專利名稱：截短的人乳頭瘤病毒33型l1蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子病毒學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種截短的人乳頭瘤病毒33型Ll蛋白，其編碼序列和制備方法，以及包含其的病毒樣顆粒，所述蛋白和病毒樣顆粒可用于預(yù)防HPV(特別是HPV3;3)感染及由HPV(特別是HPV3;3)感染所導(dǎo)致的疾病例如宮頸癌等。本發(fā)明還涉及上述蛋白和病毒樣顆粒用于制備藥物組合物或疫苗的用途，所述藥物組合物或疫苗用于預(yù)防HPV(特別是HPV3;3)感染及由HPV(特別是HPV3;3)感染所導(dǎo)致的疾病例如宮頸癌等。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)屬于乳頭瘤病毒科 (Papillomaviridae)乳頭瘤病毒屬，為無包膜DNA病毒。該病毒基因組為雙鏈閉環(huán)DNA， 大小約為7. 2 81Λ，具有8個(gè)開放閱讀框。該病毒基因組按功能的不同可以分為三個(gè)區(qū)域①早期區(qū)(E)，約4. 51Λ，編碼E1、E2、E4 E7共6個(gè)與病毒復(fù)制，轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)化有關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白；②晚期區(qū)(L)，約2. 51Λ，編碼主要衣殼蛋白Ll和次要衣殼蛋白L2;③長(zhǎng)調(diào)控區(qū) (LCR)，位于L區(qū)末端與E區(qū)起始端之間，長(zhǎng)約800 900bp，不編碼任何蛋白，含DNA復(fù)制和表達(dá)調(diào)控元件。HPV病毒顆粒直徑為45 55nm，核衣殼呈20面體對(duì)稱，有72個(gè)殼微粒，由 Ll及L2組成。目前已知的HPV約有90多種亞型，在人群中主要引起皮膚，粘膜的疣狀病變。根據(jù)其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，HPV可分為3組@低或無致癌風(fēng)險(xiǎn)組，包括朋￥6、11、39、41、42、43 ； ②中度致癌風(fēng)險(xiǎn)組，包括HPV31、33、35、51、52 ；③高度致癌風(fēng)險(xiǎn)組，包括HPV16、18、58、45。HPV分子流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生的重要啟動(dòng)因子。在所有宮頸癌標(biāo)本中，HPV DNA檢出率高達(dá)80%以上。宮頸癌是一種常見的女性惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，是嚴(yán)重威脅女性健康的殺手。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年世界范圍內(nèi)約有490，000例的新發(fā)病例，約有 270，000 人死于該疾病(Boyle, P.，and J. Ferlay. Ann Oncol 2005,16 481-8)。在所有宮頸癌病例中，發(fā)生于發(fā)展中國(guó)家的占了約83%，在這些國(guó)家中，宮頸癌甚至能夠占到女性惡性腫瘤的15%。而在發(fā)達(dá)國(guó)家，這個(gè)數(shù)字僅占到1.5%。在撒哈拉以南地區(qū)，中南亞，拉丁美洲，東亞均為宮頸癌的高發(fā)區(qū)。我國(guó)也屬于宮頸癌高發(fā)區(qū)。在陜西略陽縣，已婚婦女中宮頸癌的發(fā)病率高達(dá)1(^6/100000。有關(guān)世界范圍內(nèi)宮頸癌標(biāo)本中HPV型別分布的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中最常見的 HPV 型別依次是 16、18、45、31、33、58、52、35、59、56、6、51、68、39、82、73、66 和 70(按照降序排列，Clifford GM, Smith JS, Plummer Μ, et al. Br J Cancer, 2003,88 (1) :63-73)。近期一項(xiàng)對(duì)中國(guó)婦女感染HPV型別的調(diào)查結(jié)果表明，在宮頸癌患者中HPV33的感染率為3. 6%， 在 HPV16(58.7% ),HPV18(11.0% ),HPV58(7. 2% )之后，位于第 4 位(Y P Bao, N Li, J S Smith and Y L Qiao. International Journal of STD&AIDS，2008，19 :106-111)。這說明 HPV33在世界范圍內(nèi)的婦女宮頸癌患者中的感染率較高，是普遍易感染的HPV型別之一。目前已上市的HPV疫苗為Merck的Gardas i 1 及GSK的Cervar ix ,上述兩種疫苗分別含有HPV6/11/16/18及HPV16/18 VLP，但均不包含在中國(guó)及亞洲婦女中普遍易感的HPV33型別VLP。因此，針對(duì)中國(guó)以及亞洲等發(fā)展中國(guó)家婦女安全有效的HPV疫苗，特別是針對(duì) HPV16,18及33等高危型別的疫苗，是有效預(yù)防宮頸癌，改善廣大婦女(特別是我國(guó)及亞洲婦女)健康狀況的有效途徑。HPV Ll蛋白為主要衣殼蛋白，分子量為55-60kDa，是HPV疫苗主要靶蛋白。在多種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的HPV Ll蛋白無需L2蛋白輔助即可形成在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與天然病毒顆粒相似的病毒樣顆粒(Virus-Like Particle，VLP)。