專利名稱：構(gòu)建pGM-CSF-EGFP-IRES-Rae1-IL21載體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種載體的構(gòu)建方法，尤其涉及ー種構(gòu)建具有抑制免疫逃逸功能、促進(jìn)腫瘤細(xì)表達(dá)被免疫系統(tǒng)識(shí)別能力的載體的方法、所構(gòu)建的載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，早期肝癌的首選治療是肝移植和手術(shù)切除，但肝移植供體短缺，價(jià)格昂貴，導(dǎo)致大多數(shù)患者在等待供肝過程中死亡，故早期肝癌主要手術(shù)切除為主。對(duì)于失去手術(shù)機(jī)會(huì)的肝癌患者，現(xiàn)有的抗癌藥，生物利用率低、靶向性差，在殺傷肝癌細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞也有較大毒副作用，并嚴(yán)重抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致患者常死于化療藥物的并發(fā)癥。20世紀(jì)50年代Burnet和Thomas提出免疫系統(tǒng)能識(shí)別自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞(免疫監(jiān)視)，免疫監(jiān)視主要與抗病毒免疫有夫。抗腫瘤免疫面對(duì)的是“自身”抗原(腫瘤抗原)，以細(xì)胞免疫為主，需多種細(xì)胞參與，如CD8+T和CD4+T細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞。當(dāng)腫瘤細(xì)胞不表達(dá)抗原表位、抗原加工缺陷、抗原調(diào)變、抗原脫落、缺乏主要組織相容性復(fù)合體I (majorhistocompatibility complexI,
MHC-I)類分子、缺乏免疫共刺激分子、腫瘤細(xì)胞表達(dá)抑制分子、腫瘤細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞凋亡調(diào)控因子配體(FasL)等,或機(jī)體在免疫缺陷、免疫抑制均造成自然殺傷細(xì)胞(natural killer,NK)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicity T lymphocyte,CTL)的活性降低，即發(fā)生了腫瘤的免疫逃逸(腫瘤細(xì)胞通過多種機(jī)制逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊，從而得以在體內(nèi)生存和增埴的現(xiàn)象稱為免疫逃逸，immune escape)。由于腫瘤細(xì)胞分泌的免疫抑制分子可在腫瘤局部形成深度免疫抑制“黑洞”區(qū)，在此區(qū)的免疫細(xì)胞嚴(yán)重受抑，即使功能正常甚至活化的免疫細(xì)胞一旦進(jìn)入，也將成為功能受抑的“沉默”細(xì)胞，結(jié)果使免疫細(xì)胞無法對(duì)其攻擊清除，這被認(rèn)為是腫瘤逃避免疫監(jiān)視得以發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)肝癌患者出現(xiàn)的腫瘤免疫逃逸現(xiàn)象，本發(fā)明提供了一種可以抑制免疫逃逸的載體、所述載體的構(gòu)建方法、以及所述載體的應(yīng)用。本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種構(gòu)建pGM-CSF-EGFP-IRES-Rael_IL21載體的方法，步驟包括
針對(duì)GM-CSF 基因(GeneID NM_009969. 4)、Rae_l 基因(GeneID NM_175112. 5)、EGFP 基因、IL21基因(GeneID NM_021782. 2)的⑶S區(qū)序列提供PCR引物，通過PCR擴(kuò)增在上述基因的5’端和3’端均添加酶切位點(diǎn)；
PCR擴(kuò)增EGFP基因的DCs區(qū)，將EGFP的PCR產(chǎn)物進(jìn)行和pIRES載體(Cat. No. 631605)分別進(jìn)行雙酶切，然后將EGFP和pIRES酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到pEGFP-IRES質(zhì)粒；
