專利名稱：具有抗流感活性的扎那米韋膦酸酯同類物及流感病毒的奧司他韋易感性的測定的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及有效對抗流感病毒的新型化合物。本發(fā)明涉及抑制來自H1N1、H5N1和 H3N2流感病毒的野生型和奧司他韋耐藥性病毒株的流感病毒的神經(jīng)氨酸酶的新型膦酸酯化合物。本發(fā)明涉及抗藥病原體的檢測。具體地，本發(fā)明涉及奧司他韋耐藥性流感病毒的檢測。更具體地，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明公開的新型化合物檢測奧司他韋耐藥性流感病毒。
背景技術：
甲型流感病毒的爆發(fā)持續(xù)引起世界范圍內(nèi)廣泛的發(fā)病率和死亡率。僅在美國，每年估計5-20%的人群感染甲型流感病毒，導致約200，000人住院治療和36，000人死亡。制定全面的接種疫苗政策已成為降低流感發(fā)病率的有效措施。然而，病毒的頻繁遺傳漂變需要每年都進行疫苗的重配制，從而很可能導致接種疫苗中的病毒株與傳播中的病毒不匹配。
甲型流感病毒由9種結構蛋白組成并且編碼具有調(diào)節(jié)功能的另外兩種非結構NSl 蛋白。病毒基因組的節(jié)段性質(zhì)形成了在不同病毒株對細胞的交叉感染過程中發(fā)生基因重配 (基因組節(jié)段交換)的機制。根據(jù)其表面顯示的不同紅細胞凝集素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA) 病毒蛋白，將甲型流感病毒分成不同亞型。甲型流感病毒亞型通過兩種病毒表面糖蛋白，紅細胞凝集素(HA或H)和神經(jīng)氨酸酶(NA或N)來鑒定。每組流感病毒亞型均通過其H和N 蛋白組合來鑒定。有16種已知的HA亞型和9種已知的NA亞型。
流感病毒是可感染包括人在內(nèi)的很多動物種類的負鏈RNA片段病毒(negative sense segmented RNA virus)。流感基因組通過病毒編碼的RNA依賴性RNA聚合酶的復制是在所有時間都產(chǎn)生具有不同基因序列的子代的易出錯過程。基因改變的活病毒被稱為“抗原性漂變的”突變體。病毒基因組的節(jié)段性質(zhì)和感染不同動物種類的可能性可產(chǎn)生“抗原性漂變的”突變體(P. K. Cheng 等人，Emerg.1nfect. Dis. 15,966(2009))。在期望的條件下，顯性變異體可能成為針對人或動物的突出病原菌。還不能完全了解導致突變體進化的多步驟篩選方法(L. Cohen-Daniel等人，J. Clin. Virol. 44，138(2009) ;R. Wagner, M. Matrosovich, H. D. Klenk, Rev. Med. Virol. 12，159(2002))。然而，疫苗常被用于預防流感病毒感染，治療流感感染的最有用療法包括施用Tamiflu (奧司他韋乙酯的憐酸鹽，Roche Laboratories, Inc.)和 Rel enza (扎那米韋，Glaxo Wellcome, Inc.) (N. J. Cox, J. M. Hughes, N. Engl. J. Med. 341, 1387 (1999))。奧司他韋(oseltamivir)和扎那米韋(zanamivir)是防止子代病毒粒子在粘液分泌內(nèi)的釋放和散播并由此降低病毒感染性的病毒唾液酸酶(神經(jīng)氨酸酶)抑制劑。作為在流感病毒表面表達的糖蛋白，神經(jīng)氨酸酶 (NA)對病毒復制和通過斷裂宿主細胞的表面唾液酸受體(sialo-receptor)與子代病毒之間的鍵而產(chǎn)生的感染性至關重要。因此，基于結構的策略來抑制NA已應用于開發(fā)抗流感藥。