該病毒樣顆粒為二十面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，由 72個(gè)Ll蛋白的五聚體組成。其保留了病毒顆粒的天然表位，具有較強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)針對(duì)同型 HPV 病毒的中和抗體(Kirnbauer, R.，F(xiàn). Booy, et al. 1992 Proc Natl Acad Sci U S A 89(24) :12180-4)。并且，病毒樣顆粒不帶有病毒核酸，無潛在致癌危險(xiǎn)，具有良好的安全性。因此，VLP疫苗已成為HPV疫苗發(fā)展的主要方向。HPV VLP疫苗研制的關(guān)鍵是能夠大量高效制備VLP樣品。目前較為常用的VLP表達(dá)系統(tǒng)可以分為真核表達(dá)系統(tǒng)及原核表達(dá)系統(tǒng)。常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有痘病毒表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)。 在真核表達(dá)系統(tǒng)中所表達(dá)的HPV Ll蛋白天然構(gòu)象破壞少，能自發(fā)形成VLP，往往只需進(jìn)行簡(jiǎn)單的密度梯度離心即可得到純化的VLP，為純化工作提供極大的便利。但是由于真核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量低，培養(yǎng)成本高，給大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)帶來了極大困難。目前已上市的HPV 疫苗Gardas i 1 采用了釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)量低，生產(chǎn)成本高，因此該產(chǎn)品價(jià)位偏高，影響其廣泛應(yīng)用。在原核表達(dá)系統(tǒng)中利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HPV Ll蛋白已有報(bào)道。例如已報(bào)道利用大腸桿菌表達(dá) HPV16 Ll 蛋白(Banks, L.，G. Matlashewski，et al. (1987). J Gen Virol 68 (Pt 12) :3081-9)。但是大腸桿菌表達(dá)的HPV Ll蛋白大多失去其天然構(gòu)象，不能產(chǎn)生針對(duì)HPV的保護(hù)抗體?；蛘弑M管上述蛋白通過包含體純化，復(fù)性等步驟也可得到HPV VLP (Kelsall, S. R. and J. K. Kulski (1995). J Virol Methods 53(1) :75-90)，但是在復(fù)性過程中蛋白損失量大，得率低，因此，難以在大規(guī)模生產(chǎn)上應(yīng)用。雖然HPV Ll蛋白也可以在大腸桿菌中以正確構(gòu)象可溶性地表達(dá)，溶解于菌體的裂解上清中，但是其表達(dá)量較低，而且上清中雜蛋白種類多且量大，要從中純化出目的蛋白難度相當(dāng)大。雖然也有文獻(xiàn)報(bào)道通過 GST融合表達(dá)的方式可以增加上清中Ll蛋白的表達(dá)量，而且有助目的蛋白的純化(Li，M.， T. P. Cripe, et al. (1997). J Virol 71(4) :2988-95)，但融合蛋白的切割往往需要價(jià)格昂貴的酶，依然無法應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，本領(lǐng)域仍然需要能夠低成本獲得且能夠誘導(dǎo)針對(duì)HPV的保護(hù)性抗體的HPV Ll蛋白及由其組成的病毒樣顆粒，從而使大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)宮頸癌疫苗成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明至少部分基于發(fā)明人的出人意料的發(fā)現(xiàn)利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能大量表達(dá)可以誘導(dǎo)針對(duì)HPV33的中和抗體的截短的HPV33 Ll蛋白，該截短的HPV33 Ll蛋白具有高產(chǎn)率，且經(jīng)純化后純度可達(dá)到96%或更高，并且純化后的所述蛋白經(jīng)進(jìn)一步處理可得到可誘導(dǎo)針對(duì)HPV33的保護(hù)性抗體的病毒樣顆粒。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種截短的HPV33 Ll蛋白或其變體，其與野生型 HPV33 Ll 蛋白相比，N端截短了 9-19 個(gè)氨基酸，例如 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 和 19
