一種靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體的制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于脂質(zhì)體的制備及應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開(kāi)了一種靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體的原料組成包括基本膜材磷脂、延長(zhǎng)脂質(zhì)體藥物血液半衰期的聚乙二醇修飾的磷脂、可進(jìn)行熒光成像的磷脂、具靶向作用的磷脂、治療腫瘤的脂溶性藥物和水溶性藥物、可增強(qiáng)核磁成像信號(hào)的造影劑。上述藥物通過(guò)脂質(zhì)體的包裹很好地解決了水溶性差的藥物的臨床使用缺陷，且與水溶性藥物組合后改變了傳統(tǒng)化療藥物的給藥方式，靶向作用于腫瘤組織，有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)減少副反應(yīng)的產(chǎn)生；另外通過(guò)MRI可實(shí)時(shí)觀測(cè)藥物作用效果及腫瘤變化情況，具極大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體的制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及脂質(zhì)體的制備及應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體涉及一種靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體的制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]由磷脂組成的脂質(zhì)體與生物體細(xì)胞膜組成和結(jié)構(gòu)相似，具有良好的生物相容性。脂質(zhì)體包含一個(gè)磷脂雙分子層和一個(gè)親水核區(qū)，可攜帶水溶性及脂溶性物質(zhì)，改善很多藥物應(yīng)用時(shí)的不足。作為藥物載體，脂質(zhì)體已被成功應(yīng)用于各類(lèi)藥物的攜載。包括多柔比星、組織蛋白酶抑制劑、伊立替康、長(zhǎng)春瑞賓和歐苷菊、雙氯酚酸鈉等。
[0003]鉑類(lèi)藥物，包括順鉑、卡鉑、奧沙利鉑等，可與DNA結(jié)合并阻礙DNA復(fù)制及RNA翻譯，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。常被用于各種癌癥治療。但鉑類(lèi)藥物可引起很多副反應(yīng)，如骨髓抑制，腎毒性等。
[0004]紫杉醇和多西紫杉醇是一類(lèi)應(yīng)用廣泛的抗癌藥物。它們可以穩(wěn)定細(xì)胞微管，抑制細(xì)胞有絲分裂，從而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)。它們水溶性差，在使用時(shí)，往往要將其溶于氫化蓖麻油和甲醇。該制劑可引起很多副反應(yīng)，比如過(guò)敏反應(yīng)，腎毒性和神經(jīng)毒性等。
[0005]臨床常聯(lián)合使用紫杉醇類(lèi)和鉑類(lèi)藥物治療非小細(xì)胞肺癌，由于其制劑本身無(wú)靶向性，且需較大劑量依次進(jìn)行靜脈注射，同時(shí)會(huì)引起很多副反應(yīng)。因此發(fā)展一種低劑量且有效的雙載藥體系具有極大應(yīng)用價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是改善紫杉醇及鉑類(lèi)藥物應(yīng)用時(shí)的缺陷，改變其體內(nèi)代謝途徑，提供一種對(duì)腫瘤療效好、副作用小、同時(shí)還可對(duì)腫瘤發(fā)展進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0008]一種靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體，由以下原料制備而成:
[0009]基本膜材磷脂、PEG修飾磷脂、靶向磷脂、脂溶性藥物和水溶性藥物；
[0010]所述原料中，基本膜材磷脂:PEG修飾磷脂:革El向磷脂摩爾比=9:1:0.5 ；
[0011]所述原料中，基本膜材磷脂:脂溶性藥物摩爾比=(30-33):1。
[0012]所述原料中，基本膜材磷脂:水溶性藥物摩爾比=2:1。
[0013]所述原料中，基本膜材磷脂為卵磷脂、氫化卵磷脂或人工合成卵磷脂中的一種或兩種以上的任意比例混合物，其中，人工合成卵磷脂為二硬脂酰磷脂酰膽堿和二硬脂磷脂酰甘油組合磷脂；
[0014]優(yōu)選的，所述基本膜材為為二硬脂酰磷脂酰膽堿和二硬脂磷脂酰甘油組合磷脂，兩者摩爾比為二硬脂酰磷脂酰膽堿:二硬脂酰磷脂酰甘油=7:2。
[0015]所述原料中，PEG修飾磷脂為甲氧基聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