扎那米韋(Relenza )(von Itzstein, Μ.等人，Naturel993, 363, 418. Dunn, C. J. ;Goa, K. L. Drugsl999, 58, 761.)是治療流感的流行藥?？肆鞲?Tamiflu)是前藥,該前藥易于被肝酯酶水解產(chǎn)生相應的作為活性抑制劑的羧酸奧司他韋而與病毒的神經(jīng)氨酸酶 (NA)活性位點內(nèi)的3個精氨酸殘基相互作用(Argll8、Arg292和Arg371) (von Itzstein, Μ. 等人,Naturel993, 363, 418. Lew, ff.等人，Curr. Med. Chem. 2000, 7, 663. Russell, R. J.等人，Nature2006，443，45.)。奧司他韋和扎那米韋均通過斷裂宿主細胞的表面涎蛋白受體與子代病毒之間的鍵來抑制對病毒繁殖很重要的流感病毒NA。NA抑制劑設計為具有(氧雜) 環(huán)己烯支架以模擬唾液酸(N-乙酰神經(jīng)氨酸，其為用于與病毒NA的活性位點結合的細胞表面糖蛋白的最外糖)酶促裂解的氧鎗過渡態(tài)。為適應與羧酸奧司他韋結合，需要生成大疏水袋的NA的誘導裝配，用于3-戊基側(cè)鏈(Collins, P. J.，等人，Nature2008, 453，1258.)。 相比之下，扎那米韋對新進化的耐藥性病毒沒有奧司他韋磷酸鹽那樣易感。由于不需要生成疏水性結合袋，扎那米韋對NA突變體(例如，臨床相關的H274Y突變體)的抑制能力不變。
甲型流感(HlNl)病毒具有奧司他韋耐藥性，這歸功于神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白274 位組氨酸變?yōu)槔野彼?H274Y)的氨基酸變化。2008年洶涌而來的季節(jié)性HlNl中的奧司他韋耐藥性H274Y突變體(A. Moscona, N. Engl. J. Med. 360，953 (2009))令人困惑，因為這些突變的增長在很多H274Y流行地區(qū)與奧司他韋的使用無關(J. Mossong等人，Antiviral Res. 84,91(2009) ;M. Jonges 等人，Antiviral Res. 83，290 (2009))。此外，在患者中報導 7 H274Y 奧司他韋耐藥性的全國流行性 HlNl (A. Gulland, Br. Med. J. 339，b4975(2009))和 H5N1突變體(Q. M. Le等人，Nature437, 1108 (2005))，這表明這些突變體會影響流感療法的選擇(1. Stephenson 等人,Clin.1nfect. Dis. 48, 389 (2009))。
通過修飾甘油基部分支架以模擬唾液酸酶裂解中的氧鎗過渡態(tài)，已經(jīng)制備了很多扎那米韋衍生物。膦酸酯基團通常在藥物設計中用作羧酸鹽的生物電子等排體(White，C. L.等人，J. Mol. Biol. 1995，245，623. Schug, K. A. ; Lindner, ff. Chem. Rev. 2005，105，67. Streicher, H. ;Busseb, H. Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 1047.)。相比于羧酸鹽-狐鹽離子對，膦酸根離子會顯示與胍鹽離子更強的靜電作用。因此，期望扎那米韋膦酸酯同類物可更強地對抗HlNl和H5N1病毒甚至H274Y突變體的神經(jīng)氨酸酶。親合力的增強可歸功于生理條件下膦酸酯基團與3個精氨酸殘基(ArgllS、Arg292和Arg371)之間的強靜電作用。
溶液相的神經(jīng)氨酸酶抑制測定通常使用熒光底物2’-(4-甲基傘形酮基)-a -D-乙?；?神經(jīng)氨酸，其被神經(jīng)氨酸酶裂解而獲得可使用熒光計定量的熒光產(chǎn)物(Potier等人,Anal. Biochem. 94:287-296 (1979))，然而，該測定法不適于高通量模式。此外，由 于抗病毒株的快速出現(xiàn)(參見，McKimm-Breschkin, J. L. Antiviral Res. 2000, 47，1_17)，仍需要尋找新型流感病毒的神經(jīng)氨酸酶抑制劑。發(fā)明內(nèi)容
2008年奧司他韋耐藥性HlNl流感病毒的世界范圍的涌現(xiàn)推動了對耐藥性突變體的研究和對研發(fā)快速測試奧司他韋易感性的需求。在潛在流行奧司他韋耐藥性HlNl病毒期間，需要用于快速評估就診患者樣本的奧司他韋易感性的“即時檢驗”(point-of-care) 測試法，這將有益于治療方案的確定。
