專利名稱：紫地榆有效部位提取物及其制備方法和藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種紫地榆有效部位提取物及其制備方法和藥物用途。該有效部位提取物由云南民間草藥隔山消經(jīng)現(xiàn)代提取工藝制備而成，具有明顯的與抗生素協(xié)同抗耐藥菌株功效，可以用于制備與抗生素聯(lián)用的抗耐藥菌藥物或保健品。
背景技術(shù)：
2004年耐藥、高致病性的難辨梭狀菌在北美和西歐流行。僅在加拿大魁北克一地的爆發(fā)就造成7000名重癥患者和1300人的死亡。世界衛(wèi)生組織(WHO)主任表示我們正處在一場傳染性疾病全球危機的邊緣，沒有哪一個國家可以幸免。據(jù)WHO報道，全球平均每年約有1700多萬人死于各類傳染病，而 在被稱為抗生素“黃金時代”的20世紀五六十年代，全世界每年死于感染性疾病的人數(shù)約為700萬。細菌耐藥菌株的廣泛傳播和多重耐藥菌株的出現(xiàn)是病死率升高的主要原因之一。抗生素是臨床應(yīng)用最為廣泛的一類藥物，大約占所有臨床用藥的30-50%。然而，抗生素濫用除導(dǎo)致大量不良反應(yīng)、產(chǎn)生藥源性疾病，同時還導(dǎo)致細菌產(chǎn)生耐藥性和耐藥菌感染流行的嚴重后果，使臨床治療更為困難。自然界(非臨床環(huán)境)中本來就存在大量的“天然耐藥基因”，而人類對抗生素的濫用如同“篩選壓力”，選擇并進化這些整合有“耐藥基因”的病菌。傳統(tǒng)抗生素的作用已經(jīng)遭遇顯著瓶頸，大多數(shù)細菌對常見的抗生素產(chǎn)生了顯著的抗藥性，細菌耐藥性的發(fā)展從對單種藥物耐藥(例如金黃色葡萄球菌對青霉素耐藥)發(fā)展至多重耐藥(例如“ESBLs菌株”對多種常用抗生素耐藥)。多重耐藥菌、“超級細菌”在全球范圍內(nèi)的迅速出現(xiàn)和廣泛播散，是近年來細菌耐藥性發(fā)展的一個顯著特點?！俺壖毦狈褐概R床上出現(xiàn)的多種耐藥菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、抗萬古霉素腸球菌(VRE)、耐多藥肺炎鏈球菌(MDRSP)、多重抗藥性結(jié)核桿菌(MDR-TB),以及碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(KPC)等。前述“ESBLs菌株”是指產(chǎn)生超廣譜3 _ 內(nèi)酰胺酶(extended spectrum ^ -lactam ases, ESBLs)的細菌。超廣譜 ￠-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)是由質(zhì)粒介導(dǎo)的能使細菌對第三代頭孢菌素類、單酰胺類及青霉素類耐藥的一類酶，可在菌株間轉(zhuǎn)移和傳播。ESBLs主要由革蘭陰性桿菌產(chǎn)生，尤以大腸埃希菌(即大腸桿菌)和肺炎克雷伯菌為代表。目前，產(chǎn)ESBLs細菌在臨床標(biāo)本中的分離率有增加趨勢，產(chǎn)ESBLs菌對氨基糖苷類、喹諾酮類和磺胺類交叉耐藥也呈逐年上升趨勢，這給臨床感染的治療帶來了新的難題。而最近發(fā)現(xiàn)的“產(chǎn)新德里金屬-￠-內(nèi)酰胺酶I (NDM-I)耐藥細菌”與傳統(tǒng)“超級細菌”相比，其耐藥性已經(jīng)不再是僅僅針對數(shù)種抗生素具有“多重耐藥性”，而是對絕大多數(shù)抗生素均不敏感，被稱為“泛耐藥性”(pan_drug resistance, PDR)。NDM-I耐藥細菌是一種含超級耐藥的NDM-I基因的細菌。NDM-I基因編碼一種新的耐藥酶，稱為NDM-I(金屬￠-內(nèi)酰胺酶)，其對幾乎所有抗生素具有免疫力，就連“殺傷性較強的”碳青霉烯類抗生素也拿這類細菌束手無策。萬古霉素曾被譽為抗生素的最后一道防線，當(dāng)這道防線失守后，人們開始廣泛使用碳青霉烯抗生素。如今攜帶NDM-I基因的耐藥菌開始流行，表明在抗生素研發(fā)與微生物變異之間的賽跑上，后者再次取得了勝利。歐洲臨床微生物和感染疾病學(xué)會說，預(yù)計至少10年內(nèi)沒有抗生素可以“消滅”含NDM-I基因的細菌。