[0016]所述原料中，靶向磷脂是含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽修飾的磷脂或是其他具靶向作用基團(tuán)修飾的磷脂。
[0017]所述原料中，脂溶性藥物為紫杉醇或多西紫杉醇。
[0018]所述原料中，水溶性藥物為順鉑、卡鉑或奈達(dá)鉑。
[0019]優(yōu)選的，所述脂溶性藥物為紫杉醇，所述水溶性藥物為卡鉑。
[0020]進(jìn)一步，所述原料中還可包括熒光基團(tuán)修飾磷脂和/或水溶性造影劑。
[0021]當(dāng)原料中含有焚光基團(tuán)修飾憐脂時(shí)，基本I旲材憐脂:PEG修飾憐脂:革El向憐脂:焚光基團(tuán)修飾磷脂摩爾比=9:1:0.5:0.2。
[0022]當(dāng)原料中含有水溶性造影劑時(shí)，基本膜材磷脂:水溶性造影劑=I:5000o
[0023]所述熒光基團(tuán)修飾磷脂為諾丹明-雙肉豆蔻磷脂酰乙醇胺(Rhod-DMPE)或其他熒光基團(tuán)修飾磷脂。
[0024]所述水溶性造影劑是1\或T 2造影劑。其中，T i造影劑為釓特酸葡胺(Gd-DOTA)、釓噴酸葡胺(Gd-DTPA)、釓雙胺(Gd-DTPA-BMA) ;T2造影劑為氧化鐵納米粒子。
[0025]—種所述革E向多功能雙載藥脂質(zhì)體的制備方法，其步驟如下:
[0026](I)將基本膜材磷脂、PEG修飾磷脂、靶向磷脂、熒光基團(tuán)修飾磷脂(原料中不含則不加)及脂溶性藥物溶于有機(jī)溶劑中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空干燥成脂質(zhì)膜。
[0027]所述有機(jī)溶劑選自氯仿或氯仿、甲醇、水的混合溶液，所述基本膜材磷脂與有機(jī)溶劑的質(zhì)量體積比為(10-20)mg:lmL。
[0028](2)將水溶性藥物及水溶性造影劑(原料中不含則不加)溶液加入到步驟(I)所得脂質(zhì)膜中，75-850C下超聲10分鐘，然后用孔徑為0.22 μ m水系濾膜擠制10次，得到粒徑130nm左右的大單室雙載藥脂質(zhì)體溶液。
[0029]所述水溶性藥物溶液為將水溶性藥物按照質(zhì)量體積比(l-lO)mg:lmL溶于水中而得；水溶性造影劑溶液為將水溶性造影劑按照質(zhì)量體積比(20-50)mg:lmL溶于水中而得。
[0030](3)將步驟(2)所得溶液在2000rpm下離心10分鐘除去未包裹的脂溶性藥物，然后用截留分子量為1KD的透析袋透析該脂質(zhì)體溶液4小時(shí)除去未包裹的水溶性藥物并置換脂質(zhì)體外液。
[0031]所述透析過(guò)程中所用透析液為生理鹽水、葡萄糖溶液或蔗糖溶液，其中，葡萄糖溶液濃度為Iwt % -9wt %，蔗糖溶液濃度為Iwt % -9wt %。
[0032](4)將步驟(3)所得透析袋內(nèi)液體冷凍干燥24-48小時(shí)，得到靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體粉末。所得產(chǎn)品在使用時(shí)，直接將其溶于去離子水。
[0033]本發(fā)明的其他一些特點(diǎn)是，水溶性藥物除了卡鉑外，還可以是其他一些水溶性藥物，包括順鉑，奈達(dá)鉑等；脂溶性藥物除了紫杉醇外，也可以是多西紫杉醇等。脂溶性及水溶性藥物的組合特點(diǎn)是沒(méi)有嚴(yán)重配伍禁忌，可共同作用于某種腫瘤的治療，且治療效果優(yōu)于單一藥物的使用效果；或是臨床常用組合。
[0034]本發(fā)明中，由于使用了甲氧基聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，可避免體內(nèi)免疫系統(tǒng)對(duì)脂質(zhì)體的清除作用，延長(zhǎng)藥物體內(nèi)作用時(shí)間。加之納米制劑本身具有的實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(EPR效應(yīng))，可進(jìn)一步增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤組織的作用效果，進(jìn)而可減少藥物使用劑量，減少副作用，提高藥效。
[0035]本發(fā)明中，靶向磷脂的使用可使脂質(zhì)體在體內(nèi)靶向作用于腫瘤組織。主要作用機(jī)制為靶向基團(tuán)可與腫瘤細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的相應(yīng)受體特異性識(shí)別，并通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用使脂質(zhì)體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，進(jìn)一步釋放藥物和造影劑，從而達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞和同時(shí)進(jìn)行核磁成像的目的。
