專利名稱：葉酸改性殼聚糖親核no供體及其合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域的藥物及其合成方法，具體是一種葉酸改 性殼聚糖親核NO供體及其合成方法。
技術(shù)背景一氧化氮NO是內(nèi)皮誘導松弛因子，在調(diào)節(jié)血管緊張度、血壓、平滑肌繁殖 和血小板聚集等方面有重要的作用。目前，NO在損傷部位處的控制釋放已經(jīng)被 確定是防止再狹窄的最有前途的一種途徑。有效治療心血管疾病患者的舉措是使 用抗凝血制劑和抗血小板制劑，這些制劑能夠防止更深入缺血事件的發(fā)生和減少 由血栓導致相關(guān)動脈疾病死亡的概率。含有親核一氧化氮供體[N(0)NO]—官能團 的化合物是近幾年發(fā)展起來的一種最重要的NO供體藥物，它既可在生理條件下 自發(fā)的釋放NO分子，經(jīng)02取代后又可在靶器官和靶細胞中被恃定酶脫離，具有 靶向性的功能，它還具有良好的可調(diào)控性，另外它可制備成各種形態(tài)，根據(jù)需要 應用于不同的醫(yī)學領(lǐng)域。雖然大量的體外試驗已經(jīng)證明了它可有效的預防成型術(shù) 后再狹窄，提高醫(yī)療裝置的抗血栓性能，減輕肺部高壓和血管痙攣然等用途，但 親核試劑(多胺)的細胞毒性和致癌性副產(chǎn)物亞硝胺的生成是限制其臨床應用的 主要難題。在最近的十年中，國外對基于含有[N(0) NO]—官能團的NO供體控釋材料進行 了大量的研究。最初的研究集中于將離子型的親核NO供體N0N0ate分散于各種 疏水性聚合物中，通過NO的釋放增強這些材料的血液相容性。但親水性的NO 供體會從聚合物中滲出，在血液中形成致癌性的N-亞硝胺物質(zhì)。將這類材料應 用于臨床，還必須考慮作為聚合物基體材料的生物相容性和生物可降解性、親核 試劑的細胞毒性和生物相容性。因此要選用無毒的有良好生物相容性的NO載體，其中的解決辦法之一就是采用對身體無害的具有仲胺基團的親核載體。葉酸(FA)是一種B族維生素，可特異性地與細胞表面的葉酸受體(FR)作用 形成復合物，通過受體介導內(nèi)吞被細胞吸收且順利到達細胞核。FR可被許多腫瘤細胞超量表達(如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、直腸癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、神經(jīng) 內(nèi)分泌癌和腦轉(zhuǎn)移癌等)，葉酸已被當作抗癌藥物的靶向分子而受到廣泛重視。殼聚糖是唯一天然存在且是陽離子的可生物降解的多糖，具有良好的生物相 容性和生物可降解性，有抗菌消炎、促進傷口愈合、抗酸抗?jié)兗爸苯右种颇[瘤 細胞的作用，與抗癌藥合用可增強抗癌效果。近年來殼聚糖作為一種新型藥用輔 料在緩釋給藥系統(tǒng)中得到了越來越廣泛的應用，且殼聚糖來源豐富，價格低廉。 另外，由于殼聚糖具有良好的生物相容性，生物可降解性，大分子正電性，無毒 性以及生物粘附性，使得殼聚糖可以作為理想的藥物輸送材料。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，Smith等人在美國專利中(USP6261594， Chitosan-based nitric oxide donor compositions ， 2001 ; USP6451337 ， Chitosan-based nitric oxide donor compositions, 2002)提出了將改性殼聚 糖作為親核NO載體，合成出系列殼聚糖-N0加成物。殼聚糖的具體的改性分為 兩類(l)親水基團改性N-羧丁基殼聚糖，N-羧乙基殼聚糖，N-羧甲基殼聚糖。 (2)疏水性基團改性N-丙基殼聚糖，N-羧乙基殼聚糖甲酯。其不足在于NO 的負載程度較低，原因有兩點(1) NO的釋放不具有針對性，使得NO的利用度 極地低。(2)這些殼聚糖改性產(chǎn)物同NO的反應后生成的親核NO供體的釋放量和 釋放半衰期較低。因此限制了其在醫(yī)學上的用途。