個(gè)氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與野生型HPV33 Ll蛋白相比，該截短的HPV33 Ll蛋白的N端截短了 9個(gè)、11個(gè)、14個(gè)或19個(gè)氨基酸。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該截短的HPV33 Ll蛋白(以下也簡(jiǎn)稱為截短蛋白) 具有SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5，SEQ ID NO 6或SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該截短蛋白具有如SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的截短蛋白或其變體的多核苷酸以及含有該多核苷酸的載體。可用于插入目的多核苷酸的載體是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于克隆載體和表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體是例如質(zhì)粒，粘粒，噬菌體，柯斯質(zhì)粒等等。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及包含上述多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。此類宿主細(xì)胞包括但不限于，原核細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞，以及真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如小鼠細(xì)胞、人細(xì)胞等)。本發(fā)明的宿主細(xì)胞還可以是細(xì)胞系，例如細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種HPV33病毒樣顆粒，其中該病毒樣顆粒含有本發(fā)明的截短蛋白或其變體，或者由本發(fā)明的截短蛋白或其變體組成或形成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的HPV33病毒樣顆粒包含與野生型HPV33 Ll蛋白相比，N端截短了 9-19個(gè)氨基酸，例如9個(gè)、11個(gè)、14個(gè)或19個(gè)氨基酸的截短的HPV33 Ll蛋白，或由所述蛋白組成或形成。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的HPV33病毒樣顆粒包含具有SEQ ID Ν0:4，5，6或7所示序列的截短的HPV33 Ll蛋白，或由所述蛋白組成或形成。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及包含上述截短蛋白或其變體，或上述多核苷酸或載體或宿主細(xì)胞或HPV33病毒樣顆粒的組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含本發(fā)明的截短蛋白或其變體。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含本發(fā)明的HPV33 病毒樣顆粒。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及一種藥物組合物或疫苗，其包含本發(fā)明的HPV33病毒樣顆粒，任選地還包含藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物或疫苗可以用于預(yù)防HPV(特別是HPV3;3)感染或由HPV(特別是HPV3;3)感染所導(dǎo)致的疾病例如宮頸寺。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HPV33病毒樣顆粒以預(yù)防HPV感染或?qū)m頸癌有效量存在。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或疫苗還包含至少一種選自下列的病毒樣顆粒HPV6 Ll蛋白病毒樣顆粒，HPVll Ll蛋白病毒樣顆粒，HPV16 Ll蛋白病毒樣顆粒，HPV18L1蛋白病毒樣顆粒，HPV31 Ll蛋白病毒樣顆粒，HPV45 Ll蛋白病毒樣顆粒， HPV52 Ll蛋白病毒樣顆粒，HPV58 Ll蛋白病毒樣顆粒；優(yōu)選地，這些病毒樣顆粒各自獨(dú)立地以預(yù)防宮頸癌或者相應(yīng)HPV亞型感染有效量存在。本發(fā)明的藥物組合物或疫苗可通過本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行施用，例如但不限于通過口服或者注射進(jìn)行施用。在本發(fā)明中，特別優(yōu)選的施用方式是注射。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或疫苗以單位劑量形式進(jìn)行施用。例如但不意欲限定本發(fā)明，每單位劑量中包含的HPV33病毒樣顆粒的量為5 μ g-80 μ g， 優(yōu)選 20μ g-40y g。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種獲得本發(fā)明的截短蛋白的方法，其包括利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明的截短蛋白，然后將含有該截短蛋白的裂解上清進(jìn)行純化處理。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，獲得本發(fā)明的截短蛋白的方法包括a)在大腸桿菌中表達(dá)所述截短蛋白，b)將表達(dá)所述截短蛋白的大腸桿菌在鹽濃度為100mM-600mM的溶液中破碎，分離得到上清液，c)用水或低鹽溶液將b)獲得的上清液的鹽濃度降至IOOmM或以下，最低至0，并收集沉淀，d)將c)獲得的沉淀在150mM-2500mM鹽溶液中重新溶解，同時(shí)加入還原劑，分離得到溶液，該溶液中含純度至少50%的截短的HPV33 Ll蛋白。