專利名稱：一種膠原原液及潤眼液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種膠原原液及潤眼液的制備方法。
背景技術(shù)：
角膜結(jié)膜干燥癥又稱干眼癥，是由于淚液質(zhì)和量的異?；驕I液流體動力學異常引起的淚膜不穩(wěn)定和眼表損害，從而導致眼部不適癥狀的一類疾病。干眼是多因素的病因，其中，長期使用含有防腐劑的潤眼液或護理液是現(xiàn)代人產(chǎn)生眼部干眼癥的最主要原因之一。潤眼液中添加一定含量的防腐劑雖利于制劑保存，但長期使用可導致正常人眼角膜表淺性刺激或損傷，從而引發(fā)或加重干眼癥狀。新潔爾滅作為常規(guī)防腐劑被廣泛應(yīng)用于各類潤眼液中，一般添加量為0. lg/ml，有研究發(fā)現(xiàn)，長期使用含新潔爾滅的潤眼液，會對眼角膜上皮細胞造成不可逆的損傷，開始時出現(xiàn)視力下降，眼睛充血或視物模糊等癥狀，繼而引起上皮細胞變性、脫落，嚴重可導致角膜潰瘍或者糜爛。膠原由三條肽鏈擰成螺旋形的纖維狀的細胞外蛋白質(zhì)，占全身蛋白質(zhì)的30%以上，具有獨特的生理活性。膠原蛋白富含人體必需的甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等氨基酸，是細胞外基質(zhì)中最重要的組成部分，具有強的生物活性及生物功能，能參與細胞的遷移、分化和增殖，使骨腱、軟骨和皮膚具有一定的機械強度，且由于其微弱的抗原性和良好的生物相容性，在燒傷、創(chuàng)傷、眼角膜疾病、美容、硬組織修復、創(chuàng)面止血等醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域用途廣泛，在眼組織中主要分布于角膜和鞏膜。膠原雖具有較好的生物學性能，但作為一種天然活性蛋白，生產(chǎn)中若處理工藝不當，極易變性喪失活性，無法達到治療或保健的目的。同時由于膠原富含營養(yǎng)，非常容易滋生微生物，在這種情況下，一般需要在膠原溶液中添加防腐劑和/或抗生素，以保證膠原溶液在貯存期間不發(fā)生變質(zhì)。但是添加防腐劑和/或抗生素，又會引起耐藥性、刺激性等副作用，嚴重者可能引起干眼癥、青光眼等發(fā)生。在眼用制劑中，膠原膜雖然已被廣泛的應(yīng)用于眼部損傷治療研究，但用于眼部日常保健和護理產(chǎn)品，目前尚未有成熟的產(chǎn)品推出市場。要獲得可實際應(yīng)用的膠原蛋白潤眼液，需要一種可大規(guī)模制備無菌無害，且可保持膠原活性的膠原蛋白液的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種膠原原液及潤眼液的制備方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是 一種膠原原液制備方法，包括如下步驟
1)將原料用新潔爾滅溶液浸泡，之后使用過氧乙酸與乙醇混合溶液浸泡，進行消毒和無害化處理；
2)將消毒和無害化處理的原料清洗干凈，用醋酸溶液浸泡12 48小時，得到膠原原液。優(yōu)選的，所述新潔爾滅溶液的濃度為0. 1 0. 5%。
優(yōu)選的，所述新潔爾滅溶液的浸泡時間為10 25min。優(yōu)選的，過氧乙酸與乙醇混合溶液中，過氧乙酸的體積濃度為0. 1 0. 3%，乙醇的體積濃度為70 75%。優(yōu)選的，所述過氧乙酸與乙醇混合溶液的浸泡時間為10 30min。優(yōu)選的，所述醋酸溶液的濃度為0. 05 1. 0M。一種一次性膠原潤眼液的制備方法，包括以下步驟
1)將上述方法制得的膠原原液酸溶、純化，得到膠原蛋白液；
2)調(diào)節(jié)膠原蛋白液的濃度和滲透壓，無菌條件下灌裝、密封，得到一次性膠原潤眼液。優(yōu)選的，所述一次性膠原潤眼液的規(guī)格為0. 1 aiil/支。所述一次性膠原潤眼液適用于眼球的清洗、潤滑保濕、干眼癥的日常護理及角膜損傷創(chuàng)面的止血修復。本發(fā)明的膠原原液的制備方法，可有效地殺滅原料中的各種微生物及有害物質(zhì)。 同時，不會使膠原的活性失活，保證制得的各種膠原產(chǎn)品具有良好的生物活性。本發(fā)明方法制得的潤眼液，由膠原蛋白、滲透壓調(diào)節(jié)劑和注射用水組成，對干眼癥有良好的療效，可有效的修復角膜，適用于眼球的清洗、潤滑保濕、干眼癥的日常護理及角膜損傷創(chuàng)面的止血修復。潤眼液中不含防腐劑、抗生素，有效地避免了防腐劑、抗生素對眼睛的傷害。


