專利名稱：一種用抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌特異性IgY抗體制備的預(yù)防牙齦炎及其口臭的漱口水的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及口腔用品技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用抗具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌特異性IgY抗體制備的預(yù)防由這兩種菌引起的牙齦炎及其口臭的漱口水。
背景技術(shù)：
我國牙銀、牙周疾病發(fā)病率占人口的70%以上,牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)是慢性齦緣炎、慢性牙周炎、侵襲性牙周炎等牙周病的主要可疑致病菌，其菌毛能夠與口腔上皮細(xì)胞表面的甘油醛-3-磷酸脫氫酶結(jié)合，侵入牙齦上皮細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞，逃避免疫清除。牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)生二肽酰氨肽酶降解結(jié)締組織，促進MMP-2和MMP-I活性增加。牙齦卟啉單胞菌的精氨酸和賴氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(RgpA、RgpB,Kgp)能水解L-12導(dǎo)致INN Y產(chǎn)生減少。部分牙齦卟啉單細(xì)胞毛能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達·L-Ia、L-I β、L_6、TNF a導(dǎo)致牙槽骨破壞。在牙周病患者同時伴隨著口臭的發(fā)生，其口臭主要有具核梭桿菌引起。目前沒有有效的治療口臭的方法，使用抗菌素類藥物治療口臭有很多弊端。對于預(yù)防和治療牙周病及其口臭從主要的病因菌牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌中著手是關(guān)鍵所在。目前用于預(yù)防和治療牙齦炎的漱口水一般為含有中草藥成分的漱口水。雖然這類的專利有很多，但均無明確療效?，F(xiàn)有文獻報道表明臨床上使用特異性IgY抗體預(yù)防齲齒和治療嬰幼兒輪狀病毒性腹瀉，預(yù)防肺纖維化患者綠膿桿菌感染，減輕幽門螺桿菌引起的胃痛效果顯著，且無副作用和成癮性。在我們研究的許多種類的IgY中發(fā)現(xiàn)，有的牙周病因菌免疫母雞產(chǎn)生的IgY抗體經(jīng)實驗證明沒有或沒有明顯的抑制牙周病及其口臭的趨勢和療效。簡單的說，不是所有的IgY都有明顯的治療作用。由于牙周病及其口臭的可疑病因菌有十一種之多，但主要的可疑病因菌包括牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、伴放線菌放線桿菌、棲牙密螺旋體、福氏擬桿菌、牙齦二氧化碳噬纖維菌等。在探索制備對應(yīng)的IgY用于治療牙周病及其口臭的同時，我們推測牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、伴放線菌放線桿菌、棲牙密螺旋體、福氏擬桿菌、牙齦二氧化碳噬纖維菌都有可能引起牙周病及其口臭；因為我們事先無法預(yù)測在這當(dāng)中的哪些菌是引起牙周病及其口臭的主要因素，哪些菌是引起牙周病及其口臭是次要因素。我們認(rèn)為必須有合適的抗牙周病及其口臭的試驗來確定哪些菌是引起牙周病及其口臭的主要因素。從而指導(dǎo)制備抗牙周病及其口臭的藥物或衛(wèi)生產(chǎn)品。目前的現(xiàn)有技術(shù)沒有相關(guān)的提示指導(dǎo)技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)抗牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌復(fù)合IgY是解決治療牙周病及其口臭的關(guān)鍵。技術(shù)人員無法預(yù)先在不做抗牙周病及其口臭的實驗的前提下，預(yù)先得知牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌是引起牙周病及其口臭的主要因素。技術(shù)人員無法預(yù)先在不做抗牙周病及其口臭的實驗的前提下，預(yù)先得知抗牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌復(fù)合IgY比單獨的抗牙齦卟啉單胞菌IgY、單獨的抗具核梭桿菌IgY的效果更好。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對現(xiàn)有牙周病藥物漱口水治療效果不佳的問題而提供一種用抗具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌特異性IgY抗體制備的預(yù)防由這兩種菌弓I起的牙齦炎及其口臭的漱口水。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)—種用抗牙銀卟啉單胞菌和具核梭桿菌特異性IgY抗體制備的預(yù)防牙銀炎及其口臭的漱口水，由抗牙周致病菌IgY制劑和漱口水基料組成，所述抗牙周致病菌IgY制劑 由由占漱口水總質(zhì)量的質(zhì)量百分比原料組成抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑O. 01 O. 5%、洗必泰O. 01-2. 0%、甘油I. 0-30. 0%、聚乙烯吡咯烷酮O. 1-2. 0%，其中洗必泰、甘油、聚乙烯吡咯烷酮構(gòu)成抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY抗體制劑保護劑。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述漱口水基料由占漱口水總質(zhì)量的質(zhì)量百分比原料組成甘油I. 0-10. 0%,山梨醇 10-20%，丙二醇 I. 0-5. 0%,木糖醇 I. 0-5. 0%,吐溫201. 0-3. 0%,吐溫 801. 0-3. 0%, CrmopherRH400. 5-3. 0%, PVM/MA 聚合物 O. 6-2. 0%,苯甲酸鈉O. 5-1. 5%，阿斯巴甜O. 1-0. 5%，糖精O. 1-0. 3%，香精O. 01-0. 8%，食用色素適量，去離子水余量。本發(fā)明用于預(yù)防牙周病及其口臭的漱口水，對預(yù)防牙周病和口臭具有明顯的效果O