澳大利亞堪培拉醫(yī)院傳染病部門主任彼得 科利尼翁說“這類細菌難以對付，我們沒有任何藥物可以對付它們?！蹦壳?，細菌耐藥性問題已經(jīng)非常嚴重。不僅在我國，在全球范圍內(nèi)，金黃色葡萄球菌對青霉素的耐藥率非常高，接近100%。有資料顯示，2005年，美國感染MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)致死人數(shù)已超過同期艾滋病死亡人數(shù)。香港大學(xué)感染及傳染病中心調(diào)查顯示，約11. 1%的病人在醫(yī)院期間成為MRSA攜帶者，MRSA已由醫(yī)院向社區(qū)蔓延。據(jù)我國衛(wèi)生部全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(M0HNARIN)結(jié)果顯示，我國細菌耐藥水平遠遠高于發(fā)達國家，特別是由于不加限制的抗生素濫用，導(dǎo)致我國細菌耐藥發(fā)展速度遠遠高于國外水平。如美國、歐洲大部分國家MRSA分離比率多在5-40%，但我國卻高達60%以上；大腸桿菌對氟喹諾酮類耐藥率在我國為70%左右；對三代頭孢菌素耐藥的腸桿菌科細菌，即產(chǎn)生超廣譜P -內(nèi)酰胺酶(extended spectrum ^ -lactam ases, ESBLs)細菌比率在國外大多在10-20%,而我國監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示產(chǎn)生ESBLs的大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的比率分別為35%和25%，明顯高出國外水平。如今中國存在的幾乎對所有抗生素都有抵抗能力的“超級細菌”名單越來越長， 它們已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌。如綠膿桿菌可以改變細胞膜的通透性，阻止青霉素類藥物的進入；結(jié)核桿菌通過改變體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)阻止抗生素與其結(jié)合；更有甚者，有的革蘭氏陰性菌可以主動出擊，用水解酶水解掉青霉素和頭孢菌素類藥物。這種耐藥性既能橫向被其他細菌所獲得，也能縱向遺傳給后代。臨床上出現(xiàn)很多這樣的現(xiàn)象由于耐藥菌引起感染，抗生素?zé)o法控制，最終導(dǎo)致病人死亡。NDM-I的發(fā)現(xiàn)再一次告誡，控制細菌耐藥性是我們不得不面對的重大挑戰(zhàn)。我們的應(yīng)對戰(zhàn)略和部署，需要重新審視。WHO總干事陳馮富珍2010年11月針對近期出現(xiàn)的“超級細菌”特別強調(diào)，除了各國嚴加監(jiān)控之外，以下4點也非常重要(I)抗生素的適當(dāng)使用，
(2)如何應(yīng)對醫(yī)院內(nèi)感染，(3)企業(yè)研究開發(fā)新型抗生素，(4)提高患者的應(yīng)對意識。因此，對耐藥菌的研究迫在眉睫，而尋找廣譜、高效、低毒的抗菌新藥已成為藥物研究的熱點。人們正在千方百計地從不同途徑尋求克服細菌耐藥的方法。但從目前情況看，如果單純依靠開發(fā)新的抗生素，或在原有藥物基礎(chǔ)上進行結(jié)構(gòu)改造等手段來抑制細菌耐藥性的產(chǎn)生，似乎可能性很小。瑞典傳染病控制研究所的安德里亞斯 赫迪尼(AndreasHeddini)警告說，如果濫用抗生素的勢頭不能得到有效遏制，人類很可能重返前抗生素時代。對于感染性疾患，中醫(yī)藥學(xué)認為是機體正氣虛損、熱毒內(nèi)侵所致，治則扶正固本、清熱解毒。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)使用清熱解毒、清熱燥濕等方藥治療感染性疾病療效顯著。據(jù)WHO的估計，全球使用中草藥的人數(shù)占全世界人口的65%-80%，因此，國際上開始對某些抗菌藥用植物進行研究，而大量的研究結(jié)果顯示中草藥用于抗感染有其特有的優(yōu)勢。在抗感染機制方面，研究表明中草藥既可直接抗菌而治療感染性疾?。