專利名稱：一種楤白皮總皂苷及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物藥用活性成分技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種惚白皮總皂苷及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
從天然動、植物中尋找低毒、高效的抗癌活性成分是新藥研究的重要途徑。秦巴山區(qū)是我國天然藥物資源最為豐富的區(qū)域之一，其中一些從秦巴地區(qū)太白山某些中草藥提取的有效成分已被《美國藥典》錄入或用于臨床腫瘤的治療之中，因此近年來太白山傳統(tǒng)中草藥成為新藥研究的重點領(lǐng)域
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的問題在于從太白山中草藥中的ー種自五加科植物惚木的根皮(亦稱飛天蜈蚣七)中提取藥用活性成分，提供一種惚白皮總皂苷及其制備方法，所提取的總皂苷具有抗腫瘤活性。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種惚白皮總皂苷，是從惚木的根皮當中提取得到的，其提取為惚木的根皮經(jīng)こ醇-水溶液浸潰后加熱回流提取，提取液上樣于大孔吸附樹脂，用水洗脫至流出液無色后再用こ醇-水溶液梯度洗脫，收集洗脫餾分后回收こ醇，然后用こ酸こ酯萃取，將こ酸こ酯萃取液干燥后得到惚白皮總皂苷?！N惚白皮總皂苷的制劑，以惚白皮總皂苷為藥用成分，將其制備成的固體或液體形式的制劑。所述的固體形式為片劑、顆粒劑、膠囊劑，液體形式為溶液、糖漿劑，所述的惚白皮總皂苷對腫瘤細胞抑制的應(yīng)用。所述的惚白皮總皂苷用于抗腫瘤藥物的制備的應(yīng)用。一種惚白皮總皂苷的制備方法，包括以下步驟I)將惚木的根皮經(jīng)沖洗、干燥后粉碎，然后加入こ醇-水溶液浸潰8 12h，浸潰后加熱回流提取I 5h，回流提取完成后收集提取液，減壓回收こ醇，濃縮得到濃縮液；2)濃縮液加水后攪拌均勻，靜止12 24h后抽濾；將濾液上大孔吸附樹脂，先用水洗脫至流出液無色，然后再用こ醇-水溶液按照體積濃度30 80%進行梯度洗脫；收集こ醇梯度大于50%洗脫的洗脫液，并回收洗脫液中的こ醇，濃縮得到二次濃縮液；3)將二次濃縮液噴霧干燥或真空干燥后得到藥物干燥粉；4)將藥物干燥粉加水溶解均勻后加入こ酸こ酯萃取，萃取多次后合并こ酸こ酯萃取液，減壓濃縮得到三次濃縮液，三次濃縮液真空干燥后得到惚白皮總皂苷。所述的こ醇-水溶液中こ醇的體積濃度為30 85%，其余為水。所述的濃縮液或二次濃縮液的相對密度為I. 06 I. 10，三次濃縮液的相對密度為 0. 90 0. 95。
所述的大孔吸附樹脂為D-101、HPD722、AB-8或DS401樹脂柱。所述的梯度洗脫的流速為0. 5 2ml/min,時間為2 24h。所述的噴霧干燥時采用熱風干燥，進風溫度為160 180°C，出風溫度為70 IOO0C，霧化器轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/秒至200轉(zhuǎn)/秒；真空干燥時，真空度為0. 09 0. 15Mpa，溫度為50 80°C干燥20 40小h。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供的惚白皮總皂苷，是以惚木的根皮(飛天蜈蚣七)作為原料，通過回流 提取、樹脂分離純化、こ酸こ酯萃取得到的具有藥用活性的總皂苷。該總皂苷能夠作為藥用成分通過制劑得到中成藥，方便使用，提高藥用的安全性。