更一般性地，本發(fā)明還涉及一種獲得HPV Ll蛋白例如本發(fā)明的截短蛋白的方法， 其包括a)在大腸桿菌中表達(dá)編碼HPV Ll蛋白的HPV Ll基因，b)將表達(dá)HPV Ll蛋白的大腸桿菌在鹽濃度為100mM-600mM的溶液中破碎，分離得到上清液，c)用水或低鹽溶液將b)獲得的上清液的鹽濃度降至IOOmM或以下，最低至0，收集沉淀，d)將c)獲得的沉淀在150mM-2500mM鹽溶液中重新溶解，同時(shí)加入還原劑，分離得到溶液，該溶液中含純度至少50%的HPV Ll蛋白。本發(fā)明還涉及一種獲得本發(fā)明的HPV33病毒樣顆粒的方法，其在獲得本發(fā)明的截短蛋白的基礎(chǔ)上，包括步驟e)將純度至少50%的上述截短的HPV33 Ll蛋白進(jìn)一步通過色譜層析純化，f)將步驟e)中得到的截短蛋白去除還原劑。本發(fā)明還涉及一種制備疫苗的方法，其包括將本發(fā)明的HPV33病毒樣顆粒與藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑混合，任選地還混合一種或多種選自HPV6，11，16，18，31，45，52 和58的HPV型別的病毒樣顆粒。如上所論述的，所獲得的疫苗可以用于預(yù)防HPV(特別是 HPV33)感染或由HPV(特別是HPV3;3)感染所導(dǎo)致的疾病例如宮頸癌等。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種預(yù)防HPV感染或由HPV感染所導(dǎo)致的疾病的方法， 其包括將預(yù)防有效量的根據(jù)本發(fā)明的HPV33病毒樣顆?；蛩幬锝M合物或疫苗施用給受試者。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HPV感染是HPV33感染。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 所述由HPV感染所導(dǎo)致的疾病包括但不限于，宮頸癌。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述受試者是哺乳動(dòng)物，例如人。在另一個(gè)方面，還涉及根據(jù)本發(fā)明的截短蛋白或HPV33病毒樣顆粒在制備藥物組合物或疫苗中的用途，所述藥物組合物或疫苗用于預(yù)防HPV感染或由HPV感染所導(dǎo)致的疾病。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HPV感染是HPV33感染。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 所述由HPV感染所導(dǎo)致的疾病包括但不限于，宮頸癌。
本發(fā)明中相關(guān)術(shù)語的說明及解釋在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。根據(jù)本發(fā)明，表述“N端截短了 X個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)”是指，用起始密碼子(用于起始蛋白質(zhì)翻譯)編碼的甲硫氨酸殘基置換蛋白質(zhì)N末端的第I-X位氨基酸殘基所獲得的蛋白質(zhì)。例如N端截短了 9個(gè)氨基酸的HPV33 Ll蛋白是指，用起始密碼子編碼的甲硫氨酸殘基置換野生型HPV33 Ll蛋白N末端的第1-9位氨基酸殘基所獲得的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“變體”是指這樣的蛋白，其氨基酸序列與本發(fā)明的截短的HPV33 Ll蛋白(如SEQ ID N0:4，5，6或7所示的蛋白)的氨基酸序列具有一個(gè)或多個(gè)(例如1_10 個(gè)或1-5個(gè)或1-3個(gè))氨基酸不同或者具有至少60%，80%，85%，90%，95%，96%，97%， 98%，或99%的同一性，并且其保留了所述截短蛋白的必要特性。此處術(shù)語“必要特性”可以是如下特性中的一個(gè)或者多個(gè)能夠誘導(dǎo)針對(duì)HPV33的中和抗體；能夠在大腸桿菌中可溶性地表達(dá)；利用本發(fā)明所涉及的表達(dá)純化方法能夠獲得高產(chǎn)率的純化蛋白。術(shù)語“同一性”是對(duì)核苷酸序列或氨基酸序列的相似性的量度。通常將序列排列起來，以獲得最大限度的匹配?！巴恍浴北旧砭哂斜绢I(lǐng)域公知的意義并且可用公開的算法(例如BLAST)來計(jì)算。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)”是指由大腸桿菌(菌株)與載體組成的表達(dá)系統(tǒng)，其中大腸桿菌(菌株)來源于市場(chǎng)上可得到的菌株，例如但不限于ER2566， BL21 (DE3)，B834(DE3)，BLR (DE3)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“載體(vector) ”是指，可將多核苷酸插入其中的一種核酸運(yùn)載工具。當(dāng)載體能使插入的多核苷酸所編碼的蛋白獲得表達(dá)時(shí)，載體稱為表達(dá)載體。載體可以通過轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。 載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于質(zhì)粒；噬菌體；柯斯質(zhì)粒等等。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“截短的HPV33 Ll蛋白”是指在野生型HPV33L1蛋白的N端和 /或C端去掉一個(gè)或者多個(gè)氨基酸后的蛋白質(zhì)，其中野生型HPV33 Ll蛋白的例子包括但不限于 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中 P06416. 