專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于抑制膠質(zhì)瘤遷移的干擾小分子rna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制膠質(zhì)瘤遷移的干擾小分子RNA、其制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)的原發(fā)性腦腫瘤，起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。由于惡性腦膠質(zhì)瘤具有生長(zhǎng)迅速，侵襲性強(qiáng)，手術(shù)后容易復(fù)發(fā)，病死率高等的特點(diǎn)，盡管包括手術(shù)切除術(shù)，放療以及化療在內(nèi)的腦膠質(zhì)瘤綜合治療水平在不斷提高，但其總體療效仍不理想。患上多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHO IV級(jí))的病人的平均存活時(shí)間僅僅為12-15個(gè)月，而患上間變性星形細(xì)胞瘤(WHO III級(jí))的病人的平均存活時(shí)間為2-5年。因此，尋找有效的腦膠質(zhì)瘤治療方法仍是神經(jīng)外科領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)?；蛑委熓侵赣谜；蛞吧突蛐Ｕ蛑脫Q致病基因或引入有治療價(jià)值的其他來(lái)源基因的一種治療方法。目前，基因治療主要處于基礎(chǔ)研究階段，常用的有通過(guò)基因工程產(chǎn)生抗腫瘤藥物如重組細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子拮抗物等；以新的基因替代突變的基因； 引入腫瘤抑制基因等方法。腦膠質(zhì)瘤的基因治療基本上可以分為以下幾種酶前體藥物治療、免疫基因治療、腫瘤抑癌基因治療、抗血管生成治療、反義基因治療和RNAi治療。其中 RNAi技術(shù)與傳統(tǒng)的類(lèi)似技術(shù)相比具有更多的優(yōu)點(diǎn)，因而在腫瘤研究和基因治療中得以廣泛應(yīng)用。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指由雙鏈RNA介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)與其序列同源的mRNA發(fā)生特異性降解，從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制。通過(guò)RNAi手段特異性地下調(diào)Smadl基因的表達(dá)在膠質(zhì)瘤的研究中，目前尚未見(jiàn)諸報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供用于抑制膠質(zhì)瘤遷移的干擾小分子RNA。本發(fā)明的目的之二在于提供該干擾小分子RNA的制備方法。本發(fā)明的目的之三在于提供該干擾小分子RNA的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種用于抑制膠質(zhì)瘤遷移的干擾小分子RNA，其特征在于該基因?yàn)镾EQ NO. 1所示的堿基序列。一種制備上述的用于抑制膠質(zhì)瘤遷移的干擾小分子RNA的方法，其特征在于該方法的具體步驟為根據(jù)載體設(shè)計(jì)的具體要求，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于SMADl基因299-317位，即GGA AAC AGG GCG ATG AAG A的shRNA的寡核苷酸序列，各為55bp，送華大基因研究中心進(jìn)行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列為
SEQ NO. 1
Sense: 5' -CCG GGG AAA CAG GGC GAT GAA GAC TCG AGT CTT CAT CGC CCT GTT TCCTTT TTT g-3'
Anti-sense:5，-AAT TCA AAA AAG GAA ACA GGG CGA TGA AGA CTC GAG TCT TCA TCG CCC TGT TTC C -3，；
根據(jù)上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技有限公司提供的MAGic質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒中載體設(shè)計(jì)的具體要求，將設(shè)計(jì)的shRNA的寡核苷酸序列引物和MAGic質(zhì)粒進(jìn)行連接，得到用于抑制膠質(zhì)瘤遷移干擾小分子RNA。一種上述的用于抑制膠質(zhì)瘤遷移的干擾小分子RNA在制備抗膠質(zhì)瘤遷移的分泌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計(jì)對(duì)膠質(zhì)瘤遷移有關(guān)聯(lián)的基因的RNAi，并應(yīng)用膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型研究其對(duì)抗膠質(zhì)瘤遷移的促進(jìn)作用，為RNAi在膠質(zhì)瘤的治療應(yīng)用提供了一種新方法。
具體實(shí)施例方式
一、膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞系培養(yǎng)于37°C，5%C02恒溫
培養(yǎng)箱。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化脫壁，之后加入適量培養(yǎng)液并反復(fù)吹打以混勻細(xì)胞； 將得到的細(xì)胞懸液移入15ml離心管中，1500rpm離心^iin ；去上清；用5ml無(wú)菌IXPBS將細(xì)胞懸起，吹打混勻；加約Iml細(xì)胞懸液于裝有5ml新鮮培養(yǎng)基的新培養(yǎng)瓶中，放入37°C， 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約2天左右傳代1次(主要查看細(xì)胞有無(wú)鋪滿培養(yǎng)瓶)。二、 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的分離取人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本，浸入4°C的KRBB溶液中.清洗二次，然后將標(biāo)本剪成小塊，轉(zhuǎn)移至盛有5mL消化酶液的三角瓶中，于恒溫?fù)u床中37 °C保溫，搖床轉(zhuǎn)速lOOr/min，每IOmin玻璃管反復(fù)吹打一次，放置30min。將該懸液離心500-1000rpm，5min,最后剩下為膠質(zhì)瘤細(xì)胞.用細(xì)胞培養(yǎng)液懸起沉淀，在黑背景的顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)到呈圓形的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。三、SMADl-RNAi質(zhì)粒的設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)染根據(jù)RNAi載體設(shè)計(jì)的具體要求，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于 SMADl基因四9-317，即GAG TCA AGG AGA CAT GCA A的shRNA的寡核苷酸序列，各為55bp， 送華大基因研究中心進(jìn)行合成。SMADl-RNAi對(duì)應(yīng)的序列為 SEQ NO. 1