本發(fā)明提供的惚白皮總皂苷對腫瘤細胞具有明顯的抑制作用惚白皮總皂苷進行了抗腫瘤提取物對體外培養(yǎng)的H22肝癌細胞、FBL3白血病細胞和B16黑色素瘤細胞均具有明顯的抑制作用，惚白皮總皂苷體外對FBL3和B16細胞的作用IC5tl分別為0. 199g じ1和0. 0774g じ1 ;在上述濃度下，對H22細胞的抑制率均超過80%，能夠應(yīng)用于抗腫瘤藥物的制備。本發(fā)明提供的惚白皮總皂苷具有較高的安全性惚木皂苷一次性灌胃給藥的LD50 為 3265mg/kg, LD50 的 95%可信限為 2931 3639mg/kg。


圖I為分光光度法的檢測惚白皮總皂苷濃度和吸光度關(guān)系曲線；圖2為惚白皮總皂苷不同時間點對FBL3細胞的抑制作用；圖3為惚白皮總皂苷對H22、B16和FBL3腫瘤細胞的抑制作用。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種惚白皮總皂苷及其制備方法和應(yīng)用，從傳統(tǒng)太白山中草藥飛天蜈蚣七中提取具有藥用效果的總皂苷。下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進ー步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。傳統(tǒng)太白山中草藥飛天蜈蚣七是采用采挖的根皮切成厚片或小節(jié)，干燥而成，具有活血止痛、祛瘀除痹等作用。利用飛天蜈蚣七提取惚白皮總皂苷的制備方法如下惚木的根皮經(jīng)こ醇-水溶液浸潰后加熱回流提取，提取液上樣于大孔吸附樹脂，用水洗脫至流出液無色后再用こ醇-水溶液梯度洗脫，收集洗脫餾分后回收こ醇，然后用こ酸こ酯萃取，將こ酸こ酯萃取液干燥后得到惚白皮總皂苷。下面通過具體的實施例對惚白皮總皂苷的制備方法進行說明。實施例I惚白皮總皂苷的制備方法，包括以下步驟取選好的飛天蜈蚣七1000克分別經(jīng)過沖洗、干燥后粉碎成粗粉，加入到こ醇-水體系中先浸潰，浸潰后回流；其中こ醇-水體系中こ醇濃度為30%，其余為水，浸潰時間8小吋，回流提取溫度為80°C，共提取兩次(第一次提取完成后收取提取液，然后再加入與第一次提取相同的こ醇-水溶液在相同條件下提取)，每次2小時，こ醇-水體系用量為8000ml，即こ醇-水體系飛天蜈蚣七=lg/8ml ;提取完成后，合并提取液，減壓回收こ醇，濃縮至相對密度I. 06至I. 10 (60°C測)，得到濃縮液2000ml ；加濃縮液量一半量水1000ml，攪拌均勻，靜止24小時，抽濾；濾液上D-101樹脂柱，先用水洗脫至無色，洗脫液棄去，再用こ醇溶液梯度洗脫，洗脫梯度為50% 80% (體積濃度計)，洗脫的流速為0. 5ml/min,時間為4小吋，50%こ醇洗脫液棄去，合并60%、70%、80%梯度洗脫液；合并洗脫液回收こ醇，濃縮至相對密度I. 06-1. 10 (60°C測)；噴霧干燥或真空干燥采用噴霧干燥則進風溫度為160_180°C,出風溫度為70-1000C，霧化器轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/秒至200轉(zhuǎn)/秒；若采用真空干燥，則真空度為0. 09Mpa,溫度為60°C干燥20-40小時；得藥物干燥粉170克；取藥物干燥粉，加水適量溶解均勻后加こ酸こ酯一半量900ml萃取，萃取三次(毎次加入量為900ml)，合并こ酸こ酯萃取液，進行減壓濃縮，濃縮溫度為50°C，真空度為0. 09Mpa,濃縮至溶液相對密度0. 90-0. 95 (50°C測)，濃縮液進行真空干燥真空度為 0. 