1，ACV84008. 1，ACV84011. 1，ACV84012. 1 或 ACL12333. 1 等全長(zhǎng)Ll蛋白。術(shù)語“截短的HPV33 Ll蛋白基因片段”是指這樣的基因片段，其與野生型HPV33 Ll蛋白基因(cDNA)相比，在5'端或3'端去掉編碼一個(gè)或多個(gè)氨基酸的核苷酸，其中野生型HPV33 Ll蛋白基因的全長(zhǎng)序列例如但不限于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中如下序列:GQ479013. 1， GQ479014. 1，M12732. 1，GQ479012. 1，GQ479015. 1，GQ479016. 1，EU918766. 1，GQ479017. 1， GQ479018. 1 或 GQ479019. 1 等。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑”是指在藥理學(xué)和/或生理學(xué)上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領(lǐng)域公知的(參見 例如 Remington ‘ s Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR,19th ed. Pennsylvania =Mack Publishing Company, 1995)，并且包括但不限于pH 調(diào)節(jié)劑，表面活性劑，佐劑，離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑。例如，PH調(diào)節(jié)劑包括但不限于磷酸鹽緩沖液；表面活性劑包括但不限于陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑，例如Tween-80 ；佐劑包括但不限于鋁佐劑(例如氫氧化鋁)，弗氏佐劑(例如完全弗氏佐劑)；離子強(qiáng)度增強(qiáng)劑包括但不限于氯化鈉。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“有效量”是指能夠有效實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的的量。例如，預(yù)防疾病(例如HPV感染)有效量是指，能夠有效預(yù)防，阻止，或延遲疾病(例如HPV感染)的發(fā)生的量。 測(cè)定這樣的有效量在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“色譜層析”包括但不限于離子交換色譜(例如陽離子交換色譜)、疏水相互作用色譜、吸附層析法(例如羥基磷灰石色譜)、凝膠過濾(凝膠排阻)層析、 親和層析法。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的截短的HPV33 Ll蛋白優(yōu)選通過如下步驟獲得將表達(dá)截短的HPV33 Ll蛋白的大腸桿菌在鹽濃度為100-600mM，優(yōu)選200-500mM的緩沖液中進(jìn)行破碎， 離心破碎溶液，得到上清液；用水或低鹽濃度(通常低于破碎用的鹽濃度)的溶液降低所得上清液的鹽濃度至鹽濃度IOOmM-OmM,從而截短的HPV33 Ll蛋白在上清液中沉淀；將沉淀在含還原劑及鹽濃度為150-2500mM，優(yōu)選200mM以上的溶液中重新溶解，從而分離得到含截短的HPV33 Ll蛋白的溶液，其中所述蛋白的純度為至少50%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少 80%。可用于本發(fā)明的方法中的緩沖液是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于，Tris緩沖液，磷酸鹽緩沖液，HEPES緩沖液，MOPS緩沖液等等。根據(jù)本發(fā)明，宿主細(xì)胞的破碎可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法來實(shí)現(xiàn)，包括但不限于勻漿器破碎、均質(zhì)機(jī)破碎、超聲波處理、研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理等等?？捎糜诒景l(fā)明的方法中的鹽包括但不限于酸式鹽，堿式鹽，中性鹽，例如堿金屬鹽、堿土金屬鹽、銨鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鹽或磷酸氫鹽，特別是NaCl、KCl、 NH4Cl, (NH4)2SO4中的一種或幾種。特別優(yōu)選的鹽是NaCl?？捎糜诒景l(fā)明的方法中的還原劑包括但不限于DTT，2-巰基乙醇，其用量包括但不限于10mM-100mM。根據(jù)本發(fā)明的HPV33病毒樣顆?？赏ㄟ^如下步驟獲得將上述純度至少50 %的截短的HPV33 Ll蛋白通過例如色譜層析進(jìn)行進(jìn)一步分離，得到經(jīng)純化的截短蛋白溶液；去除該溶液中的還原劑，得到所述HPV33病毒樣顆粒。去除還原劑的方式是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于，透析，超濾或者層析等。發(fā)明的有益效果目前用于制備HPV病毒樣顆粒的表達(dá)系統(tǒng)可以分為真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)。