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種葉酸改性殼聚糖親核NO 供體及其合成方法。本發(fā)明通過對殼聚糖進行羧基化改性，產(chǎn)生NH親核位點， 同NO反應后，得到一系列以殼聚糖葉酸改性產(chǎn)物為載體的含有[N(0)NO]—官能 團的新型的NO供體，解決了目前此類親核NO供體應用于臨床時存在的問題(利 用率較低)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明所涉及的葉酸改性殼聚糖親核NO供體，用殼聚糖作為基體材料，采 用羧化改性產(chǎn)生仲胺親核位點(NH基團)，與N0反應產(chǎn)生[N(0)N0]—官能團，親 核NO供體的結(jié)構(gòu)式如下CTNa+ CS-FA-NO其中N[N(0)N0]—基團為NH基團同NO反應形成。而NH基團來自于葉酸改性 的殼聚糖和葉酸分子本身；葉酸分子本身就具有NH集團，而且葉酸分子上的羧 基基團-C00H跟殼聚糖上的NH2基團發(fā)生羧基反應后就可以直接生成NH基團。本發(fā)明所涉及的葉酸改性殼聚糖親核NO供體合成方法，具體為對殼聚糖 上的NH2基團進行羧化改性，使其產(chǎn)生能夠與NO反應的親核NH基團。羧化改性 殼聚糖分子同N0氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進行反應，要求Na7NH=2/l， 壓力為5-10atm，室溫反應3-7天，產(chǎn)生[N(0)N0]—基團。將合成產(chǎn)物用甲醇乙醚 分別清洗多次，室溫真空干燥，儲存于-2(TC的干燥器內(nèi)。所述的對殼聚糖上的NH2基團進行羧化改性，是采用殼聚糖上的NH2基團同 葉酸上的羧基基團發(fā)生羧基化反應，生成酰胺鍵，從而產(chǎn)生了NH基團。具體為稱取殼聚糖(分子量40-188萬)樣品，加醋酸攪拌至溶解完全，將溶液pH 值調(diào)到4.7，用一次性針頭式過濾器將溶液過濾后加入圓底燒瓶中。稱取葉酸溶 于二甲亞砜(DMS0)中，用磁力攪拌至完全溶解后，向葉酸液液中加入二環(huán)己基 碳二亞胺(EDC)，混合至溶解。將加有EDC的葉酸溶液加入上述殼聚糖溶液中， 于37。C下水浴攪拌反應7天。調(diào)節(jié)pH值到9.0使反應終止，將反應產(chǎn)物用pH 值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)透析3天，然后用超純水透析4天，除去未 反應完全的反應物。將透析產(chǎn)物于冷凍干燥機中凍干，產(chǎn)物于干燥器內(nèi)保存。本發(fā)明NO供體生成反應式如下<formula>formula see original document page 7</formula>本發(fā)明得到的葉酸改性殼聚糖親核NO供體為黃色細粉末，儲存于-2(TC的干 燥器內(nèi)。在室溫下能夠穩(wěn)定存在，在酸性或中性水溶液中能夠自發(fā)分解釋放出 NO和葉酸改性殼聚糖分子。本發(fā)明制備的葉酸改性殼聚糖親核NO供體，具有穩(wěn)定的化學性質(zhì)和較長的 釋放半衰期，可廣泛的應用于治療心血管系統(tǒng)疾病，肺部高壓，促進傷口愈合， 有效的預防成型術(shù)后再狹窄，提高醫(yī)療裝置的抗血栓性能。
具體實施方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下 進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限 于下述的實施例。實施例l:葉酸(FA)改性40萬分子量殼聚糖(CS) /N0的合成(摩爾比 FA/CS=2/1)準確稱取1. 61g的殼聚糖(分子量40萬)樣品，加100ml 1%醋酸攪拌至溶解完全，將溶液pH值調(diào)到4.7，用一次性針頭式過濾器將溶液過濾后加入圓底 燒瓶中。稱取2. 17g葉酸溶于30ml二甲亞砜中，用磁力攪拌至完全溶解后，向 葉酸溶液中加入二環(huán)己基碳二亞胺0.5g,混合至溶解。