09Mpa，溫度為60°C干燥10-20小時；即得中草藥提取物惚白皮總皂苷80克。惚白皮總皂苷抗腫瘤疾病方面有效成分為皂苷類，含齊墩果酸和糖生成的皂甙。用紫外分光光度法以齊墩果酸-3-0-0- D -吡喃葡萄糖醛酸苷為對照，分光光度檢測結(jié)果如圖I所示，可以根據(jù)圖中所示曲線進行計算，或者重新測定標準曲線(檢測波長為238nm);提取物中測定惚白皮總皂苷以齊墩果酸-3-0-0- D -吡喃葡萄糖醛酸苷計不得少于30%。實施例2惚白皮總皂苷的制備方法，包括以下步驟取選好的飛天蜈蚣七1000克分別經(jīng)過沖洗、干燥后粉碎成粗粉，加入到こ醇-水體系中先浸潰，浸潰后回流；其中こ醇-水體系中こ醇濃度為50%，其余為水，浸潰時間10小吋，回流提取溫度為85°C，共提取兩次，每次I. 5小吋，こ醇-水體系用量為6000ml，即こ醇-水體系飛天蜈蚣七=lg/6ml ;提取完成后，合并提取液，減壓回收こ醇，濃縮至相對密度I. 06至I. 10 (60°C測)，得到濃縮液2000ml ；加濃縮液量一半量水1000ml，攪拌均勻，靜止24小吋，抽濾；濾液上HPD722樹脂柱，先用水洗脫至無色，洗脫液棄去，再用こ醇溶液梯度洗脫，洗脫梯度為30% 70% (體積濃度計)，洗脫的流速為lml/min，時間為8小吋)，50%こ醇洗脫液棄去，合并60%、70%梯度洗脫液；合并洗脫液回收こ醇，濃縮至相對密度I. 06-1. 10 (60°C測)；噴霧干燥或真空干燥采用噴霧干燥則進風溫度為170_175°C,出風溫度為80-90°C，霧化器轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/秒至120轉(zhuǎn)/秒；若采用真空干燥，則真空度為0. 09Mpa,溫度為80°C干燥24小時；得藥物干燥粉170克；取藥物干燥粉，加水適量溶解均勻后加こ酸こ酯一半量900ml萃取，萃取三次(毎次加入量為900ml)，合并こ酸こ酯萃取液，進行減壓濃縮，濃縮溫度為50°C，真空度為0. 09Mpa,濃縮至溶液相對密度0. 90-0. 95 (50°C測)，濃縮液進行真空干燥真空度為0. 09Mpa，溫度為60°C干燥10-20小時；即得中草藥提取物惚白皮總皂苷80克。實施例3惚白皮總皂苷的制備方法，包括以下步驟取選好的飛天蜈蚣七1000克分別經(jīng)過沖洗、干燥后粉碎成粗粉，加入到こ醇-水體系中先浸潰，浸潰后回流；其中こ醇-水體系中こ醇濃度為85%，其余為水，浸潰時間12小吋，回流提取溫度為90°C，共提取兩次，每次I小吋，こ醇-水體系用量為5000ml，即こ醇-水體系飛天蜈蚣七=lg/5ml ;提取完成后，合并提取液，減壓回收こ醇，濃縮至相對密度I. 06至I. 10 (60°C測)，得到濃縮液；加濃縮液量一半量水，攪拌均勻，靜止24小時，抽濾；濾液上AB-8樹脂柱，先用水洗脫至無色，洗脫液棄去，再用こ醇溶液梯度洗脫，洗脫梯度為40% 80%(體積濃度計)，洗脫的流速為2ml/min，時間為15小吋，50%こ醇洗脫液棄去，合并60%、70%、80%梯度洗脫液；合并洗脫液回收こ醇，濃縮至相對密度I. 06-1. 10 (60°C測)；噴霧干燥或真空干燥采用噴霧干燥則進風溫度為170_175°C,出風溫度為80-90°C，霧化器轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/秒至120轉(zhuǎn)/秒；若采用真空干燥，則真空度為0. 09Mpa,溫度為80°C干燥24小時；得藥物干燥粉170克；取藥物干燥粉，加水適量溶解均勻后加こ酸こ酯一半量萃取，萃取三次(每次加入量相同)，合并こ酸こ酯萃取液，進行減壓濃縮，濃縮溫度為50°C，真空度為0. 