在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的HPV Ll蛋白天然構(gòu)象破壞少，能自發(fā)形成VLP，往往只需進(jìn)行簡(jiǎn)單的純化過程即可獲得具有正確構(gòu)象的VLP。但目前真核表達(dá)系統(tǒng)例如桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)存在表達(dá)量低，培養(yǎng)成本高等缺陷，給大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)帶來了極大困難。在原核表達(dá)系統(tǒng)中，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)成本低，表達(dá)量大的優(yōu)點(diǎn)。然而， 在大腸桿菌中表達(dá)的HPV Ll蛋白往往失去正確的天然構(gòu)象，以包含體形式表達(dá)于沉淀中。 目前對(duì)表達(dá)于包含體中的蛋白進(jìn)行復(fù)性依然是一個(gè)世界性難題。復(fù)性困難和效率低下使得從包含體中獲得有正確構(gòu)象的VLP難以在大規(guī)模生產(chǎn)中實(shí)施，只能局限于小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室研究中。雖然HPV Ll也可以以正確構(gòu)象可溶性地表達(dá)于大腸桿菌中，但是其表達(dá)量低下。并且，從包含種類繁多的可溶性蛋白的大腸桿菌裂解上清中純化出HPV Ll蛋白也相當(dāng)困難，往往需要借助融合表達(dá)及親和層析等手段，而這些手段又往往需要昂貴的酶，因此，仍然無法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明提供的N端截短的HPV33 Ll蛋白和其制備方法有效地解決了上述問題。 首先，本發(fā)明使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)N端截短的HPV33 Ll蛋白，確保了其高表達(dá)量。 其次，本發(fā)明采用溫和的手段選擇性沉淀大腸桿菌裂解上清中的截短蛋白，然后采用含鹽緩沖液重新溶解截短蛋白，從而在保持截短蛋白的正確構(gòu)象的前提下使蛋白純度有了顯著提高，并且獲得的截短蛋白溶液可以直接通過色譜層析例如離子交換層析及疏水交換層析進(jìn)行進(jìn)一步純化，獲得高純度的目的蛋白(例如純度達(dá)到96%)。進(jìn)一步，所獲得的高純度截短蛋白可以組裝為病毒樣顆粒，并且該病毒樣顆?？梢栽隗w內(nèi)誘導(dǎo)高滴度的針對(duì)HPV33 的中和抗體，具有良好的免疫原性，是一種良好的疫苗形式，可用于預(yù)防HPV33對(duì)人體的感染。由此可見，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的截短蛋白在保留全長(zhǎng)HPV33 Ll蛋白的抗原性及顆粒組裝能力的同時(shí)，可在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)大量表達(dá)；本發(fā)明所采用的制備方法無需使用昂貴的酶，成本低廉；截短蛋白在純化過程中構(gòu)象沒有經(jīng)過劇烈的變性復(fù)性過程，損失小，產(chǎn)率高；截短蛋白所形成的病毒樣顆粒能夠誘導(dǎo)高滴度的針對(duì)HPV的保護(hù)性抗體，可用于生產(chǎn)疫苗。因此，本發(fā)明的截短蛋白和其制備方法可應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，并且使大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)宮頸癌疫苗成為可能。下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實(shí)施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯然。


圖1顯示了在實(shí)施例2的不同步驟中獲得的HPV33N9C-L1蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果。泳道M 蛋白分子量標(biāo)記；泳道1 破菌上清(即，破碎菌體后離心獲得的上清)；泳道2 無鹽沉淀產(chǎn)物(即，透析后離心獲得的沉淀)；泳道3 重溶后上清(即，將無鹽沉淀產(chǎn)物重新溶解后離心獲得的上清)；泳道4:重溶后沉淀(即，將無鹽沉淀產(chǎn)物重新溶解后離心獲得的沉淀)。結(jié)果顯示，HPV33N9C-L1蛋白在通過沉淀，重溶的步驟之后，純度從之前的約10%提高到了約70% (參見泳道1和3)。圖2顯示了實(shí)施例3中經(jīng)HIC(疏水相互作用色譜)純化獲得的HPV33N9C-L1的 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果。泳道M 蛋白分子量標(biāo)記；泳道1 用Butyl Sepharose 4 Fast Flow柱進(jìn)行純化前的樣品；泳道2 :Butyl Sepharose 4 Fast Flow柱穿透級(jí)分；泳 M 3 =ButylSepharose 4 Fast Flow 柱 200mmol/L NaCl 洗脫級(jí)分(10 μ 1)。結(jié)果顯示，經(jīng)過Butyl Sepharose 4 Fast Flow柱純化后，HPV33N9C-L1蛋白純度達(dá)到98%以上(參見泳道3)。圖3顯示了實(shí)施例4中所得的HPV33N9C-L1病毒樣顆粒的透射電鏡觀察(放大 50，000倍，Bar = 0. 2 μ m)結(jié)果。視野中可見大量半徑為25nm左右的病毒樣顆粒，顆粒大小與理論大小相符，且均勻一致。圖4顯示了實(shí)施例4中所得的HPV33N9C-L1病毒樣顆粒的動(dòng)態(tài)光散射觀測(cè)結(jié)果。