將加有二環(huán)己基碳二亞 胺的葉酸溶液加入上述殼聚糖溶液中，于37'C下水浴攪拌反應7天。調(diào)節(jié)pH 值到9. 0使反應終止，將反應產(chǎn)物用pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液透析3天， 然后用超純水透析4天，除去未反應完全的反應物。將透析產(chǎn)物于冷凍干燥機中 凍干，最后烘干得到淡黃色細粉末2. 04g，經(jīng)計算得接枝率為10%，產(chǎn)物于干燥 器內(nèi)保存。將上述反應產(chǎn)物2.04g (O.Olmol)加入到含有2. 15g (0. 02mol)甲醇鈉的 100ml無水甲醇溶液中，在高壓釜中與NO反應，維持壓力5atm，反應3天，反 應結(jié)束后分別用無水甲醇和乙醚洗滌，室溫真空干燥，得到黃色粉末約2. 12g。[N(0)NO]—官能團最直觀和有效地表征方法是在230-280處的紫外特征吸收， 合成產(chǎn)物CS-FA/N0中[N(0)N0]—官能團的特征吸收在262nm，測定了在磷酸鹽緩 沖液中其吸光率隨時間的變化，通過釋放曲線的函數(shù)擬合求出其半衰期是20h。實施例2:葉酸(FA)改性124萬分子量殼聚糖(CS) /N0的合成(摩爾比 FA/CS=1/1)準確稱取1. 61g的殼聚糖(分子量124萬)樣品，加100ml 1%醋酸攪拌至溶 解完全，將溶液pH值調(diào)到4.7，用一次性針頭式過濾器將溶液過濾后加入圓底 燒瓶中。稱取4.34g葉酸溶于30ml 二甲亞砜中，用磁力攪拌至完全溶解后，向 葉酸溶液中加入二環(huán)己基碳二亞胺0.5g，混合至溶解。將加有二環(huán)己基碳二亞 胺的葉酸溶液加入上述殼聚糖溶液中，于37t:下水浴攪拌反應7天。調(diào)節(jié)pH 值到9. 0使反應終止，將反應產(chǎn)物用pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液透析3天， 然后用超純水透析4天，除去未反應完全的反應物。將透析產(chǎn)物于冷凍干燥機中 凍干，最后烘干得到黃色細粉末2. 48g，算得接枝率為20%。產(chǎn)物于干燥器內(nèi)保 存。將上述反應產(chǎn)物2.48g (O.Olraol)加入到含有2. 15g (0. 02mol)甲醇鈉的 100ml無水甲醇溶液中，在高壓釜中與NO反應，維持壓力7atm，反應5天，反 應結(jié)束后分別用無水甲醇和乙醚洗滌，室溫真空干燥，得到黃褐色粉末約2. 60g。[N(0)N0]—官能團最直觀和有效地表征方法是在230-280處的紫外特征吸收，合成產(chǎn)物CS-FA/N0中[N(0)NO]—官能團的特征吸收在262nm，測定了在磷酸鹽緩 沖液中其吸光率隨時間的變化，通過釋放曲線的函數(shù)擬合求出其半衰期是28h。 實施例3:葉酸(FA)改性188萬分子量殼聚糖(CS) /N0的合成(摩爾比 FA/CS=l/2)準確稱取1. 61g的殼聚糖(分子量188萬)樣品，加100ml醋酸攪拌至溶解 完全，將溶液pH值調(diào)到4.7，用一次性針頭式過濾器將溶液過濾后加入圓底燒 瓶中。稱取8.68g葉酸溶于30ml二甲亞砜中，用磁力攪拌至完全溶解后，向葉 酸溶液中加入二環(huán)己基碳二亞胺0.5g，混合至溶解。將加有二環(huán)己基碳二亞胺 的葉酸溶液加入上述殼聚糖溶液中，于37r下水浴攪拌反應7天。調(diào)節(jié)pH值 到9.0使反應終止，將反應產(chǎn)物用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液透析3天，然 后用超純水透析4天，除去未反應完全的反應物。將透析產(chǎn)物于冷凍干燥機中凍 干，最后烘干得到淡黃色細粉末2. 94g，算得接枝率為31%。產(chǎn)物于干燥器內(nèi)保 存。將上述反應產(chǎn)物2.91g (O.Olmol)加入到含有2. 15g (0. 02mol)甲醇鈉的 100ml無水甲醇溶液中，在高壓釜中與NO反應，維持壓力10atm，反應7天，反 應結(jié)束后分別用無水甲醇和乙醚洗滌，室溫真空干燥，得到黃褐色粉末約3. 16g。[N(0)NO]—官能團最直觀和有效地表征方法是在230-280處的紫外特征吸收， 合成產(chǎn)物CS-FA/N0中[N(0)N0]—官能團的特征吸收在262mn，測定了在磷酸鹽緩 沖液中其吸光率隨時間的變化，通過釋放曲線的函數(shù)擬合求出其半衰期是35h。