本文記載了新型膦酸酯化合物。所述化合物作為神經(jīng)氨酸酶抑制劑具有對抗 HlNU H5N1和H3N2流感病毒的野生型和奧司他韋耐藥性病毒株的活性。在一些實施方案中，奧司他韋耐藥性流感病毒株在神經(jīng)氨酸酶中含有H274Y突變。本公開內(nèi)容還提供了通過唾液酸生成新型膦酸酯化合物的對映選擇性合成途徑。
根據(jù)本公開內(nèi)容的特點，公開了根據(jù)式⑴的化合物，
權利要求
1.用于抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶的組合物，所述組合物包括 治療有效量的式(I)化合物和藥學上可接受的賦形劑
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中，所述化合物選自以下化合物或治療有效的其鹽、酯或所述酯的鹽
3.根據(jù)權利要求2所述的組合物，其包括以下化合物中的至少一種
4.根據(jù)權利要求2所述的組合物，其包括以下化合物中的至少一種
5.根據(jù)權利要求2所述的組合物，其包括以下化合物中的至少一種
6.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中，所述組合物與流感病毒株HlNl、H5N1和H3N2彡口口
7.根據(jù)權利要求6所述的組合物，其中，流感病毒的神經(jīng)氨酸酶是野生型或H274Y突變體。
8.制備式(I)化合物的方法，
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，所述方法進一步包括以下步驟(f)將中間體化合物(7)氫化，然后使其與1，3-雙(叔丁氧基羰基)-2-甲基異硫脲和 Et3N反應以形成中間體化合物(8)
10.根據(jù)權利要求8所述的方法，所述方法進一步包括以下步驟(g)依次用溴代三甲基硅烷和甲醇鈉處理中間體化合物(7)，然后氫化以形成化合物 (Ia)
11.根據(jù)權利要求8所述的方法，所述方法進一步包括以下步驟(i)用乙醇鈉處理中間體化合物(7)，然后氫化以形成化合物(Ic)
12.根據(jù)權利要求9所述的方法，所述方法進一步包括以下步驟(h)用溴代三甲基硅烷，然后用甲醇鈉處理中間體化合物(8)以形成化合物(Ib)
13.根據(jù)權利要求9所述的方法，所述方法進一步包括以下步驟(j)用乙醇鈉，然后用三氟乙酸處理中間體化合物(8)以形成化合物(Id)
14.由權利要求8-13中任一項所述的方法制備的廣物。
15.一種用于治療流感感染的方法，所述方法包括給需要的受試者提供治療有效量的根據(jù)權利要求1所述的組合物。
16.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中，所述化合物選自以下化合物或治療有效的其鹽、酯或所述酯的鹽
17.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中，所述受試者是人或非人哺乳動物。
18.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中，所述受試者疑似感染了流感病毒，所述流感病毒包括野生型或H274Y神經(jīng)氨酸酶突變體。
19.根據(jù)權利要求18所述的方法，其中，所述流感病毒株選自H1N1、H5N1和H3N2。
20.一種用于測定奧司他韋耐藥性流感病毒存在的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供疑似包括奧司他韋耐藥性流感病毒或病毒顆粒的樣品；(b)在存在和不存在羧酸奧司他韋(OC)的情況下，使所述樣品與含有流感神經(jīng)氨酸酶識別單位(R)的結合分子接觸；和(C)測定存在和不存在奧司他韋的情況下，結合分子與所述流感病毒或病毒顆粒在結合上的差別；其中，在奧司他韋存在下，相比于接觸奧司他韋敏感型流感病毒對照時識別單位(R) 結合水平的降低，如所述樣品未出現(xiàn)結合水平的降低，表明該樣品中存在奧司他韋耐藥性流感病毒。
21.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述奧司他韋耐藥性流感病毒包括神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白的氨基酸位點274的突變。