具體實施例方式下面結(jié)合實施例詳細(xì)描述本發(fā)明的實現(xiàn)方案。下面實施例所涉及的菌種皆由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。實施例I :抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY抗體制劑的制備A.牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌培養(yǎng)步驟A. I細(xì)菌種類牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)和具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)；A. 2取牙齦卟啉單胞菌(P. g)ATCC33277菌株和具核梭桿菌(Fn)ATCC10953菌株，分別經(jīng)BHI-S培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和擴增培養(yǎng)的牙齦卟啉單細(xì)胞菌、具核梭桿菌，并經(jīng)鑒定確認(rèn)為牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌而得到牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片、具核梭桿菌菌體和菌體碎片；B.免疫原制備步驟B. I取牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片10 70重量份，具核梭桿菌菌體和菌體碎片30 90重量份混合成菌液抗原；B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐劑混合免疫原含有細(xì)菌10億-80億；B. 3將等體積的混合菌液與等體積的福氏不完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑混合免疫原中含有細(xì)菌10億-80億；C.免疫步驟使用注射器將福氏完全佐劑混合免疫原皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞，每只產(chǎn)蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml_3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞。加強免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞加強免疫五次，前后共免疫八次；D.抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY提取物的制備收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，使用75%的酒精進行雞蛋表面消毒，打開蛋殼取蛋黃，去除蛋黃膜取蛋黃液，將蛋黃液與蒸餾水按體積比1:10的比例加蒸餾水，充分?jǐn)嚢?，并使用冰醋酸調(diào)節(jié)酸堿度至PH5. 30-5. 50,然后放置-20°c凍藏3天后取出解凍，取上清液，用凝膠過濾系統(tǒng)將蛋黃液濃縮20倍，用IN NaOH調(diào)節(jié)PH至7. 0-8. 0，置-20°C保藏。E. IgY純化步驟將抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經(jīng)中空纖維過濾器除鹽，即得抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體直接純品?？寡例l卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑純品經(jīng)ELISA方法測定，抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY純品中每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的效價為1:32000/mg蛋白，或者稱抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY純品中，每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的比活性為1:32000。在IgY抗體純品中，IgY抗體的純度經(jīng)非還原性SDS-PAGE測定為89. 3%。實施例2 抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑的制備A.牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌培養(yǎng)步驟A. I細(xì)菌種類牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)和具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)；A. 2取牙齦卟啉單胞菌(P. g)ATCC33277菌株和具核梭桿菌(Fn)ATCC10953菌株，分別經(jīng)BHI-S培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和擴增培養(yǎng)的牙齦卟啉單細(xì)胞菌、具核梭桿菌，并經(jīng)鑒定確認(rèn)為牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌而得到牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片、具核梭桿菌菌體和菌體碎片；B.免疫原制備步驟