將GM-CSF基因與pEGFP-IRES質(zhì)粒連接(pEGFP-GM_CSF_IRES)，然后分別插入Rae-I基因和IL21基因。根據(jù)本發(fā)明所述方法的ー種優(yōu)選實(shí)施例，其中，EGFP的PCR產(chǎn)物進(jìn)行和pIRES載體的雙酶切優(yōu)選為EcoRI和MluI雙酶切。在本發(fā)明所述的優(yōu)選實(shí)施例中，所設(shè)計(jì)的PCR引物能夠在GM-CSF基因的5’端添加XhoI酶切位點(diǎn)，3’端添加EcoRI酶切位點(diǎn)；在EGFP基因的5’端添加EcoRI酶切位點(diǎn)，3’端添加MluI酶切位點(diǎn)；在Rae-I基因的5’端添加Xbal酶切位點(diǎn)，3’端添加Sall酶切位點(diǎn)；在IL21基因的5’端添加Sall酶切位點(diǎn)，3’端添加Notl酶切位點(diǎn)。在本發(fā)明所述的優(yōu)選實(shí)施例中，所述PCR引物優(yōu)選為
GM-CSF基因PCR引物
SEQ ID No. I CAGATCTCGAGGCCACCATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCSEQ ID No. 2 GTCAGAATTCCCATTTTTGGCCTGGTTTTTTGEGFP基因PCR引物
SEQ ID No. 3 GTCAGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGSEQ ID No. 4 ACTTAACGCGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCRae-I基因PCR引物
SEQ ID No. 5 GTACATTCTAGAGCCACCATGAGTCTGTTTGGATCAACCTCTSEQ ID No. 6 GAATGTCGACGTATTTCTTATTCCTTGGCTTTAGCTIL-21基因PCR引物
SEQ ID No. 7 GTCAGTCGACGCCACCATGGAGAGGACCCTTGTCTGTCSEQ ID No. 8 AATTGCGGCCGCCTAGGAGAGATGCTGATGAATCATC上述引物中，下劃線部分為酶切位點(diǎn)。本發(fā)明上述的優(yōu)選實(shí)施例中，PCR擴(kuò)增EGFP基因CDS區(qū)的反應(yīng)，優(yōu)選為以PIRES2-EGFP為模板進(jìn)行擴(kuò)増。以PIRES2-EGFP為模板進(jìn)行擴(kuò)增的反應(yīng)體系優(yōu)選為
IOXBuffer5 μ I
硫酸鎂溶液(50mM)2μ I
dNTP (IOmM)I μ I
Taq HiFi (5U/y I)0. 2 μ I
上游引物(10 μ Μ)1μ I
下游引物(10 μ Μ)I μ I
PIRES2-EGFPI μ I
ddH20至總體積50 μ I
以PIRES2-EGFP為模板進(jìn)行擴(kuò)增的反應(yīng)條件優(yōu)選為94°C，3min——(94°C, 30s——56°C, 30s-68°C,45s) X35 個(gè)循環(huán)-68で，lOmin。本發(fā)明上述的優(yōu)選實(shí)施例中，所述雙酶切反應(yīng)體系優(yōu)選為
IOXBuffer R3μ I
EGFP 基因 PCR 產(chǎn)物 /pIRES I μ g 第一種限制性內(nèi)切酶O. 5μ1
第二種限制性內(nèi)切酶O. 5μ1ddH20至總體積30 μ I
根據(jù)上述引物，所述兩種內(nèi)切酶優(yōu)選為EcoRI和Mlul。其中，雙酶切反應(yīng)條件優(yōu)選為37°C，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為4 5h。本發(fā)明上述的優(yōu)選實(shí)施例中，所述pIRES與EGFP酶切產(chǎn)物連接反應(yīng)體系優(yōu)選為 10XT4連接酶緩沖液3μ1
EGFP基因PCR酶切產(chǎn)物 I μ g PIRES酶切產(chǎn)物I μ g
T4連接酶I μ I
ddH20至總體積10 μ I
本發(fā)明上述的GM-CSF基因與pEGFP-IRES質(zhì)粒連接反應(yīng)優(yōu)選為將PMD-19T-GM-CSF載體和pEGFP-IRES質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，然后進(jìn)行連接，雙酶切反應(yīng)體系優(yōu)選為IOXBuffur Tango5 μ I
PMD-19T-GM-CSF/pEGFP-IRES 2 μ I 第一種限制性內(nèi)切酶O. 5μ1
第二種限制性內(nèi)切酶O. 5μ1
ddH20至總體積30 μ I