09Mpa,濃縮至 溶液相對密度0. 90-0. 95(50°C測)，濃縮液進行真空干燥真空度為0. 09Mpa，溫度為60°C干燥10-20小時；即得中草藥提取物惚白皮總皂苷80克。實施例4惚白皮總皂苷的制備方法，包括以下步驟取選好的飛天蜈蚣七1000克分別經(jīng)過沖洗、干燥后粉碎成粗粉，加入到こ醇-水體系中先浸潰，浸潰后回流；其中こ醇-水體系中こ醇濃度為55%，其余為水，浸潰時間9小吋，回流提取溫度為86°C，共提取兩次，每次I. 2小吋，こ醇-水體系用量為10000ml，即こ醇-水體系飛天蜈蚣七=lg/10ml ;提取完成后，合并提取液，減壓回收こ醇，濃縮至相對密度I. 06至I. 10 (60°C測)，得到濃縮液；加濃縮液量一半量水，攪拌均勻，靜止24小時，抽濾；濾液上DS401樹脂柱，先用水洗脫至無色，洗脫液棄去，再用こ醇溶液梯度洗脫，洗脫梯度為30% 80%(體積濃度計)，洗脫的流速為I. 6ml/min,時間為24小吋，50%こ醇洗脫液棄去，合并60%、70%、80%梯度洗脫液；合并洗脫液回收こ醇，濃縮至相對密度I. 06-1. 10 (60°C測)；噴霧干燥或真空干燥采用噴霧干燥則進風溫度為160_170°C,出風溫度為70-90°C，霧化器轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/秒至180轉(zhuǎn)/秒；若采用真空干燥，則真空度為0. 15Mpa，溫度為50°C干燥40小時；得藥物干燥粉；取藥物干燥粉，加水適量溶解均勻后加こ酸こ酯一半量萃取，萃取三次(每次加入量相同)，合并こ酸こ酯萃取液，進行減壓濃縮，濃縮溫度為50°C，真空度為0. 09Mpa,濃縮至溶液相對密度0. 90-0. 95(50°C測)，濃縮液進行真空干燥真空度為0. 09Mpa，溫度為60°C干燥10-20小時；即得中草藥提取物惚白皮總皂苷80克。所制備的惚白皮總皂苷的惚木皂苷急性毒性試驗觀察惚木皂苷單次灌胃給藥的急性毒性作用，探索其致小鼠死亡的劑量范圍及LD50值。其具體的方法為昆明小鼠96只，18 22g，雌雄各半。購自西安交通大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號SCXK (陜)2007-001 ;在動物房(24°C ±3°C )內(nèi)飼養(yǎng)并觀察一周后用于試驗。試驗前將小鼠隨機分成8組，其中7個試驗組和I個對照組，每組12只，雌雄各半，組內(nèi)小鼠體重相差不超過2g。設(shè)計7個試驗組，其劑量分別為2000mg/kg、2600mg/kg、3380mg/kg、4394mg/kg、5712mg/kg、7426mg/kg、9654mg/kg。小鼠于試驗給藥前禁食12小時,不限制飲水。試驗時給小鼠一次性灌胃給藥0. 5ml/只，對照組灌胃相同體積蒸餾水，然后連續(xù)觀察14日。高劑量(9654mg/kg、7426mg/kg)組小鼠給藥3h后開始出現(xiàn)死亡；給藥后第一日，小鼠平均體重下降；中等劑量(4394mg/kg、5712mg/kg)下小鼠活動量下降，24h后精神和飲食恢復(fù)；在較小劑量(2000mg/kg、2600mg/kg)下，小鼠的飲食，活動及排便等均未見異常。通過實驗我們得出的結(jié)論是惚木皂苷一次性灌胃給藥的LD50為3265mg/kg，LD50的95%可信限為2931 3639mg/kg。MTT法檢測惚白皮總皂苷對腫瘤細胞的增殖抑制作用分別取對數(shù)生長期、CO2孵箱37°C培養(yǎng)的H22，F(xiàn)BL3和B16細胞，制成單個細胞懸液，使細胞濃度為5000個/孔，接種于96孔板，每孔加IOOul的細胞懸液。