挥挚赏ㄟ^調(diào)節(jié)免疫功能(或提高白細胞的作用一增強嗜中性粒細胞或巨噬細胞的吞噬作用，或提高血清或分泌液中溶菌酶的水平、增強補體水平，或促進抗體的生成，有些草中草藥在體內(nèi)還有明顯的抗毒作用一對抗病原微生物的效應(yīng)，或使毒素直接滅活，或加速毒素的排除)，增強機體免疫力，從而調(diào)動自身潛力抗感染，達到治療疾病的目的。由于中草藥特殊的多作用機制，使得細菌對其不易形成耐藥性。此外，中草藥所含成分多，因此其中的抑菌成分較多，可作用于細菌的不同部位和繁殖的不同階段，并對細菌的多個代謝環(huán)節(jié)作用，故不易產(chǎn)生耐藥性。研究表明，部分中藥與抗生素聯(lián)用時，可作為增效劑增強抗生素的抗菌作用。因此，近年來臨床上中西藥聯(lián)合使用治療感染性疾病已越來越普遍。中西藥合理聯(lián)用可取長補短，達到增效減毒的目的。紫地榆(Geranium strictipes R. Knuth )為物牛兒苗科老鸛草屬植物,是中國的特有植物，分布在中國大陸的云南、四川等地。紫地榆生長于海拔2，700米至3，000米的地區(qū)，常生于山坡草地、林下及灌叢，目前尚未由人工引種栽培。在云南主要分布于中甸、麗江、大理、昆明等地，其根為白族、彝族民間常用草藥隔山消，味苦、微澀、酸，性微寒，功能主治為清熱利濕，活血止血(滇南本草)。白族和彝族民間多用于治療厭食、痢疾、慢性胃炎、脘腹疼痛，月經(jīng)不調(diào)，鼻衄；也可外用，治跌打損傷。國內(nèi)外文獻表明目前對紫地榆的研究主要集中在對其化學(xué)成以及隔山消(紫地榆的根)水提物抑齲作用方面的探索，而對該藥的有關(guān)藥理、毒理、臨床應(yīng)用、藥材標(biāo)準(zhǔn)等方 面的研究報道都非常少。除本專利發(fā)明人前期對其粗提物的抗菌作用進行了初步研究，尚未見其它關(guān)于紫地榆和/或其有效部位提取物抗感染方面作用的報道。另外，已報道的紫地榆主要化學(xué)成分包括鞣質(zhì)類和酚酸類，其中五倍子酸甲酯具有抗Hiv的活性。我們在前期的工作中對隔山消的體內(nèi)外抑菌作用進行了初步的研究，并發(fā)現(xiàn)
(I)其粗提物具有廣譜抗菌作用，其對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌、乙型副傷寒沙門菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌均有不同程度的抗菌活性(最低抑菌濃度MIC為0. I毫克/毫升 31毫克/毫升)；(2)隔山消不同極性提取物也有一定的抗菌作用，其中乙酸乙酯提取物、丙酮提取物對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾志賀菌、銅綠假單胞菌、枯草柑橘的MIC (最低抑菌濃度)分別為0. 39暈克/暈升飛.25暈克/暈升、0. 78暈克/暈升 25暈克/暈升；(3)隔山消粗提物和不同極性提取物對葡萄球菌有抗菌活性，但是粗提物的MIC小于不同極性提取物；因此，若以治療葡萄球菌類的革蘭氏陽性菌感染疾病為目的，則提取工藝需重新設(shè)計；(4)不同極性提取物的抑制大腸埃希菌及其他一些革蘭氏陰性菌或兼性厭氧菌的活性好于粗提物；因此，若以治療大腸埃希菌類的革蘭氏陰性菌感染疾病為目的，則應(yīng)對隔山消進行有效部位的提取分離；(5)不論是粗提物或是不同極性提取物，紫地榆都顯示了較好的抗耐藥性；(6)雖然紫地榆粗提物與部分極性提取物顯示了抗菌活性，然而，其單獨應(yīng)用的抗菌效果都遠不如常用抗生素，因此，難以達到替代抗生素的目的。由于NDM-I基因常見于大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌及陰溝腸桿菌等，且這些細菌也是產(chǎn)ESBLs的菌株；而金黃色葡萄球菌又是最常見的致病菌，其MRSA耐藥菌株則是最常見的超級細菌，因此，若能在不易產(chǎn)生耐藥性的傳統(tǒng)民間草藥紫地榆中找到能同時有效抑制大腸埃希菌與金黃色葡萄球菌耐藥菌株的活性部位，將對治療超級細菌等耐藥菌株提供全新的物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)前期研究結(jié)果，為了能從紫地榆中獲得同時高效抑制葡萄球菌和大腸埃希菌的活性物質(zhì)，并將其應(yīng)用于多重耐藥菌、甚或超級細菌感染的治療，我們設(shè)計了全新的紫地榆有效部位的富集工藝并制備了該有效部位提取物，并研究其與常用抗生素聯(lián)用的效果。