圖1是動物實驗中模型對照眼的病理圖2是使用本發(fā)明方法制備的潤眼液用于動物實驗研究中的治療眼的病理圖； 圖3是本發(fā)明方法制備的潤眼液用于眼角膜創(chuàng)傷修復的治療研究效果圖； 圖4是本發(fā)明方法制備的潤眼液的紫外吸收峰定性檢測圖； 圖5是本發(fā)明方法制備的潤眼液的高效液相色譜法定性檢測圖； 圖6是本發(fā)明方法制備的潤眼液的SDS-PAGE電泳圖。
具體實施例方式一種膠原原液制備方法，包括如下步驟
1)將原料用新潔爾滅溶液浸泡，之后使用過氧乙酸與乙醇混合溶液浸泡，進行消毒和無害化處理；
2)將消毒和無害化處理的原料清洗干凈，用醋酸溶液浸泡12 48小時，得到膠原原液。優(yōu)選的，所述新潔爾滅溶液的濃度為0. 1 0. 5%。優(yōu)選的，所述新潔爾滅溶液的浸泡時間為10 25min。優(yōu)選的，過氧乙酸與乙醇混合溶液中，過氧乙酸的體積濃度為0. 1 0. 3%，乙醇的體積濃度為70 75%。優(yōu)選的，所述過氧乙酸與乙醇混合溶液的浸泡時間為10 30min，更佳的，浸泡時間為10 20min。
優(yōu)選的，所述醋酸溶液的濃度為0. 05 1. 0M，優(yōu)選為0. 05 0. 2M。醋酸溶液的浸泡時間優(yōu)選為36 48小時。一種一次性膠原潤眼液的制備方法，包括以下步驟
1)將上述方法制得的膠原原液酸溶、純化，得到膠原蛋白液；
2)調(diào)節(jié)膠原蛋白液的濃度和滲透壓，無菌條件下灌裝、密封，得到一次性膠原潤眼液。優(yōu)選的，所述一次性膠原潤眼液的規(guī)格為0. 1 aiil/支，方便不同人群的使用，避
免浪費。所述一次性膠原潤眼液適用于眼球的清洗、潤滑保濕、干眼癥的日常護理及角膜損傷創(chuàng)面的止血修復。制備膠原蛋白的原料，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，常用的有新鮮鼠尾、豬、牛筋腱等。當然，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的基本常識，在進行消毒無害化處理前，需要先對這些原料進行清洗，以去除不需要的皮毛、血清、脂肪及其他污漬。為了保證原料的處理效果，優(yōu)選在潔凈條件下進行處理，如在GMP萬級條件下或更為潔凈的環(huán)境下進行消毒無害化處理。當然，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的基本常識，為保護潤眼液是無菌的，灌裝、密封處理應(yīng)該在局部百級的條件下進行。 下面結(jié)合實施例，進一步說明本發(fā)明。通常采用?；蜇i的筋腱、皮、骨等材料、鼠尾進行I型膠原的提取和制備。提取前， 原料進行相應(yīng)的去毛、去脂處理和徹底清洗后，以醋酸進行提取。上述材料質(zhì)地致密、含有可溶性和不溶性膠原。新鮮鼠尾中膠原組織疏松、為可溶性膠原，提取制備后的原液均一性好，但是提取的膠原同樣易被化學試劑破壞。不論采用何種材料制備膠原，原料的消毒和無害化處理的方法對提取的膠原的質(zhì)量影響非常大。以下實施例中，以新鮮鼠尾為例，說明如何制備得到膠原原液和潤眼液。以下實施例中，所述的百分濃度，除過氧乙酸、乙醇的百分濃度為體積濃度外，其他均指質(zhì)量百分濃度。膠原原液的制備實施例1
1)將新鮮鼠尾用水清洗干凈，除去血清及皮毛上的污漬、血清；
2)將清洗干凈的鼠尾于0.5%新潔爾滅溶液中浸泡15min，洗凈后于0. 3%過氧乙酸聯(lián)合75%乙醇進行浸泡IOmin ；
3)將鼠尾脫皮抽提筋腱，清洗干凈，于0. 05M醋酸低溫浸泡提取處理48h，得到膠原原液。實施例2
1)將新鮮鼠尾用水清洗干凈，除去血清及皮毛上的污漬、血清；