[0036]本發(fā)明提供的由上述方法制得的靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體不僅適合于非小細(xì)胞肺癌的診斷和治療，也適合于其他固體腫瘤的診斷治療及其診斷治療試劑的設(shè)計(jì)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037]附圖是用來(lái)對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，與下面的【具體實(shí)施方式】共同用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。附圖中:
[0038]圖1是測(cè)試?yán)齀所得靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體的透射電鏡圖，其中標(biāo)尺為200nm;
[0039]圖2是測(cè)試?yán)齀中靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體的粒徑分析結(jié)果圖；
[0040]圖3是測(cè)試?yán)?中靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體處理A549、H1299和W1-38細(xì)胞后的激光共聚焦顯微鏡熒光圖；
[0041]圖4是測(cè)試?yán)?中靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體處理A549細(xì)胞后的結(jié)果；
[0042]圖5是測(cè)試?yán)?中靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體處理H1299細(xì)胞后的結(jié)果；
[0043]圖6是測(cè)試?yán)?中靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體處理W1-38細(xì)胞后的結(jié)果；
[0044]圖7是測(cè)試?yán)?中靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體及生理鹽水分別處理3只肺腺癌移植裸鼠后，其中靶向組和生理鹽水組各一只肺腺癌移植裸鼠腫瘤T1加權(quán)成像變化結(jié)果；
[0045]圖8是測(cè)試?yán)?中靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體及生理鹽水處理肺腺癌移植裸鼠后腫瘤變化結(jié)果，其中靶向組和生理鹽水組分別包括3只腫瘤裸鼠。

【具體實(shí)施方式】
[0046]為了更清楚地闡述本發(fā)明，以下 申請(qǐng)人:將依照本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0047]在本發(fā)明技術(shù)方案的【具體實(shí)施方式】中，所采用的主要試劑及材料介紹如下:
[0048]二硬脂酰磷脂酰膽喊 1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(鈉鹽)1，2-di stearoy l-sn-glycero-3-phosphoglycero I sodiumsalt (DSPG, Na)和甲氧基聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺N-(Carbony 1-methoxypolyethyleneglycol-2000)-1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho ethanolamine, sodiumsalt(MPEG-2000-DSPE)均購(gòu)自 Corden Pharma,貨號(hào)分別為 LP-R4-076、LP-R4-017 和LP-R4-039，CAS 號(hào)分別為 816-94-4、124011-52-5 和 147867-65-0。
[0049]羧基-聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺N-(carboxy_polyethyleneglycol-2000)-1,2-di stearoy1-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, ammoniumsalt (C00H-PEG2000-DSPE)購(gòu)自 NANOCS，貨號(hào)為 PG2_CADS_2k。
[0050]諾丹明-雙肉豆蔻磷脂酰乙醇胺1，2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (lissamine rhodamine B sulfonyI，ammonium salt (Rhod-DMPE)購(gòu)自 AvantiPolar lipids，貨號(hào)為 810157P，CAS 號(hào)為 474942-83-1。
[0051]環(huán)肽c(RGDyK)購(gòu)自吉爾生化有限公司，商品號(hào)為RK_5。
