸鈉溶液混勻，加入口服蛋白類(lèi)藥物，滴入到氯化鈣溶液中，滴加完畢后，攪拌交聯(lián)0.5-3h，過(guò)濾，洗滌，再浸入到硫酸鈉溶液攪拌交聯(lián)0.5-4h，過(guò)濾、洗滌、室溫下干燥至恒重。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，所制備的藥物載體，在酸性條件下不易崩解，并且藥物容易被吸收。
文檔編號(hào)A61K47/36GK102028936SQ20101058800
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者何所懼, 張銀葉, 李程程, 龔仁敏 申請(qǐng)人:安徽師范大學(xué)