2)將清洗干凈的鼠尾于0.1%新潔爾滅溶液中浸泡25min，洗凈后于0. 1%過氧乙酸聯(lián)合70%乙醇進行浸泡20min ；
3)將鼠尾脫皮抽提筋腱，清洗干凈，于0.IM醋酸常溫浸泡提取處理36h，得到膠原原液。
實施例3
1)將新鮮鼠尾用水清洗干凈，除去血清及皮毛上的污漬、血清；
2)將清洗干凈的鼠尾于0.洲新潔爾滅溶液中浸泡20min，洗凈后于0.3%過氧乙酸聯(lián)合70%乙醇進行浸泡30min ；
3)將鼠尾脫皮抽提筋腱，清洗干凈，于0.3M醋酸常溫浸泡提取處理Mh，得到膠原原液。實施例4
1)將新鮮鼠尾用水清洗干凈，除去血清及皮毛上的污漬、血清；
2)將清洗干凈的鼠尾于0.3%新潔爾滅溶液中浸泡15min，洗凈后于0.洲過氧乙酸聯(lián)合75%乙醇進行浸泡IOmin ；
3)將鼠尾脫皮抽提筋腱，清洗干凈，于0.5M醋酸常溫浸泡提取處理30h，得到膠原原液。實施例5
1)將新鮮鼠尾用水清洗干凈，除去血清及皮毛上的污漬、血清；
2)將清洗干凈的鼠尾于0.4%新潔爾滅溶液中浸泡lOmin，洗凈后于0.3%過氧乙酸聯(lián)合75%乙醇進行浸泡12min ；
3)將鼠尾脫皮抽提筋腱，清洗干凈，于IM醋酸常溫浸泡提取處理12h，得到膠原原液。依據(jù)中國藥典2010版第三部無菌檢測方法對上述實施例制得的膠原原液進行取樣檢測，結(jié)果顯示合格，表明膠原原液為無菌。潤眼液的制備潤眼液A
1)取實施例1制備得到的膠原原液，百級層流罩下按常規(guī)方法進行鹽析、透析，純化得到膠原蛋白液；
2)使用葡萄糖溶液和注射用水調(diào)節(jié)膠原蛋白液的濃度為0.5mg/ml，滲透壓為等滲；
3)百級條件下，采用吹灌封一體化設(shè)備進行0.8ml/支灌裝、封口，一體成型，得到一次性膠原潤眼液。潤眼液B
1)取實施例2制備得到的膠原原液，百級層流罩下按常規(guī)方法進行鹽析、透析，純化得到膠原蛋白液；
2)使用葡萄糖溶液和注射用水調(diào)節(jié)膠原蛋白液的濃度為:3mg/ml，滲透壓為等滲；
3)百級條件下，采用吹灌封一體化設(shè)備進行2. Oml/支灌裝、封口，一體成型，得到一次性膠原潤眼液。療效試驗試驗1
摘除兔眼的淚腺，合并使用0. 1%新潔爾滅溶液進行干眼癥造模。治療組給予潤眼液A治療，3次/d，模型組給予生理鹽水，連續(xù)14d ；眼表觀察及虎紅角膜染色、眼瞼組織病理檢查。結(jié)果治療組眼充血、水腫癥狀較模型組受試眼輕，虎紅著色評分值與對照組相比均進行性減少。對照組的病理圖如圖1所示，治療組的病理圖如圖2所示。從圖中可以看出，對照組中，眼瞼上皮下血管擴張充血，瞼板內(nèi)腺體增生；治療組中，眼瞼上皮為含有杯狀細胞的柱狀上皮，上皮下血管未見明顯擴張，瞼板內(nèi)腺體未見明顯增生，間質(zhì)未見明顯炎細胞浸潤。治療組兔眼角膜上皮細胞層次增多，內(nèi)皮層細胞空泡變性少，眼瞼組織上皮下血管擴張充血程度及瞼板內(nèi)腺體增生程度均較對照組輕。上述實驗結(jié)果表明，本發(fā)明方法制備的潤眼液可通過對眼球的保濕潤滑和促進眼周組織再生修復等途徑對干眼癥起到一定的緩解和改善作用。試驗2
模型兔角膜機械損傷模型；
以結(jié)膜分泌物及水腫度、洲熒光素角膜染色評分、損傷愈合率等指標，評價潤眼液B對損傷角膜的修復作用。結(jié)果對照組滴加生理鹽水，對照組所有動物手術(shù)后結(jié)膜分泌物增多，水腫嚴重， 第3天的角膜損傷愈合率為39. 7士沈.1%，第13天愈合率85. 5士 14. 1% ；治療組所有動物術(shù)后應(yīng)用膠原潤眼液，結(jié)膜分泌物較少，無嚴重的水腫和充血，第3天的角膜損傷愈合率為 42.4 士 23.2%，第13天愈合率為100%。自第9天起，實驗組和對照組角膜損傷愈合具有顯著性差異(P<0. 05)，如圖3。圖3中的左圖是對照組使用生理鹽水后第14天的角膜損傷情況；右圖為實驗組使用膠原潤眼液14后，角膜損傷基本愈合。結(jié)果顯示與對照組相比，治療組在各個觀察時間點的角膜損傷愈合率均高于對照組，該潤眼液能夠加快兔損傷角膜的修復作用，提示該制劑可以應(yīng)用于臨床角膜手術(shù)病人的術(shù)后修復和護理。膠原的鑒定