根據(jù)上述引物，所述兩種內(nèi)切酶優(yōu)選為XhoI和EcoRI。本發(fā)明上述的方法中，Rae-I基因與IL21基因片段插入順序優(yōu)選為先將Rae-I基因片段插入。其中，Rae-I基因片段插入方法優(yōu)選為Rae-I片段與pEGFP_GM_CSF- IRES質(zhì)粒經(jīng)Xbal 和 Sall 雙酶切后連接，得到 pGM-CSF-EGFP-IRES-Rae-l。其中，IL21基因片段插入方法優(yōu)選為IL21片段與目的載體pEGFP_GM_CSF-IRES-Rael 經(jīng) Sall 和 Notl 雙酶切后連接，得到 pEGFP-GM-CSF-IRES- Rael_IL21 載體。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供ー種上述方法構(gòu)建的pEGFP-GM-CSF-IRES-Rael-IL21 載體。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供ー種上述方法構(gòu)建的pEGFP-GM-CSF-IRES-Rael-IL21載體在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供ー種上述方法構(gòu)建的pEGFP-GM-CSF-IRES-Rael-IL21載體在制備預(yù)防肝癌抗原中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種構(gòu)建重組載體的方法，所構(gòu)建的重組載體能夠促進(jìn)NK和CTL細(xì)胞活性、促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)激活、促使腫瘤細(xì)胞被NK和CTL細(xì)胞識(shí)別、并便于檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染情況，可用于制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物或疫苗。。


圖I為本發(fā)明構(gòu)建的載體結(jié)構(gòu)示意 圖2為本發(fā)明所用pIRES載體圖譜；
圖3為EGFP的PCR擴(kuò)增電泳照片；
圖4A為pEGFP-IRES重組載體菌落PCR鑒定照片；
圖4B為pEGFP-IRES重組載體酶切鑒定照片；圖5A為pGM-CSF-EGFP-IRES重組載體菌落PCR鑒定照片；
圖5B為pGM-CSF-EGFP-IRES重組載體酶切鑒定照片；
圖6A為pGM-CSF-EGFP-IRES-Rae-l重組載體菌落PCR鑒定照片；
圖6B為pGM-CSF-EGFP-IRES-Rae-l重組載體酶切鑒定照片；
圖7A為pEGFP-GM-SCF-IRES-Rael-IL21重組載體菌落PCR鑒定照片；
圖7B為pEGFP-GM-SCF-IRES-Rael-IL21重組載體酶切鑒定照片。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種構(gòu)建pEGFP-GM-SCF-IRES-Rael-IL21載體的方法，其中所述的GM-CSF基因、Rae-I基因、EGFP基因、IL21基因，以及pIRES載體均是已知的，并已經(jīng)商業(yè)化。下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述方法、載體、及其應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的介紹和描述，以使更好的理解本發(fā)明內(nèi)容，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。I、引物設(shè)計(jì)
首先針對(duì)上述基因CDS區(qū)序列設(shè)計(jì)并合成引物，以在GM-CSF基因的5’端添加XhoI酶切位點(diǎn)，3’端添加EcoRI酶切位點(diǎn)；在EGFP基因的5’端添加EcoRI酶切位點(diǎn)，3’端添加MluI酶切位點(diǎn)；在Rae-I基因的5’端添加Xbal酶切位點(diǎn)，3’端添加Sall酶切位點(diǎn)；在IL21基因的5’端添加Sall酶切位點(diǎn)，3’端添加Notl酶切位點(diǎn)。所述引物如下
GM-CSF-XhoI-F CAGATCTCGAGGCCACCATGTGGCTGCAGAATTTACTTT TCGM-CSF-EcoRI-R GTCAGAATTCCCATTTTTGGCCTGGTTTTTTGEGFP-EcoRI-F GTCAGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGEGFP-MluI-R ACTTAACGCGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCRae-I-Xbal-F GTACATTCTAGAGCCACCATGAGTCTGTTTGGATCAACCT CTRae-I-SalI-R GAATGTCGACGTATTTCTTATTCCTTGGCTTTAGCTIL21-SalI-F GTCAGTCGACGCCACCATGGAGAGGACCCTTGTCTGTCIL21-NotI-R AATTGCGGCCGCCTAGGAGAGATGCTGATGAATCATC2、PCR擴(kuò)增EGFP基因
以pIRES2-EGFP為模板，PCR擴(kuò)增EGFP基因⑶S，擴(kuò)增體系如下_