10結(jié)果顯示，HPV33N9C-L1病毒樣顆粒的水化分子動(dòng)力學(xué)半徑為27. 77nm，顆粒組裝百分比為 100%。圖5顯示了實(shí)施例5中用HPV33N9C-L1病毒樣顆粒接種小鼠后不同階段血清的中和抗體滴度。在初次免疫2周后，中和抗體滴度即有明顯上升；在經(jīng)過一次加強(qiáng)免疫后，中和抗體的滴度即能達(dá)到IO5的較高水平。圖6顯示了實(shí)施例5中用HPV33N9C-L1病毒樣顆粒接種兔子后不同階段血清的中和抗體滴度。在初次免疫1個(gè)月后，中和抗體滴度即有明顯上升；在經(jīng)過一次加強(qiáng)免疫后， 中和抗體的滴度即能達(dá)到IO6的較高水平。圖7顯示了實(shí)施例6得到的N端截短了 11個(gè)，14個(gè)或19個(gè)氨基酸的HPV33 Ll 蛋白—HPV33N1 IC-Ll, HPV33N14C-L1, HPV33N19C-L1 (其氨基酸序列分別是 SEQ ID NO :5， SEQ ID NO 6, SEQ ID NO :7)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果。泳道M，蛋白分子量標(biāo)記；泳道1，HPV33N1 IC-Ll蛋白，上樣體積為10 μ 1 ；泳道2，HPV33N14C-L1蛋白，上樣體積為10μ 1 ；泳道3，HPV33N19C-L1蛋白，上樣體積為10μ 1。結(jié)果顯示，實(shí)施例6得到的蛋白 HPV33N1 IC-Ll, HPV33N14C-L1, HPV33N19C-L1 的蛋白純度均達(dá)到了 98% 以上。圖8顯示了實(shí)施例6中所述的HPV33N11C-L1病毒樣顆粒的透射電鏡觀察(50，000 倍，0. 2um)結(jié)果。結(jié)果顯示，視野中可見大量半徑為25nm左右的病毒樣顆粒，顆粒大小與理論大小相符，且均勻一致。圖9顯示了實(shí)施例6中所述的HPV33N14C-L1病毒樣顆粒的透射電鏡觀察(50，000 倍，0. 2um)結(jié)果。結(jié)果顯示，視野中可見大量半徑為25nm左右的病毒樣顆粒，顆粒大小與理論大小相符，且均勻一致。圖10顯示了實(shí)施例6中所述的HPV33N19C-L1病毒樣顆粒的透射電鏡觀察 (50，000倍，0.211!11)結(jié)果。結(jié)果顯示，視野中可見大量半徑為25nm左右的病毒樣顆粒，顆粒大小與理論大小相符，且均勻一致。圖11顯示了實(shí)施例6中所述的HPV33N11C-L1病毒樣顆粒的動(dòng)態(tài)光散射觀測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示，HPV33N1 IC-Ll病毒樣顆粒的水化分子動(dòng)力學(xué)半徑為28. 34nm左右，顆粒組裝百分比為100%。圖12顯示了實(shí)施例6中所述的HPV33N14C-L1病毒樣顆粒的動(dòng)態(tài)光散射觀測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示，HPV33N14C-L1病毒樣顆粒的水化分子動(dòng)力學(xué)半徑為26. 03nm左右，顆粒組裝百分比為100%。圖13顯示了實(shí)施例6中所述的HPV33N19C-L1病毒樣顆粒的動(dòng)態(tài)光散射觀測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示，HPV33N19C-L1病毒樣顆粒的水化分子動(dòng)力學(xué)半徑為27. Ilnm左右，顆粒組裝百分比為100%。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)參照下列意在舉例說明本發(fā)明(而非限定本發(fā)明)的實(shí)施例來描述本發(fā)明。除非特別指明，本發(fā)明中所使用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和免疫檢測(cè)法，基本上參照J(rèn). Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989，以及 F. M. Ausubel等人，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，第3版，John ffiley&Sons, Inc.，1995中所述的方法進(jìn)行；限制性內(nèi)切酶的使用依照產(chǎn)品制造商推薦的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，實(shí)施例以舉例方式描述本發(fā)明，且不意欲限制本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1.具有SEQ ID NO 4所示序列的截短的HPV33 Ll蛋白的表達(dá)HPV33 Ll全長(zhǎng)基因片段的制備以從福建省廈門市子宮頸癌病人陰道分泌物中提取的DNA為模板，HPV33S 5' -CAT ATG TCC GTG TGG CGG CCT AG_3' (SEQ ID NO :12)為正向引物，HPV33 R 5' -GTC GAC TTA TTT TTT AAC CTT TTT GC_3' (SEQ ID NO :13)為反向引物，在PCR儀(Biometra, T3)中按照如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，制備HPV33 Ll全長(zhǎng)基因片段。
權(quán)利要求