[0052]所用靶向磷脂R⑶環(huán)肽-聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(c (RGDyK) -PEG2000-DSPE)按照如下方法合成:靶向磷脂RGD環(huán)肽-聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
[0053]將羧基-聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(C00H-PEG2000-DSPE)溶于水中，加入碳二亞胺(EDC)和羥基琥珀酰亞胺脂(NHS)，EDC、NHS和C00H-PEG2000-DSPE摩爾比為10:10:1，室溫反應(yīng)30分鐘。然后加入與C00H-PEG2000-DSPE等摩爾量的環(huán)肽c (RGDyK)，室溫反應(yīng)10小時(shí)。用截留分子量為2000的透析袋在水中透析24小時(shí)除去未反應(yīng)的環(huán)肽及其他物質(zhì)。將透析袋內(nèi)液體冷凍干燥24小時(shí)即得靶向磷脂。
[0054]所用水均為去離子水，其他原料均為常規(guī)試劑。
[0055]非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、H1299和正常肺纖維細(xì)胞W1-38均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。
[0056]實(shí)施例1:靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體的制備(RGD-CPGd-L)
[0057]原料組分包括:基本膜材磷脂(二硬脂酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰甘油)，PEG修飾磷脂MPEG-2000-DSPE，靶向磷脂RGD環(huán)肽-聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，紫杉醇，卡鉑，釓雙胺。
[0058]各組分的摩爾比例如下:
[0059]二硬脂酰磷脂酰膽堿:二硬脂酰磷脂酰甘油:MPEG-2000-DSPE:RGD環(huán)肽-聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺=7:2:1:0.5ο
[0060]基本膜材磷脂:紫杉醇=30:1。
[0061 ] 基本膜材磷脂:卡鉬=2:1。
[0062]基本膜材磷脂:釓雙胺=1:5000。
[0063]所述基本膜材磷脂的摩爾量指二硬脂酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰甘油摩爾量之和。
[0064]制法:將15mg基本膜材磷脂(由二硬脂酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰甘油以摩爾比7:2組成的混合物)、各種磷脂衍生物(PEG修飾磷脂和靶向磷脂)及紫杉醇加入到ImL氯仿/甲醇/水(氯仿、甲醇和水以體積比1:1:0.3混合而得)中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空干燥成脂質(zhì)膜。將10mM釓雙胺溶液和0.0lmM卡鉑溶液(原料配方中的釓雙胺和卡鉑事先用水分別溶解成溶液待用)加入到脂質(zhì)膜中，用超聲水化10分鐘，溫度為80°C。用孔徑為0.22 μ m水系濾膜擠制10次。2000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘除去未包裹的紫杉醇。用lwt%葡萄糖透析(10KD)4h除去未反應(yīng)的雜質(zhì)并交換脂質(zhì)體外部介質(zhì)。將透析袋內(nèi)液體冷凍干燥24小時(shí)后于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0065]重新溶解后得到粒徑約為128nm的雙載藥脂質(zhì)體藥物溶液。
[0066]實(shí)施例2:
[0067]參照實(shí)施例1的方法制備熒光靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體(Rh-RGD-CPGd-L)，與實(shí)施例I不同的是，原料中加入了諾丹明-雙肉豆蔻磷脂酰乙醇胺(Rhod-DMPE)，該成分與其他磷脂摩爾比為:二硬脂酰磷脂酰膽堿:二硬脂酰磷脂酰甘油:MPEG-2000-DSPE:R⑶環(huán)肽-聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺:Rhod-DMPE = 7:2:1:0.5:0.2?制備過(guò)程中，Rhod-DMPE, PEG修飾磷脂和靶向磷脂一并加入。
[0068]對(duì)比例1:
[0069]參照實(shí)施例1的方法制備雙載藥脂質(zhì)體(CPGd-L)，不同之處僅在于:不加入靶向磷脂RGD環(huán)肽-聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
[0070]對(duì)比例2:
[0071]參照實(shí)施例1的方法制備單載藥脂質(zhì)體(CGd-L)，不同之處僅在于:不加入靶向磷脂RGD環(huán)肽-聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和紫杉醇。
[0072]對(duì)比例3:
[0073]參照實(shí)施例1的方法制備單載藥脂質(zhì)體(PGd-L)，不同之處僅在于:不加入靶向磷脂RGD環(huán)肽-聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和卡鉑。
[0074]對(duì)比例4:
[0075]參照實(shí)施例1的方法制備空白脂質(zhì)體(Blank-L)，不同之處僅在于:不加入靶向磷脂RGD環(huán)肽-聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、兩種藥物和釓雙胺。
[0076]對(duì)比例5:
[0077]參照實(shí)施例1的方法制備靶向含釓脂質(zhì)體(RGD-Gd-L)，不同之處僅在于:不加入兩種藥物。
[0078]測(cè)試?yán)?:
[0079]用透射電鏡(型號(hào)為JEM2010)對(duì)實(shí)施例1制備的RGD-CPGd-L進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，由圖1可以看出該靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體形成了較為圓整均勻的顆粒。
[0080]用納米粒度儀(型號(hào)為Zetasizer Nano ZS)對(duì)實(shí)施例1制備的RGD-CPGd-L水溶液粒徑進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，由圖2可以看出，該靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體粒徑為約為 128nm。
[0081]測(cè)試?yán)?:
[0082]本測(cè)試?yán)眉す夤簿劢癸@微鏡(型號(hào)為A1R/A1)檢測(cè)本發(fā)明靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體靶向作用于腫瘤細(xì)胞情況。
[0083]將蓋玻片置于六孔板中，加入A549、H1299和W1-38細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37°C,5% C02。A549和H1299使用MEM培養(yǎng)基；WI_38使用MEM培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中均加入10%牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素。細(xì)胞覆蓋率達(dá)到30-40%時(shí)，每孔加入2ml0.lmg/ml熒光靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體(實(shí)施例2制備的Rh-RGD-CPGd-L)。孵育4小時(shí)后除去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定10分鐘，PBS清洗5次。取出蓋玻片置于載玻片上，進(jìn)行熒光成像。
[0084]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，由圖3可以看出，A549和H1299紅色熒光強(qiáng)度明顯高于WI_38(更真實(shí)的結(jié)果請(qǐng)見(jiàn) 申請(qǐng)人:隨本申請(qǐng)一并提交的實(shí)質(zhì)審查參考資料)，說(shuō)明該靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體可靶向作用于腫瘤細(xì)胞A549和H1299，對(duì)正常細(xì)胞W1-38作用較小。
[0085]測(cè)試?yán)?:
[0086]本測(cè)試?yán)妹笜?biāo)儀(型號(hào)為spectra MAX 190)在細(xì)胞水平上檢測(cè)本發(fā)明靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體的活性。
[0087]在96孔板中接種A549、H1299和W1-38細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后分別加入200 μ I濃度為l、3、6、9、12mg/ml脂質(zhì)體，總有五種脂質(zhì)體，分別是靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體(實(shí)施例1制備的RGD-CPGd-L);雙載藥脂質(zhì)體(對(duì)比例I制備的CPGd-L);單載藥脂質(zhì)體(對(duì)比例2制備的CGd-L);單載藥脂質(zhì)體(對(duì)比例3制備的PGd-L)和空白脂質(zhì)體(對(duì)比例4制備的Blank-L)。加藥48小時(shí)后除去脂質(zhì)體溶液，加入終濃度為0.5mg/ml的MTT溶液，4小時(shí)后除去反應(yīng)液，加入200 μ I DMSO,檢測(cè)各組細(xì)胞OD值。
