專利名稱：鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于禽類用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液，同時(shí)還涉及一種該 鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液的制備方法。
背景技術(shù)：
鴨病毒性肝炎簡(jiǎn)稱鴨肝炎，是危害雛鴨最嚴(yán)重的疫病之一，主要危害20日齡以內(nèi)的雛鴨，雛鴨日齡越小，死亡率越高，最高死亡率可達(dá)90%-95%，并且所有的抗菌素對(duì)本病無(wú)效。鴨病毒性肝炎早在1958年在我國(guó)發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)80年代初期起本病在我國(guó)再次流行，此后，各地疫情此起彼伏，疫情能夠被鴨病毒性肝炎I型弱毒疫苗的免疫所控制；1997年以來，本病在某些地區(qū)出現(xiàn)較嚴(yán)重的流行，其疫情不能被標(biāo)準(zhǔn)鴨病毒性肝炎I型弱毒疫苗完全地控制，懷疑有I型鴨病毒性肝炎病毒變異株出現(xiàn)。鴨痕(Duckplape)又名鴨病毒性腸炎(Duck virus enteritis, DVE),是鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。該病的特征是流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率都高。早在1923年Baudet氏在荷蘭首次發(fā)現(xiàn)本病，直到1940年Bos氏首次提出鴨瘟的名稱，并確認(rèn)是一種不同于雞瘟的新病毒病。鴨瘟在我國(guó)流行的正式報(bào)道是黃引賢1957年在廣東首先提出的，隨后武漢、上海、浙江、江蘇、廣西、湖南和福建等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，至80年代傳播到東北各省。1957年以來，本病廣泛流行于我國(guó)華南、華中、華東養(yǎng)鴨業(yè)較發(fā)達(dá)地區(qū)，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。鴨病毒性肝炎、鴨瘟病是養(yǎng)鴨業(yè)中常見的疾病，容易大范圍內(nèi)爆發(fā)，二者有時(shí)會(huì)混合感染，給治療增加了難度。主要防治方法包括抗病毒藥、中西藥及制劑、卵黃抗體及其他生物制劑等，其中卵黃抗體是最有效的治療鴨發(fā)生病毒病的方法。卵黃抗體IgY是的一種免疫球蛋白Ig，IgY在功能上相當(dāng)于哺乳動(dòng)物IgG，但結(jié)構(gòu)上有所不同，具有典型的的免疫球蛋白的空間構(gòu)象。卵黃抗體具有很多優(yōu)越性(1)由于鳥類與哺乳類動(dòng)物種系發(fā)生學(xué)的差距，鳥類更適于生產(chǎn)抗哺乳動(dòng)物抗原的特異性抗體；卵黃抗體不會(huì)激發(fā)補(bǔ)體系統(tǒng)，不與抗哺乳動(dòng)物抗原的抗體發(fā)生反應(yīng)，不與哺乳動(dòng)物和細(xì)菌的Fe受體結(jié)合，這在免疫診斷中具有重要意義。(2)卵黃抗體作為一種具有生物活性的免疫球蛋白，在貯存、生產(chǎn)、加工、攝食及消化過程中保證其穩(wěn)定性是非常關(guān)鍵的。多項(xiàng)試驗(yàn)表明，IgY具有較好的穩(wěn)定性，耐酸、耐堿、耐熱。卵黃抗體較易保存，4°C條件下存放5年或室溫條件下存放6個(gè)月對(duì)抗體活性無(wú)明顯影響。(3)卵黃抗體量大，成本低，便于規(guī)?；a(chǎn)。卵黃中抗體濃度能長(zhǎng)期維持在相當(dāng)于甚至超過血清抗體濃度的水平上。I只產(chǎn)蛋(以平均每周產(chǎn)蛋5-6枚,平均每枚蛋蛋黃大約15mL計(jì)算)所產(chǎn)蛋生產(chǎn)的抗體量相當(dāng)于90-100mL血清或180-200mL血液中抗體的量，例如I只兔子I個(gè)月可提取IgG約200mg，而I個(gè)月I只蛋可從蛋中提取IgY2000mg以上。此外，在實(shí)際生產(chǎn)中，動(dòng)物的采血不僅對(duì)動(dòng)物本身是極大的應(yīng)激，而且費(fèi)時(shí)、費(fèi)工，大規(guī)模生產(chǎn)是不切實(shí)際的，而利用蛋生產(chǎn)抗體要方便的多?？偟膩碇v，卵黃抗體對(duì)動(dòng)物沒有毒副作用，用卵黃抗體治療動(dòng)物疾病不但避免了血清價(jià)格昂貴、產(chǎn)量低的缺點(diǎn)，而且可以避免血清在治療過程中引起的副作用，是一種很有前途的新型免疫球蛋白制劑。因此，卵黃抗體在禽畜疾病診斷、治療和預(yù)防的應(yīng)用越來越多。目前卵黃抗體的制備及生產(chǎn)工藝已經(jīng)成熟，可以保質(zhì)保量的生產(chǎn)。市場(chǎng)上現(xiàn)有的產(chǎn)品一般都是按標(biāo)準(zhǔn)毒株生產(chǎn)的疫苗，用常見的水稀釋法結(jié)合硫酸銨鹽析法得到卵黃抗體產(chǎn)品，溶解度低、生產(chǎn)時(shí)抗體回收率低等缺點(diǎn)；而本發(fā)明在酸化水處理、加入冷熱技術(shù)，使本產(chǎn)品的純度提高，損失減少，在機(jī)體內(nèi)吸收快，生物利用度高，生物活性不受影響等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液，該注射液的優(yōu)點(diǎn)是純度提高，損失減少，在機(jī)體內(nèi)吸收快，生物利用度高，生物活性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的目的還在于提供一種鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液的 制備方法。