以期能得到有效抑制耐藥菌株生長的活性物質(zhì)，從而將其進一步開發(fā)成為與常見抗生素聯(lián)用的藥物，將其應(yīng)用于多重耐藥菌感染疾病的治療。據(jù)此完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種適合于工業(yè)化生產(chǎn)的紫地榆有效部位提取物，具體而言，該有效部位提取物由下列方法制備得到a)用70%_90%乙醇溶劑回流提取經(jīng)粉碎的紫地榆3次，每次提取0. 5-4小時，溫度60-900C ;合并提取液，減壓濃縮得乙醇浸膏；b)將步驟a得到的乙醇浸膏經(jīng)乙酸乙酯萃取并減壓濃縮得乙酸乙酯浸膏；
c)將步驟b得到的乙酸乙酯浸膏溶于蒸餾水中超聲使其充分溶解，經(jīng)大孔吸附樹脂材料柱層析，水洗，然后用20%-95%的乙醇-水洗脫，其中大孔吸附樹脂的型號為DlOl ；d)將步驟c得到的洗脫液減壓濃縮至無醇味，干燥得產(chǎn)品；其中干燥方法優(yōu)選冷凍干燥。其中，減壓濃縮時的溫度不超過100°C ;步驟a中3次回流提取的時間優(yōu)選1-2小時；提取時溫度優(yōu)選75-85°C ;中步驟c中的洗脫溶劑優(yōu)選50%-60%的乙醇-水。本發(fā)明中的紫地榆是指物牛兒苗科老鸛草屬植物紫地榆Geranium strictipesR. Knuth的任一部位或全草,優(yōu)選其干燥根。本發(fā)明的另一目的是提供了由大孔樹脂制備得到的紫地榆有效部位提取物在制備治療耐藥菌株感染疾病的藥物中的應(yīng)用。由紫地榆有效部位提取物制備的抗耐藥菌感染藥物可以單獨使用達到防治耐藥菌株感染的目的，還可以與臨床上常用抗生素聯(lián)合使用達到協(xié)同抑制耐藥菌株生長、有效治療多重耐藥菌或超級細菌感染的相關(guān)疾病。上述藥物可以采用注射劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、n服液、氣霧劑、透皮貼劑、栓劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。本發(fā)明的再一目的是提供了一種含有由大孔吸附樹脂制備得到的紫地榆有效部位提取物的藥物組合物。紫地榆醇提物經(jīng)乙酸乙酯萃取及大孔吸附樹脂柱層析富集到的有效部位提取物可以與臨床上常用的抗生素及藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，制備得到對耐藥菌株具有抑菌、殺菌活性從而可以用于治療耐藥菌株感染性疾病的藥物組合物。所述臨床上常用抗生素包括青霉素、紅霉素、苯唑西林、慶大霉素、左氧氟沙星、氨芐西林-舒巴坦等。該類藥物組合物可以采用注射劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、氣霧劑、透皮貼劑、栓齊U、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。本發(fā)明的相關(guān)試驗中選用了 DlOl大孔吸附樹脂為分離工具，對紫地榆干燥根的醇提物進行了分段，有效地富集了紫地榆有效部位提取物；并采用試管稀釋法測定紫地榆有效部位提取物，及其與抗生素聯(lián)用對各實驗菌株的最低抑菌濃度(MIC);采用棋盤稀釋法測定紫地榆有效部位提取物與抗生素聯(lián)用的聯(lián)合抑菌濃度指數(shù)(FIC)。試管法測定聯(lián)用結(jié)果顯示紫地榆有效部位提取物與青霉素、紅霉素、慶大霉素及氨芐西林-舒巴坦等抗生素聯(lián)用后，原抗生素對MRSA的MIC值降低；紫地榆有效部位提取物與左氧氟沙星、慶大霉素、氨芐西林-舒巴坦等聯(lián)用時，能有效降低原抗生素對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的MIC值。