[0088]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4-6所示(每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn))。由圖4-6可以看出，該靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體對(duì)腫瘤細(xì)胞A549(圖4)和H1299(圖5)作用效果顯著，且明顯高于其他各組脂質(zhì)體；對(duì)正常細(xì)胞W1-38作用較小(圖6)?？瞻字|(zhì)體對(duì)各組細(xì)胞活力影響均較小。說(shuō)明本發(fā)明靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體對(duì)腫瘤細(xì)胞具靶向作用，且對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯殺傷作用，毒性作用效果與濃度呈明顯依賴(lài)性；對(duì)正常細(xì)胞影響較小。
[0089]測(cè)試?yán)?:
[0090]本測(cè)試?yán)?T核磁成像儀(型號(hào)為B1Spec 70/20USR)在動(dòng)物水平上檢測(cè)本發(fā)明靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體對(duì)肺腺癌A549移植腫瘤的抑制作用。裸鼠購(gòu)自武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。
[0091]鼠齡5-6周BALB/c雄性裸鼠(20g)大腿皮下種植A549細(xì)胞，飼養(yǎng)I周后進(jìn)行核磁檢測(cè)及藥物治療實(shí)驗(yàn)。腫瘤裸鼠俯臥位固定，先用3%異氟烷麻醉，后用1%異氟烷麻醉，并通過(guò)氣體控制器給裸鼠提供氧氣。用一個(gè)氣動(dòng)墊檢測(cè)裸鼠呼吸頻率。實(shí)驗(yàn)裸鼠分為兩組，包括實(shí)施例1制備的靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體給藥組和生理鹽水對(duì)照組。尾靜脈注射，給藥劑量為500mg/kg。對(duì)照組使用相同體積生理鹽水。對(duì)照組進(jìn)行成像時(shí)，需注射同等劑量靶向含釓脂質(zhì)體(對(duì)比例5制備RGD-Gd-L)。在給藥前和給藥后進(jìn)行核磁T1加權(quán)成像檢測(cè)。T1加權(quán)成像使用自旋回波序列，回波時(shí)間為11ms，重復(fù)時(shí)間為400ms，層厚為1mm，加速因子為I，矩陣為256 X 256，視野為4X 4cm2，平均次數(shù)為4。使用ParaVis1n 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在第0、2、4、7、10、14和16天給裸鼠注射脂質(zhì)體或生理鹽水。在第O和第23天進(jìn)行核磁成像。三周經(jīng)核磁成像檢測(cè)后取出腫瘤照相。
[0092]結(jié)果如圖7和8所示(每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn))。由圖7可以看出，與對(duì)照組相比，本發(fā)明的靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體可顯著抑制肺腺癌的生長(zhǎng)；且可明顯增強(qiáng)腫瘤部位的!\加權(quán)成像信號(hào)。由圖8可看出給藥組可明顯抑制肺腺癌的生長(zhǎng)。
[0093]本發(fā)明的雙載藥脂質(zhì)體制劑可通過(guò)脂質(zhì)體包裹解決水溶性差的藥物的臨床使用缺陷，且與水溶性藥物組合改變傳統(tǒng)化療藥物給藥方式，增強(qiáng)藥物作用效果，可有效抑制腫瘤生長(zhǎng)；另可通過(guò)核磁對(duì)腫瘤發(fā)展進(jìn)行無(wú)創(chuàng)實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)。該發(fā)明制備過(guò)程簡(jiǎn)單，還可應(yīng)于其他組合藥物及功能物質(zhì)的攜載及其他類(lèi)型腫瘤的診斷治療，具極大應(yīng)用前景。