Sigma公司出產(chǎn)的膠原是純度高，性能穩(wěn)定，目前被用作標準膠原。取潤眼液A進行紫外吸收峰定性檢測，檢測結(jié)果如圖4所示，由圖可知，潤眼液中的膠原在紫外225nm處有一特征吸收峰，與Sigma公司對照品相當。取潤眼液A進行高效液相色譜法定性檢測，檢測結(jié)果如圖5所示，由圖可知，在保留時間2 3s處有一特征峰，且純度高達99. 9%。取潤眼液A和Sigma公司出產(chǎn)的膠原進行SDS-PAGE電泳，電泳圖如圖6所示，由圖可知，潤眼液中所含膠原具有特征性的4 6條帶，與Sigma對照品相當。以上試驗可知，使用本發(fā)明的膠原原液生產(chǎn)得到的膠原潤眼液，其中的膠原純度高，保留了膠原的生物活性。
權(quán)利要求
1.一種膠原原液制備方法，包括如下步驟1)將原料用新潔爾滅溶液浸泡，之后使用過氧乙酸與乙醇混合溶液浸泡，進行消毒和無害化處理；2)將消毒和無害化處理的原料清洗干凈，用醋酸溶液浸泡12 48小時，得到膠原原液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠原原液制備方法，其特征在于所述新潔爾滅溶液的濃度為0. 1 0. 5%O
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種膠原原液制備方法，其特征在于所述新潔爾滅溶液的浸泡時間為10 25min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠原原液制備方法，其特征在于所述過氧乙酸與乙醇混合溶液中，過氧乙酸的體積濃度為0. 1 0. 3%，乙醇的體積濃度為70 75%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的一種膠原原液制備方法，其特征在于所述過氧乙酸與乙醇混合溶液的浸泡時間為10 30min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠原原液制備方法，其特征在于所述醋酸溶液的濃度為 0. 05 1. OM0
7.一種一次性膠原潤眼液的制備方法，包括以下步驟1)將權(quán)利要求1 6任意一項所述方法制得的膠原原液酸溶、純化，得到膠原蛋白液；2)調(diào)節(jié)膠原蛋白液的濃度和滲透壓，無菌條件下灌裝、密封，得到一次性膠原潤眼液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種一次性膠原潤眼液的制備方法，其特征在于所述一次性膠原潤眼液的規(guī)格為0. 1 aiil/支。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種膠原潤眼液的制備方法，其特征在于所述一次性膠原潤眼液適用于眼球的清洗、潤滑保濕、干眼癥的日常護理及角膜損傷創(chuàng)面的止血修復。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種膠原原液及潤眼液的制備方法。膠原原液通過將原料用新潔爾滅，之后使用過氧乙酸與乙醇混合溶液浸泡，進行消毒和無害化處理；清洗干凈，用醋酸溶液浸泡得到膠原原液。膠原原液酶解、純化，得到膠原蛋白液；調(diào)節(jié)膠原蛋白液的濃度和滲透壓，無菌條件下灌裝、密封，得到一次性膠原潤眼液。本發(fā)明的膠原原液的制備方法，可有效地殺滅原料中的各種微生物和有害物質(zhì)，不會使膠原失活。本發(fā)明方法制得的潤眼液，對干眼癥有良好的療效，可有效的修復角膜，適用于眼球的清洗、潤滑保濕、干眼癥的日常護理及角膜損傷創(chuàng)面的止血修復。
文檔編號A61K38/39GK102178936SQ20111011690
公開日2011年9月14日 申請日期2011年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月7日
發(fā)明者佟剛, 林玉泉, 趙澎, 陳淡嫦, 雷靜, 黃冬晶, 黃勝 申請人:廣州創(chuàng)爾生物技術(shù)有限公司