B. I取牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片10 70重量份，具核梭桿菌菌體和菌體碎片30 90重量份混合成菌液抗原；B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐劑混合免疫原含有細(xì)菌10億-80億；B. 3將等體積的混合菌液與等體積的福氏不完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑混合免疫原中含有細(xì)菌10億-80億；C.免疫步驟使用注射器將福氏完全佐劑混合免疫原皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞，每只產(chǎn)蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml_3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞。加強免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑混合 免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞加強免疫五次，前后共免疫八次；D.抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY提取物的制備收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，用75%酒精消毒雞蛋外殼，打碎蛋殼，留取蛋黃。用去離子水10倍稀釋蛋黃后，用冰醋酸和無水乙酸鈉調(diào)節(jié)PH至
5.30-5. 50.，4°C沉降后取上清液，添加2%的殼聚糖和海藻酸鈉，2%氯化鈣和多聚磷酸鈉絮凝沉降，再取上清液用凝膠過濾系統(tǒng)超濾去除多余的去離子水，將蛋黃液濃縮20倍左右，用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至7. 0-8. O,置-20°C保藏。E. IgY純化步驟將抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經(jīng)中空纖維過濾器除鹽，即得抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體直接純品。抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑純品經(jīng)ELISA方法測定，抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY純品中每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的效價為1:32000/mg蛋白，或者稱抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY純品中，每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的比活性為1:32000。在IgY抗體純品中，IgY抗體的純度經(jīng)非還原性SDS-PAGE測定為89. 3%。實施例3:單獨取牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片作為菌液；單獨制備抗牙齦卟啉單胞菌特異性IgY提取物。其余制備參照實施例I。實施例4 單獨取具核梭桿菌菌體碎片作為菌液；單獨制備抗具核梭桿菌特異性IgY提取物。其余制備參照實施例I。實驗例I :牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌等兩種細(xì)菌組合的免疫原按本發(fā)明的方法免疫產(chǎn)蛋母雞，取第一次免疫后30天免疫雞蛋，并按本發(fā)明的方法制備出抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY的提取物，應(yīng)用ELISA方法測定抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY結(jié)合不同抗原的生物學(xué)效價(見表I)表I抗牙齦卟啉單胞菌和抗具核梭桿菌IgY抗體提取物的效價
權(quán)利要求
1.一種用抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌特異性IgY抗體制備的預(yù)防牙齦炎及其口臭的IgY漱口水，其特征在于，由抗牙周致病菌IgY制劑和漱口水基料組成，所述抗牙周致病菌IgY制劑由由占漱口水總質(zhì)量的質(zhì)量百分比原料組成抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY抗體制劑O. Ol O. 5%、洗必泰O. 01-2. 0%、甘油I. 0-30. 0%、聚乙烯吡咯烷酮O. 1-2. 0%，其中洗必泰、甘油、聚乙烯吡咯烷酮構(gòu)成抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY抗體制劑保護劑。
2.如權(quán)利要求I所述的預(yù)防牙齦炎及其口臭的IgY漱口水，其特在于，所述漱口水基料由占漱口水總質(zhì)量的質(zhì)量百分比原料組成甘油 I. 0-10. 0%,山梨醇 10-20%,丙二醇 I. 0-5. 0%,木糖醇 I. 0-5. 0%,吐溫 201. 0-3. 0%,吐溫 801. 0-3. 0%, CrmopherRH400. 5-3. 0%, PVM/MA 聚合物 O. 6-2. 0%,苯甲酸鈉 O. 5-1. 5%,阿斯巴甜O. 1-0. 5%，糖精O. 1-0. 3%，香精O. 01-0. 8%，食用色素適量，去離子水余量。
全文摘要
本發(fā)明公開的一種用抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌特異性IgY抗體制備的預(yù)防牙周病及口臭的IgY漱口水，由抗牙周致病菌IgY制劑和漱口水基料組成，所述抗牙周致病菌IgY制劑由由占牙膏總質(zhì)量的質(zhì)量百分比原料組成抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑0.01～0.5%、洗必泰0.01-2.0%、甘油1.0-30.0%、聚乙烯吡咯烷酮0.1-2.0%，其中洗必泰、甘油、聚乙烯吡咯烷酮構(gòu)成抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑保護劑。本發(fā)明用于治療與預(yù)防牙齦炎及口臭的IgY漱口水對預(yù)防和治療牙齦炎及口臭具有明顯的效果。
文檔編號A61K8/81GK102860932SQ201210396508
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月18日
發(fā)明者陳健芬, 羅鑫龍, 孫曉青, 張萍 申請人:上海美加凈日化有限公司