棋盤法測定聯(lián)用結(jié)果顯示紫地榆有效部位提取物與青霉素聯(lián)用時，對抗MRSA具有協(xié)同作用；紫地榆有效部位提取物與左氧氟沙星、慶大霉素、氨芐西林-舒巴坦聯(lián)用對抗產(chǎn)超廣譜3 -內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌呈相加作用。藥理實驗結(jié)果顯示，紫地榆有效部位提取物不易使抗生素產(chǎn)生耐藥性，并且與常用抗生素聯(lián)用時具有較好的增效作用。這些結(jié)果說明使用大孔吸附樹脂對紫地榆醇提物進行精制在生產(chǎn)工藝上及制藥用途的應(yīng)用上有著相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢，并且以往未見相關(guān)的報道，從而構(gòu)成本發(fā)明。本發(fā)明有益之處在于首次發(fā)現(xiàn)由大孔樹脂制備的紫地榆有效部位提取物物與常用抗生素聯(lián)合使用能有效抑制耐藥菌株的生長，其具有防治耐藥菌株感染性疾病方面的成藥潛力。為開發(fā)抑制耐藥菌株生長之非抗生素類創(chuàng)新藥物提供了新的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有潛在巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。本發(fā)明再一特點為紫地榆有效部位提取物的制備采用了除去干擾成分效果好、操作簡便、樣品損耗小、成本低、污染小、安全可靠的大孔吸附樹脂為提取分離材料，利于節(jié)能減排條件下的大規(guī)模生產(chǎn)。產(chǎn)業(yè)化前景十分明確。
具體實施例方式為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面通過實施例進一步說明本發(fā)明。實施例給出了紫地榆有效部位提取物的制備、其對耐藥菌株的生長抑制作用以及其與常用抗生素聯(lián)用時對耐藥菌株的生長抑制試驗的結(jié)果，說明其在制備抗耐藥菌藥物中的用途。必須說明，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。實施例I :紫地榆有效部位提取物(509ffit0H部位)的制備I. I儀器與試劑冷凍干燥機(FDU-2100)為日本EYELA東京理化器械株式會社產(chǎn)品，超凈工作臺采用蘇州凈化設(shè)備有限公司SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，隔水式恒溫培養(yǎng)箱為上海一恒科技有限公司產(chǎn)品，滅菌鍋用上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-210)為瑞士步祺產(chǎn)品。紫外光譜用Shimadzu UV-240紫外分光光度計測定，薄層制備層析(PTLC)用Merck公司的鋁箔硅膠板，薄板(TLC)檢測用254nm和365nm的紫外燈；顯色劑用碘蒸氣、10%硫酸-乙醇以及磷鑰酸溶液。乙酸乙酯、乙醇、甲醇等試劑均為分析純，天津化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。I. 2 藥材隔山消，購自大理集盛大藥房。經(jīng)大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院馬曉匡教授鑒定為櫳牛兒苗科老鸛草屬植物紫地榆Geranium strictipes R. Knuth的干燥根。I. 3紫地榆乙醇浸膏的制備取隔山消藥材(紫地榆的干燥根)5公斤，加75%乙醇10000毫升浸泡，加溫至80°C提取，提取3次，每次本別為2小時、I小時、I小時。合并提取液，減壓濃縮得紫地榆乙醇浸膏I. 85公斤(樣品編號乙醇浸膏A)。I. 4紫地榆乙酸乙酯浸膏的制備取500克乙醇浸膏A，以乙酸乙酯為溶劑少量多次萃取，共3次，合并萃取液并減壓濃縮得乙酸乙酯浸膏85克。I. 5紫地榆有效部位提取物的制備將紫地榆乙酸乙酯浸膏40克溶于300毫升蒸餾水中超聲使其充分溶解，用60克大孔吸附樹脂DlOl吸附拌樣，上柱，先用水洗脫至無色。續(xù)用50%乙醇-水溶液洗脫至無色，取洗脫液10毫升減壓濃縮至干，真空干燥，即得紫地榆有效部位提取物(樣品編號50%Et0H 部位)。