H22為懸浮細胞，而FBL3和B16則需貼壁生長。因此H22在接種后立即每孔加藥(惚白皮總皂苷或陽性 對照藥DDP)20ul，然后使總體積為200ul，F(xiàn)BL3和B16培養(yǎng)24h待貼壁細胞后加藥(惚白皮總皂苷或陽性對照藥DDP)。每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，惚白皮總皂苷的終濃度分別為0. 025g/L、0. 05g/L、0. lg/L、0. 2g/L、0. 4g/L、0. 8g/L、l. 6g/L、3. 2g/L。同時設(shè)置對照組(不加藥)、調(diào)零組(加培養(yǎng)基和溶媒)和陽性藥順鉬(DDP)組。加藥后CO2孵箱37°C繼續(xù)培養(yǎng)。加藥培養(yǎng)48h后，每孔加MTT 20ul繼續(xù)培養(yǎng)4h，懸浮細胞2000r離心lOmin，棄去上清，每空加入150ulDMS0，在搖床上震蕩lOmin，在酶標儀450nm波長下檢測各孔的OD值，按下列公式計算抑制率。細胞增值抑制率％= [I- (OD給藥組-OD調(diào)零組)/ (OD對照組-OD調(diào)零組)]X 100%在培養(yǎng)48h后，陽性對照藥順鉬則對H22、B16和FBL3細胞的抑制作用均呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系；在25 lOOumol/L范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的増加和作用時間的延長，細胞生長抑制越明顯。當惚白皮總皂苷在0. 025g/L 3. 2g/L濃度范圍內(nèi)，作用于FBL3細胞24h后，如圖2所示，藥物對腫瘤細胞的抑制作用隨濃度的升高有升高的趨勢，但量效關(guān)系并不十分明顯；當藥物作用48h后，藥物作用表現(xiàn)出了明顯的量效關(guān)系，藥物抑制腫瘤細胞生長的作用呈現(xiàn)明顯的S型曲線，也表明藥物作用48h后作用明顯。因此在后續(xù)檢測時選擇培養(yǎng)48h作為觀察時間點。 在0. 025g/L 3. 2g/L濃度范圍內(nèi)，加入惚白皮總皂苷與H22細胞共同培養(yǎng)48h后，其表現(xiàn)出明顯的腫瘤抑制作用，抑制率均在80%以上；與此同時，在0. 05g/L 0. 4g/L濃度范圍內(nèi)，惚白皮總皂苷對B16細胞的抑制作用則呈現(xiàn)出濃度依賴關(guān)系，隨著濃度的增加，腫瘤抑制率明顯上升，從0上升至80%以上，計算IC50為0. 199g/L ;在0. 025g/L 0. 2g/L濃度范圍內(nèi)，對B16細胞抑制率有明顯上升，從0上升至80%以上，IC5tl為0. 0774g/L，見圖3。惚白皮總皂苷的制劑用現(xiàn)有的成熟技術(shù)制備成的固體或液體形式的制劑，其中惚白皮總皂苷的含量為0. 1% 99%。固體形式為片劑、顆粒劑、膠囊劑，液體形式溶液、糖漿劑。采用取得的惚白皮總皂苷加入重量為I I. 5%淀粉后，制粒，制成的片劑、顆粒齊U、膠囊劑。采用取得的惚白皮總皂苷加入適量的藥用輔料，制成的液體、糖漿劑。所述的藥物輔料包括甜味劑、芳香剤、膠漿劑、防腐剤、穩(wěn)定 劑。
權(quán)利要求
1.一種惚白皮總皂苷，其特征在于，是從惚木的根皮當中提取得到的，其提取為 惚木的根皮經(jīng)こ醇-水溶液浸潰后加熱回流提取，提取液上樣于大孔吸附樹脂，用水洗脫至流出液無色后再用こ醇-水溶液梯度洗脫，收集洗脫餾分后回收こ醇，然后用こ酸こ酯萃取，將こ酸こ酯萃取液干燥后得到惚白皮總皂苷。