權(quán)利要求
1、一種葉酸改性殼聚糖親核NO供體，其特征在于，分子結(jié)構(gòu)式如下其中N[N(O)NO]-基團為NH基團同NO反應形成，而NH基團來自于葉酸改性的殼聚糖和葉酸分子本身。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉酸改性殼聚糖親核N0供體，其特征是，所述親 核N0供體，是在酸性和中性水溶液中能夠自發(fā)的釋放NO分子，殼聚糖分子量大小決定了它們的最大負載量、釋放半衰期和釋放速率。
3、 一種如權(quán)利要求1所述的葉酸改性殼聚糖親核N0供體的制備方法，其特 征在于對殼聚糖上的NH2基團進行羧基化改性，使其產(chǎn)生能夠與NO反應的親 核NH基團，羧基化改性殼聚糖后引入的葉酸分子本身就具有NH基團，這兩種來 源的仲胺NH基團同N0氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進行反應，其中Na7NH=2 ， 產(chǎn)生[N (0) NO]—基團，得到含有[N (0) NO]-基團的親核NO供體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的羧基改性殼聚糖親核N0供體的制備方法，其特征 是，所述反應，其壓力為5-10atra。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的羧基改性殼聚糖親核NO供體的制備方法，其 特征是，所述反應，其溫度為室溫，時間為3-7天。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的羧基改性殼聚糖親核N0供體的制備方法，其特征 是，所述的對殼聚糖上的NH2基團進行羧化改性，是采用殼聚糖上的NH2基團同 葉酸上的羧基基團發(fā)生羧基化反應，生成酰胺鍵，從而產(chǎn)生了NH基團。
7、 根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的葉酸改性殼聚糖親核NO供體的制備方法，其 特征是，所述對殼聚糖上的NH2基團進行羧化改性后，其產(chǎn)物的分離提純采用磷 酸鹽緩沖溶液和超純水分別透析，除去未反應完全的反應物，將透析產(chǎn)物于冷 凍干燥機中凍干，最后烘干得到淡黃色細粉末。
8、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的葉酸改性殼聚糖親核N0供體的制備方法，其特征 是，所得到的NO供體為黃褐色細粉末，儲存于-2(TC的干燥器內(nèi)。
全文摘要
一種葉酸改性殼聚糖親核NO供體及其合成方法，屬于醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明對殼聚糖上的NH₂基團進行?；男?，使其產(chǎn)生能夠與NO反應的親核NH基團。葉酸改性殼聚糖分子上的仲胺NH基團同NO氣體分子在甲醇鈉的甲醇溶液中進行反應，產(chǎn)生[N(O)NO]^-基團，其中Na⁺/NH＝2，所得到的葉酸改性殼聚糖親核NO供體分子結(jié)構(gòu)式如上。本發(fā)明親核NO供體具有不同的NO釋放速率和較長的半衰期，可以解決NO釋放的非特意性靶向性的弱點，提高了NO的利用效率，同時能夠克服親核試劑(多胺)的細胞毒性和避免致癌性副產(chǎn)物亞硝胺的生成。
文檔編號A61K47/48GK101224305SQ20071017259
公開日2008年7月23日 申請日期2007年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者萬錒俊, 燕 孫, 張隱西, 李慧麗 申請人:上海交通大學