實施例2 :紫地榆有效部位提取物(90%Et0H部位)的制備2. I儀器與試劑同實施例I。2. 2藥材同實施例I。2. 3紫地榆乙醇浸膏的制備取隔山消藥材(紫地榆的干燥根)5公斤，加85%乙醇10000毫升浸泡，加溫至85°C提取，提取3次，每次2小時。合并提取液，減壓濃縮得紫地榆乙醇浸膏2. 03公斤(樣品編號乙醇浸膏B)。2. 4紫地榆乙酸乙酯浸膏的制備取500克乙醇浸膏B，以乙酸乙酯為溶劑少量多次萃取，共3次，合并萃取液并減壓濃縮得乙酸乙酯浸膏88克。 2. 5紫地榆有效部位提取物的制備將紫地榆乙酸乙酯浸膏40克溶于300毫升蒸餾水中超聲使其充分溶解，用60克大孔吸附樹脂DlOl吸附拌樣，上柱，先用水洗脫至無色。續(xù)用90%乙醇-水溶液洗脫至無色，取洗脫液10毫升減壓濃縮至無醇味，冷凍干燥，即得紫地榆有效部位提取物(樣品編號AOffitOH部位)。實施例3 :以試管法測試紫地榆有效部位提取物與各抗生素對MRSA的抑菌作用3. I耐藥菌株的篩選耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的判定先用常規(guī)方法培養(yǎng)分離細菌，獲得純培養(yǎng)后用VITEK全自動微生物分析儀鑒定為金黃色葡萄球菌，然后根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會于2004年頒布的細菌藥物敏感試驗判定標(biāo)準(zhǔn)(NCCLS標(biāo)準(zhǔn)，2004)，應(yīng)用微量肉湯法，用苯唑西林測定分離的金黃色葡萄球菌MIC值,判定結(jié)果苯唑西林MIC ^ 0. 4微克/毫升，定為MRSA菌株。3. 2試劑與測試藥物Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基(MH瓊脂)(杭州天和微生物試劑有限公司，批號070731)、細菌干粉培養(yǎng)基(MH肉湯)(杭州天和微生物試劑有限公司，批號070905)、沙氏瓊脂培養(yǎng)基(北京三藥科技開發(fā)公司，批號20091105)、液體沙氏培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號20090905);青霉素(注射用青霉素鈉，批號A100400714，哈藥集團制藥總廠)、氨節(jié)西林-舒巴坦(注射用氨節(jié)西林鈉舒巴坦鈉，批號100301029,中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司)、紅霉素(注射用乳糖酸紅霉素，批號B1001173，湖南中南科倫藥業(yè)有限公司)、苯唑西林(注射用苯唑西林鈉，批號100312023，中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司)、左氧氟沙星(鹽酸左氧氟沙星注射液，批號10020301，揚子江藥業(yè)集團有限公司)、慶大霉素(硫酸慶大霉素注射液，批號=0911242，昆明制藥集團股份有限公司);實施例1、2中制備得到的乙醇浸膏A、乙醇浸膏B、乙酸乙酯浸膏、紫地榆有效部位提取物(509ffit0H部位)、紫地榆有效部位提取物(909ffit0H部位)。3. 3最低抑菌濃度(MIC)的測定取滅菌小試管15支為一組。其中每組第13、14、15管分別標(biāo)上“肉湯對照”、“檢測菌對照”、“溶劑對照”。每支試管分別加入MH肉湯2毫升。配制測試藥物濃度為100毫克/毫升。用吸管吸取藥液2毫升放入第I管內(nèi)，混勻后吸取2毫升放入第2管，同樣混勻后吸出2毫升放入第3管。依此法逐管進行稀釋至第12管。各管藥物濃度分別為50、25、12. 5,6. 25,3. 125、I. 56,0. 78,0. 39,0. 20,0. 10,0. 05 毫克 / 毫升，除“肉湯對照”管外其余