[0094]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種革G向多功能雙載藥脂質(zhì)體，由以下原料制備而成: 基本膜材磷脂、PEG修飾磷脂、靶向磷脂、脂溶性藥物和水溶性藥物； 所述原料中，基本膜材磷脂:PEG修飾磷脂:革El向磷脂摩爾比=9:1:0.5 ; 所述原料中，基本膜材磷脂:脂溶性藥物摩爾比=(30-33):1 ; 所述原料中，基本膜材磷脂:水溶性藥物摩爾比=2:1 ; 所述原料中，基本膜材磷脂為卵磷脂、氫化卵磷脂或人工合成卵磷脂中的一種或兩種以上的任意比例混合物； 所述原料中，PEG修飾磷脂為甲氧基聚乙二醇2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺； 所述原料中，靶向磷脂是含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽修飾的磷脂或是其他具靶向作用基團(tuán)修飾的磷脂； 所述原料中，脂溶性藥物為紫杉醇或多西紫杉醇； 所述原料中，水溶性藥物為順鉑、卡鉑或奈達(dá)鉑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體，其特征在于:所述基本膜材為人工合成卵磷脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體，其特征在于:所述人工合成卵磷脂為二硬脂酰磷脂酰膽堿和二硬脂磷脂酰甘油組合磷脂，兩者摩爾比為二硬脂酰磷脂酰膽堿:二硬脂酰磷脂酰甘油=7:2。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體，其特征在于:所述脂溶性藥物為紫杉醇，所述水溶性藥物為卡鉑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體，其特征在于:所述原料中還包括熒光基團(tuán)修飾磷脂和/或水溶性造影劑； 當(dāng)原料中包括熒光基團(tuán)修飾磷脂時(shí)，基本膜材磷脂:PEG修飾磷脂:靶向磷脂:熒光基團(tuán)修飾磷脂摩爾比=9:1:0.5:0.2 ； 當(dāng)原料中包括水溶性造影劑時(shí)，基本膜材磷脂:水溶性造影劑摩爾比=1:5000 ; 所述熒光基團(tuán)修飾磷脂為諾丹明-雙肉豆蔻磷脂酰乙醇胺或其他熒光基團(tuán)修飾磷脂； 所述水溶性造影劑是1\或T2造影劑，其中，T i造影劑為釓特酸葡胺、釓噴酸葡胺、釓雙胺；T2造影劑為氧化鐵納米粒子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體，其特征在于:所述熒光基團(tuán)修飾磷脂為諾丹明-雙肉豆蔻磷脂酰乙醇胺；所述水溶性造影劑是釓雙胺。
7.—種權(quán)利要求1-6中任一所述的革El向多功能雙載藥脂質(zhì)體的制備方法，其步驟如下: (1)將基本膜材磷脂、PEG修飾磷脂、靶向磷脂及脂溶性藥物溶于有機(jī)溶劑中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空干燥成脂質(zhì)膜； 所述有機(jī)溶劑選自氯仿或氯仿、甲醇、水的混合溶液； (2)將水溶性藥物溶液加入到步驟(I)所得脂質(zhì)膜中，75-85?下超聲10分鐘，然后用孔徑為0.22 μ m水系濾膜擠制10次； 所述水溶性藥物溶液為將水溶性藥物按照質(zhì)量體積比(1-10) mg:lmL溶于水中而得； (3)將步驟(2)所得溶液在2000rpm下離心10分鐘除去未包裹的脂溶性藥物，然后將所得脂質(zhì)體溶液用截留分子量為1KD的透析袋透析4小時(shí)； 所述透析過(guò)程中所用透析液為生理鹽水、葡萄糖溶液或蔗糖溶液，其中，葡萄糖溶液濃度為lwt%-9wt%，鹿糖溶液濃度為lwt%-9wt% ； (4 )將步驟(3 )所得透析袋內(nèi)液體冷凍干燥24-48小時(shí)，得到靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體粉末； 當(dāng)所述原料中包括熒光基團(tuán)修飾磷脂時(shí)，所述熒光基團(tuán)修飾磷脂在步驟(I)中隨基本膜材磷脂、PEG修飾磷脂、靶向磷脂及脂溶性藥物一起溶于有機(jī)溶劑中； 當(dāng)所述原料中包括水溶性造影劑時(shí)，在步驟(2)中將所述水溶性造影劑先處理成水溶性造影劑溶液，隨水溶性藥物溶液一起加入到步驟(I)所得脂質(zhì)膜中，水溶性造影劑溶液為將水溶性造影劑按照質(zhì)量體積比(20-50) mg:lmL溶于水中而得。
8.權(quán)利要求1-6中任一所述的靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體在制備治療或預(yù)防非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述制備方法制得的靶向多功能雙載藥脂質(zhì)體在制備治療或預(yù)防非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K49/00GK104490786SQ201510021568
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2015年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月16日
【發(fā)明者】周欣, 任莉莉, 陳世楨, 孫獻(xiàn)平, 劉買(mǎi)利 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所