22.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述流感突變體對神經(jīng)氨酸酶抑制劑藥物有耐藥性，但是對本發(fā)明所述的識別單位(R)仍具敏感性。
23.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中，所述含流感病毒的樣品選自以下組成的組: 粘液、唾液、呼吸分泌物、洗喉液、洗鼻液、脊髓液、痰、尿、精液、汗、糞、血漿、血、支氣管肺泡液、陰道液、淚液和組織活檢。
24.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述識別單位(R)與所述流感病毒的結合受同時與羧酸奧司他韋結合的競爭性抑制。
25.根據(jù)權利要求24所述的方法，其中，所述識別單位(R)選自扎那米韋、或零流感胍單酯、或磷雜扎那米韋或其單酯、和它們的鹽、酯和衍生物。
26.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述識別單位(R)偶聯(lián)至可檢測的傳感單元⑶。
27.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中，所述識別單位(R)通過連接部(L)偶聯(lián)至所述傳感單元，以使所述結合分子具有R-L-S結構。
28.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中，所述連接部(L)選自脂肪族鏈、三唑、水溶性連接部和乙二醇連接部。
29.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中，所述傳感單元是可檢測部分，其選自熒光標記、金標記、酶標記、放射性標記、量子點標記、生物素-抗生物素蛋白類標記和蛋白標記。
30.根據(jù)權利要求29所述的方法，其中，所述熒光標記選自以下組成的組熒光素、 BODIPY> Alexa Fluor、Cy3、Cy5、Oregon Green、四甲基若丹明、若丹明紅、德克薩斯紅、批啶基噁唑、苯并噁二唑衍生物、NBD鹵化物、碘代乙酰胺類、SBD ;瑩黃、碘代乙酰胺；芪、香豆素、萘、氮丙唳、dapoxyl、花、bimanes、咕噸、花青、花、酞菁染料、藻膽蛋白、方酸菁染料、能量轉(zhuǎn)移染料組合，和它們的衍生物。
31.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，所述R-L-S分子選自以下化合物BMl :扎那米韋_(三唑連接部)_生物素
32.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，R是磷雜扎那米韋或其衍生物。
33.根據(jù)權利要求32所述的方法，其中，競爭性結合羧酸奧司他韋的化合物R是式(I) 化合物，R人 § (I)，
34.根據(jù)權利要求32所述的方法，其中競爭性結合羧酸奧司他韋的化合物R是選自以下化合物或其衍生物
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測耐藥病原菌和治療其感染的方法和組合物。還提供了用于利用非奧司他韋流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑和羧酸奧司他韋通過競爭性結合分析來檢測奧司他韋耐藥性流感病毒的方法。本發(fā)明公開了偶聯(lián)至傳感器且用于本發(fā)明方法中的流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑。還公開了作為對抗H1N1、H5N1和H3N2病毒的野生型和奧司他韋耐藥性的流感病毒的神經(jīng)氨酸酶抑制劑的新型膦酸酯化合物。本發(fā)明還提供了通過唾液酸制備這些膦酸酯化合物的對映選擇性合成途徑。
文檔編號A61K31/00GK103068378SQ201180034218
公開日2013年4月24日 申請日期2011年5月10日 優(yōu)先權日2010年5月10日
發(fā)明者齊暉·王, 方金民, 鄭義勛, 謝俊杰 申請人:中央研究院