各管均加入菌液0. I毫升，放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，取出，觀察生長情況。在對照管符合要求的情況下，以肉眼未見生長的最低藥物濃度為測試藥物對細菌的最低抑菌濃度(MIC)。實驗中應(yīng)用金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。3. 4實驗結(jié)果青霉素、紅霉素、苯唑西林、慶大霉素、氨芐西林-舒巴坦、紫地榆有效部位提取物等樣品單獨應(yīng)用時對MRSA的MIC結(jié)果見表。該試驗中以金黃色葡萄球菌ATCC25923為質(zhì)控菌，各抗生素對其的MIC值均符合美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)，在質(zhì)控允許的范圍內(nèi)。表I.紫地榆各提取物與各抗生素單獨使用時抗MRSA的MIC值(抗生素微克/毫升；紫地榆各部位提取物暈克/暈升)
權(quán)利要求
1.一種紫地榆有效部位提取物，其特征由下列方法制備得到 a)用70%-90%乙醇溶劑回流提取經(jīng)粉碎的紫地榆3次，每次提取0.5-4小時，溫度60-900C ;合并提取液，減壓濃縮得乙醇浸膏，其中紫地榆是指櫳牛兒苗科老鸛草屬植物紫地偷Geranium strictipes R. Knuth的任一部位或全草； b)將步驟a得到的乙醇浸膏經(jīng)乙酸乙酯萃取并減壓濃縮得乙酸乙酯浸膏； c)將步驟b得到的乙酸乙酯浸膏溶于蒸餾水中超聲使其充分溶解，經(jīng)大孔吸附樹脂材料柱層析，水洗，然后用20%-95%的乙醇-水洗脫，其中大孔吸附樹脂的型號為DlOl ； d)將步驟c得到的洗脫液減壓濃縮至無醇味，干燥得產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的紫地榆有效部位提取物，其特征為紫地榆是指櫳牛兒苗科老鸛草屬植物紫地榆Geranium strictipes R. Knuth的干燥根；步驟d中干燥是指真空減壓干燥或冷凍干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的紫地榆有效部位提取物，其特征為減壓濃縮時的溫度不超過IOO0C ;步驟a)中3次回流提取的時間分別為1-2小時；溫度為75-85°C ;步驟c中的洗脫溶劑是指50%-60%的乙醇-水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的紫地榆有效部位提取物用于制備治療耐藥菌株感染疾病的藥物用途。
5.一種對耐藥菌株具抑菌、殺菌功能的藥物組合物，其為治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求.1-3之一的紫地榆有效部位提取物、抗生素和可藥用載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其特征為所述抗生素是指青霉素、紅霉素、苯唑西林、慶大霉素、左氧氟沙星或氨芐西林-舒巴坦。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其藥物劑型是片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、注射劑、滴丸、氣霧劑、透皮貼劑、栓劑、外用搽劑或軟膏劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及紫地榆有效部位提取物及其制備方法和藥物用途。本發(fā)明的紫地榆有效部位提取物由牻牛兒苗科老鸛草屬植物紫地榆Geranium strictipes R.Knuth經(jīng)醇水提取、乙酸乙酯萃取、大孔吸附樹脂柱層析、醇溶劑洗脫精制而成。該有效部位提取物與青霉素、紅霉素、苯唑西林、慶大霉素、左氧氟沙星、氨芐西林-舒巴坦等抗生素聯(lián)用時能有效抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌等耐藥菌株的生長，具有明顯的與抗生素協(xié)同抗耐藥菌株功效，可以用于制備與抗生素聯(lián)用的抗耐藥菌藥物或保健品。
文檔編號A61K36/185GK102670674SQ20121017922
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月2日
發(fā)明者巫秀美, 張嫻文, 施貴榮, 李鳳賢, 李輝, 洪小鳳, 耿玲 申請人:大理學(xué)院