2.一種惚白皮總皂苷的制劑，其特征在干，以權(quán)利要求I所述的惚白皮總皂苷為藥用成分，將其制備成的固體或液體形式的制劑。
3.如權(quán)利要求2所述的惚白皮總皂苷的制劑，其特征在于，所述的固體形式為片劑、顆粒劑或膠囊劑，液體形式為溶液或糖衆(zhòng)劑。
4.權(quán)利要求I所述的惚白皮總皂苷在抗腫瘤藥物的制備的應(yīng)用。
5.一種惚白皮總皂苷的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將惚木的根皮經(jīng)沖洗、干燥后粉碎，然后加入こ醇-水溶液浸潰8 12h，浸潰后加熱回流提取I 5h，回流提取完成后收集提取液，減壓回收こ醇，濃縮得到濃縮液； 2)濃縮液加水后攪拌均勻，靜止12 24h后抽濾；將濾液上大孔吸附樹脂，先用水洗脫至流出液無色，然后再用こ醇-水溶液按照體積濃度30 80%進行梯度洗脫；收集こ醇梯度大于50%洗脫的洗脫液，并回收洗脫液中的こ醇，濃縮得到二次濃縮液； 3)將二次濃縮液噴霧干燥或真空干燥后得到藥物干燥粉； 4)將藥物干燥粉加水溶解均勻后加入こ酸こ酯萃取，萃取多次后合并こ酸こ酯萃取液，減壓濃縮得到三次濃縮液，三次濃縮液真空干燥后得到惚白皮總皂苷。
6.如權(quán)利要求5所述的惚白皮總皂苷的制備方法，其特征在于，所述的こ醇-水溶液中こ醇的體積濃度為30 85%，其余為水。
7.如權(quán)利要求5所述的惚白皮總皂苷的制備方法，其特征在于，所述的濃縮液或二次濃縮液的相對密度為I. 06 I. 10，三次濃縮液的相對密度為0. 90 0. 95。
8.如權(quán)利要求5所述的惚白皮總皂苷的制備方法，其特征在于，所述的大孔吸附樹脂為 D-101、HPD722、AB-8 或 DS401 樹脂柱。
9.如權(quán)利要求5所述的惚白皮總皂苷的制備方法，其特征在于，所述的梯度洗脫的流速為0. 5 2ml/min,時間為2 24h。
10.如權(quán)利要求5所述的惚白皮總皂苷的制備方法，其特征在于，所述的噴霧干燥時采用熱風干燥，進風溫度為160 180°C，出風溫度為70 100°C，霧化器轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/秒至200轉(zhuǎn)/秒； 真空干燥時，真空度為0. 09 0. 15Mpa，溫度為50 80°C干燥20 40小h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種楤白皮總皂苷及其制備方法和應(yīng)用。楤白皮總皂苷是從楤木的根皮當中提取得到的，其提取為楤木的根皮經(jīng)乙醇-水溶液浸漬后加熱回流提取，提取液上樣于大孔吸附樹脂柱，用水洗脫至流出液無色后再用乙醇-水溶液梯度洗脫，收集洗脫餾分后回收乙醇，然后用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯萃取液干燥后得到楤白皮總皂苷。楤白皮總皂苷對腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，能夠應(yīng)用于抗腫瘤藥物的制備。
文檔編號A61P35/00GK102824385SQ20121017872
公開日2012年12月19日 申請日期2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月1日
發(fā)明者肖志強, 楊建剛, 封衛(wèi)毅, 倪亞會, 郭晨, 孟祥海 申請人:陜西新藥技術(shù)開發(fā)中心