Sense: 5' -CCG GGG AAA CAG GGC GAT GAA GAC TCG AGT CTT CAT CGC CCT GTT TCC TTT TTT g-3'
Anti-sense:5，-AAT TCA AAA AAG GAA ACA GGG CGA TGA AGA CTC GAG TCT TCA TCG CCC TGT TTC C -3，；
根據(jù)MAGic載體設(shè)計(jì)的具體要求，將設(shè)計(jì)的SMADl -RNAi的干擾片段和MAGic質(zhì)粒連接，參見(jiàn)

圖1，然后轉(zhuǎn)染進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。SMADl-RNAi質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天，在含有5ml無(wú)抗生素的DMEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基的60-mm培養(yǎng)皿里種上2X IO6個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。鋪板后第二天準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染首先用500 μ 1無(wú)血清的培養(yǎng)基(DMEM)溶解8. 0μ g的SMADl-RNAi表達(dá)載體，用500 μ 1培養(yǎng)基(DMEM)溶解Lipofectamine^OOOQOy 1)，輕輕地混勻，室溫孵育5分鐘。孵育后，為促使shRNA 表達(dá)載體與Lipofectamine^OOO充分結(jié)合，將它們輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，以形成 DNA-Lipof ectamine 2000 的復(fù)合物。將 DNA-Lipof ectamine 2000 復(fù)合物加入到 60mm 培養(yǎng)皿，之后將含有DNA-Lipof ectamineTM2000復(fù)合物的細(xì)胞培養(yǎng)皿放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6小時(shí)，換上正常細(xì)胞培養(yǎng)液。四、實(shí)驗(yàn)分組與檢測(cè)指標(biāo)正常對(duì)照組膠質(zhì)瘤細(xì)胞，培養(yǎng)液為膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液；RNAi組轉(zhuǎn)染過(guò)SMADl-RNAi的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，培養(yǎng)液為膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液。膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的檢測(cè)
將貼壁細(xì)胞培養(yǎng)皿的定點(diǎn)拍照部位做好標(biāo)記，用ΙΟΟΟμΙ tip在底部輕輕劃線(垂直 90度，用力均勻)，確保劃線處無(wú)細(xì)胞。劃線兩側(cè)間距為average gaps (AGs)。連續(xù)兩天倒置顯微鏡下IOOX下拍照，記錄各組細(xì)胞的AGs，即細(xì)胞的遷移情況。如圖2(A)和圖2(B)。圖1為shRNA的寡核苷酸序列引物和Pmeie質(zhì)粒的連接圖。圖2 (A)正常U251細(xì)胞的遷移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的遷移的細(xì)胞數(shù)量和AVGs均呈時(shí)間依賴(lài)性。圖2 (B)轉(zhuǎn)染過(guò)PLVT-136的U251細(xì)胞的遷移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 的遷移隨時(shí)間的延長(zhǎng)和對(duì)照相比細(xì)胞遷移的數(shù)量和細(xì)胞遷移的AV(iS均有所下降。圖中 PLVT136為SMADl-RNAi質(zhì)粒，標(biāo)尺的長(zhǎng)度為500um。五、結(jié)果轉(zhuǎn)染過(guò)SMADl-RNAi干擾質(zhì)粒的膠質(zhì)瘤的細(xì)胞遷移數(shù)量減少，細(xì)胞的 AV(is減少。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)RNAi技術(shù)下調(diào)膠質(zhì)瘤中的SMADl表達(dá)抑制了膠質(zhì)瘤的遷移。
權(quán)利要求
1.抑制膠質(zhì)瘤遷移的干擾小分子RNA，其特征在于該基因?yàn)镾EQNO. 1所示的堿基序列。
2.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制膠質(zhì)瘤遷移的的干擾小分子RNA的方法，其特征在于該方法的具體步驟為根據(jù)載體設(shè)計(jì)的具體要求，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于SMADl基因 299-317位，即GGA AAC AGG GCG ATG AAG A的shRNA的寡核苷酸序列，各為55bp，送華大基因研究中心進(jìn)行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列序列為 SEQ NO. 1 Sense: 5' -CCG GGG AAA CAG GGC GAT GAA GAC TCG AGT CTT CAT CGC CCT GTT TCC TTT TTT g-3'Anti-sense:5，-AAT TCA AAA AAG GAA ACA GGG CGA TGA AGA CTC GAG TCT TCA TCG CCC TGT TTC C -3，；依據(jù)載體設(shè)計(jì)的要求，將設(shè)計(jì)的shRNA序列和MAGic質(zhì)粒進(jìn)行連接，得到用于抑制膠質(zhì)瘤遷移的一種干擾小分子RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制膠質(zhì)瘤遷移的干擾小分子RNA在制取抑制膠質(zhì)瘤遷移藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于抑制膠質(zhì)瘤遷移的干擾小分子RNA、其制備方法及其應(yīng)用。該干擾小分子RNA為SEQNO.1所示的堿基序列。本發(fā)明設(shè)計(jì)對(duì)抑制膠質(zhì)瘤遷移有作用的基因的干擾小分子RNA，應(yīng)用膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型研究其對(duì)膠質(zhì)瘤遷移的抑制作用，為膠質(zhì)瘤的基因治療提供了一種新方法。
文檔編號(hào)A61P35/04GK102453714SQ20101051295
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月20日
發(fā)明者夏清梅, 潘謳東, 車(chē)麗花, 鄭大, 黃紅軍 申請(qǐng)人:上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技有限公司