1.一種截短的HPV33 Ll蛋白或其變體，其與野生型HPV33 Ll蛋白相比，N端截短了 9-19 個(gè)氨基酸，例如 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 和 19 個(gè)氨基酸；優(yōu)選地，與野生型HPV33 Ll蛋白相比，該截短的HPV33 Ll蛋白N端截短了 9個(gè)、11個(gè)、 14個(gè)或19個(gè)氨基酸；優(yōu)選地,該截短的 HPV33 Ll 蛋白具有 SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:5，SEQ ID NO :6 或 SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列，更優(yōu)選地具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列。
2.一種分離的核酸，其編碼權(quán)利要求1的截短的HPV33 Ll蛋白或其變體。
3.包含權(quán)利要求2的分離的核酸的載體。
4.包含權(quán)利要求2的分離的核酸和/或權(quán)利要求3的載體的宿主細(xì)胞。
5.一種HPV33病毒樣顆粒，其含有權(quán)利要求1的截短蛋白或其變體，或者由權(quán)利要求1 的截短蛋白或其變體組成。
6.一種組合物，其包含權(quán)利要求1的截短的HPV33 Ll蛋白或其變體，或權(quán)利要求2的分離的核酸，或權(quán)利要求3的載體，或權(quán)利要求4的宿主細(xì)胞，或權(quán)利要求5的HPV33病毒樣顆粒。
7.一種藥物組合物或疫苗，其包含權(quán)利要求5的HPV33病毒樣顆粒，任選地還包含藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑，優(yōu)選地，所述HPV33病毒樣顆粒以預(yù)防HPV感染或?qū)m頸癌有效量存在；優(yōu)選地，所述藥物組合物或疫苗還包含至少一種選自下列的病毒樣顆粒HPV6 Ll蛋白病毒樣顆粒，HPVll Ll蛋白病毒樣顆粒，HPV16 Ll蛋白病毒樣顆粒，HPV18 Ll蛋白病毒樣顆粒，HPV31 Ll蛋白病毒樣顆粒，HPV45 Ll蛋白病毒樣顆粒，HPV52 Ll蛋白病毒樣顆粒和 HPV58 Ll蛋白病毒樣顆粒。
8.獲得截短的HPV33Ll蛋白的方法，其包括利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)權(quán)利要求1的截短的HPV33 Ll蛋白，然后將含有該蛋白的裂解上清進(jìn)行純化處理，優(yōu)選地，所述方法包括步驟a)在大腸桿菌中表達(dá)所述截短蛋白，b)將表達(dá)所述截短蛋白的大腸桿菌在鹽濃度為100mM-600mM的溶液中破碎，分離得到上清液，c)用水或低鹽溶液將b)獲得的上清液的鹽濃度降至IOOmM或以下，最低至0，并收集沉淀，d)將c)獲得的沉淀在150mM-2500mM鹽溶液中重新溶解，同時(shí)加入還原劑，分離得到溶液，該溶液中含純度至少50%的截短的HPV33 Ll蛋白。
9.制備權(quán)利要求5的HPV33病毒樣顆粒的方法，其包括步驟a)將根據(jù)權(quán)利要求8的方法獲得的截短的HPV33Ll蛋白通過色譜層析進(jìn)行純化，b)將步驟a)中得到的截短蛋白去除還原劑。
10.一種制備疫苗的方法，其包括將權(quán)利要求5的HPV33病毒樣顆?；蛲ㄟ^權(quán)利要求9 的方法獲得的HPV33病毒樣顆粒與藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑混合，任選地還混合一種或多種選自HPV6，11，16，18，31，45，52和58的HPV型別的病毒樣顆粒。
11.一種預(yù)防HPV感染或由HPV感染所導(dǎo)致的疾病的方法，其包括將預(yù)防有效量的權(quán)利要求5的HPV33病毒樣顆粒，或通過權(quán)利要求9的方法獲得的HPV33病毒樣顆粒，或權(quán)利要求7的藥物組合物或疫苗，或通過權(quán)利要求10的方法獲得的疫苗施用給受試者， 優(yōu)選地，所述HPV感染是HPV33感染； 優(yōu)選地，所述由HPV感染所導(dǎo)致的疾病是宮頸癌。
12.權(quán)利要求1的截短的HPV33 Ll蛋白或其變體，或權(quán)利要求5的HPV33病毒樣顆粒，或通過權(quán)利要求8的方法獲得的截短的HPV33 Ll蛋白，或通過權(quán)利要求9的方法獲得的HPV33病毒樣顆粒在制備藥物組合物或疫苗中的用途，所述藥物組合物或疫苗用于預(yù)防 HPV感染或由HPV感染所導(dǎo)致的疾病， 優(yōu)選地，所述HPV感染是HPV33感染； 優(yōu)選地，所述由HPV感染所導(dǎo)致的疾病是宮頸癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種截短的人乳頭瘤病毒33型L1蛋白，其編碼序列和制備方法，以及包含其的病毒樣顆粒，所述蛋白和病毒樣顆?？捎糜陬A(yù)防HPV(特別是HPV33)感染及由HPV(特別是HPV33)感染所導(dǎo)致的疾病例如宮頸癌等。本發(fā)明還涉及上述蛋白和病毒樣顆粒用于制備藥物組合物或疫苗的用途，所述藥物組合物或疫苗用于預(yù)防HPV(特別是HPV33)感染及由HPV(特別是HPV33)感染所導(dǎo)致的疾病例如宮頸癌等。
文檔編號(hào)A61K39/12GK102229660SQ201110136560
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者夏寧邵, 孔祥林, 張軍, 李少偉, 潘暉榕, 魏旻希 申請(qǐng)人:廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司, 廈門大學(xué)