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建pGM-CSF-EGFP-IRES-Rael-IL21載體的方法，其特征在于，步驟包括 針對(duì)GM-CSF基因、Rae-1基因、EGFP基因、IL21基因的⑶S區(qū)序列提供PCR引物，通過PCR擴(kuò)增在上述基因的5’端和3’端均添加酶切位點(diǎn)； PCR擴(kuò)增EGFP基因的DCs區(qū)，將EGFP的PCR產(chǎn)物進(jìn)行和pIRES載體分別進(jìn)行雙酶切，然后將EGFP和pIRES酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到pEGFP-IRES質(zhì)粒； 將GM-CSF基因與pEGFP-IRES質(zhì)粒連接，然后分別插入Rae-I基因和IL21基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，EGFP的PCR產(chǎn)物進(jìn)行和pIRES載體的雙酶切為EcoRI和MluI雙酶切。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所設(shè)計(jì)的PCR引物能夠在GM-CSF基因的5’端添加XhoI酶切位點(diǎn)，3’端添加EcoRI酶切位點(diǎn)；在EGFP基因的5’端添加EcoRI酶切位點(diǎn)，3’端添加MluI酶切位點(diǎn)；在Rae-I基因的5’端添加Xbal酶切位點(diǎn)，3’端添加Sall 酶切位點(diǎn)；在IL21基因的5’端添加Sall酶切位點(diǎn)，3’端添加Notl酶切位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR引物為 GM-CSF基因PCR引物SEQ ID No. I CAGATCTCGAGGCCACCATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCSEQ ID No. 2 GTCAGAATTCCCATTTTTGGCCTGGTTTTTTGEGFP基因PCR引物SEQ ID No. 3 GTCAGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGSEQ ID No. 4 ACTTAACGCGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCRae-I基因PCR引物SEQ ID No. 5 GTACATTCTAGAGCCACCATGAGTCTGTTTGGATCAACCTCTSEQ ID No. 6 GAATGTCGACGTATTTCTTATTCCTTGGCTTTAGCTIL-21基因PCR引物SEQ ID No. 7 GTCAGTCGACGCCACCATGGAGAGGACCCTTGTCTGTCSEQ ID No. 8 :AATTGCGGCCGCCTAGGAGAGATGCTGATGAATCATC。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增EGFP基因CDS區(qū)的反應(yīng)，以PIRES2-EGFP為模板進(jìn)行擴(kuò)増。
6.一種權(quán)利要求I所述方法構(gòu)建的pEGFP-GM-CSF-IRES- Rael_IL21載體。
7.—種權(quán)利要求6所述載體在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
8.—種權(quán)利要求6所述載體在制備預(yù)防肝癌抗原中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明構(gòu)建了一種pGM-CSF-EGFP-IRES-Rae1-IL21載體，其中，GM-CSF和IL-21基因的功能是促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活，尤其是NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞的激活；Rae-1基因轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞后，主要促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)NKG2D配體(即Rae-1)，促使腫瘤細(xì)胞被機(jī)體免疫系統(tǒng)尤其是NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞的識(shí)別；綠色蛋白(EGFP)基因主要便于監(jiān)測(cè)基因在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染情況，可在熒光顯微鏡下觀察各組織的基因轉(zhuǎn)染情況。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102660567SQ201210175428
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者程明榮 申請(qǐng)人:程明榮