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液，由以下重量百分?jǐn)?shù)的組分組成鴨病毒性肝炎卵黃抗體50-60%、鴨瘟卵黃抗體35-45%、辛酸0. 8-1. 0%、甲醛0. 2-0. 3%、硫柳汞0. 01-0. 02%及余量的水。一種所述鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液的制備方法，包括以下步驟分離毒株制備疫苗，免疫健康鴨群制得蛋，將蛋經(jīng)過消毒、酸化處理、辛酸處理、精制提取凈化處理、配制、分裝得到鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液。所述的鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液的制備方法，具體步驟是I)分離毒株制備疫苗本次病毒樣品主要從江蘇南京和福建分別采集鴨病毒性肝炎樣品和鴨瘟樣品，經(jīng)過無(wú)菌采集臨床上發(fā)病癥狀明顯的病例，將采集的樣品研磨，經(jīng)過3次凍融，15000rpm/min高速離心留取上清液,將上清液接種于雞胚囊中傳代經(jīng)過62代的傳遞，根據(jù)傳代胚胎病變和人工致病試驗(yàn)，驗(yàn)證得弱毒株JSNJ62株；鴨瘟病毒株經(jīng)過上述的方式得到病毒株FJ株，根據(jù)GenBank登錄號(hào)為EF643557公布UL28基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，連接至PMD18-T載體并轉(zhuǎn)化感受細(xì)胞DH5 a，測(cè)序，得到克隆完整UL28基因序列2415bp ；2)免疫健康鴨群制得蛋采用自備的鴨病毒性肝炎滅活疫苗和鴨瘟滅活疫苗對(duì)健康鴨群交替免疫，免疫接種鴨病毒性肝炎滅活疫苗I. 5mL (含毒103_2ELD5tlA). ImL)和鴨瘟滅活疫苗I. 5mL (含毒102_8ELD5(l/0. lmL)，第一次免疫健康鴨群使用鴨病毒性肝炎滅活疫苗，每次免疫間隔7天時(shí)間，以后免疫加I倍量，兩種疫苗交替免疫，交替免疫三次，第二次免疫后開始抗體效價(jià)檢測(cè)，使抗體效價(jià)達(dá)到I :256時(shí)，開始收集種蛋；開始收集蛋，收集的蛋進(jìn)行清理、消毒，晾干備用；3)水稀釋法酸化處理分離蛋卵黃，加入等體積的無(wú)菌水，攪拌混勻至顏色發(fā)白，得到卵黃溶液；將卵黃溶液放入60-65 0C水浴鍋內(nèi)均勻加熱30min，然后加入pH為
4.8-5. 2、溫度為4-6°C的酸化水溶液，加入量為卵黃溶液體積的6倍，混勻，4°C放置4_8h靜置沉淀，取上清液，離心20min, 15000rpm/min,留上清液；
4)辛酸處理向步驟3)上清液中加入辛酸，加入量為溶液體積的0. 8-1. 0%，混勻，靜置，棄去雜質(zhì)漂浮物，離心10min，20000rpm/min，留取上清液，靜置；5)對(duì)步驟4)所得上清液依次用0. 45 y m的濾膜截流分子量為200KD以上大分子物質(zhì)，留取濾液；6)向步驟5)所得濾液加入甲醛、硫柳汞，甲醛的加入量為0. 2-0. 3%，硫柳汞為0. 01-0. 02% ；7)除菌濾膜進(jìn)行過濾，分裝，保存。本發(fā)明在酸化水處理、加入冷熱技術(shù)，經(jīng)過粗濾、微濾、除菌過濾等細(xì)微處理，使本產(chǎn)品的純度提高，損失減少，在機(jī)體內(nèi)吸收快，生物利用度高，生物活性不受影響等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例I.本實(shí)施例鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液，由以下重量百分?jǐn)?shù)的組分組成鴨病毒性肝炎卵黃抗體50%、鴨瘟卵黃抗體35%、辛酸0. 8%、甲醛0. 2%、硫柳汞0. 01%及13. 99%的水。本實(shí)施例的鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液的制備方法，包括以下步驟分離毒株制備疫苗，免疫健康鴨群制得蛋，將蛋經(jīng)過消毒、酸化處理、辛酸處理、精制提取凈化處理、配制、分裝得到鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液。本實(shí)施例鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液的制備方法，具體步驟是I)選擇自行分離毒株制備成疫苗本次病毒樣品主要從江蘇南京和福建分別采集鴨病毒性肝炎樣品和鴨瘟樣品，經(jīng)過無(wú)菌采集臨床上發(fā)病癥狀明顯的病例，將采集的樣品研磨，經(jīng)過3次凍融，15000rpm/min高速離心留取上清液,將上清液接種于雞胚囊中傳代經(jīng)過62代的傳遞，根據(jù)傳代胚胎病變和人工致病試驗(yàn)，驗(yàn)證得弱毒株JSNJ62株；鴨瘟病毒株經(jīng)過上述的方式得到病毒株FJ株，根據(jù)GenBank登錄號(hào)為EF643557公布UL28基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，連接至PMD18-T載體并轉(zhuǎn)化感受細(xì)胞DH5 a，測(cè)序，得到克隆完整UL28基因序列2415bp ；2)免疫健康鴨群制得蛋采用自備的鴨病毒性肝炎滅活疫苗和鴨瘟滅活疫苗對(duì)健康鴨群交替免疫，免疫接種鴨病毒性肝炎滅活疫苗I. 5mL (含毒103_2ELD5tlA). ImL)和鴨瘟滅活疫苗I. 5mL (含毒102_8ELD5(l/0. lmL)，第一次免疫健康鴨群使用鴨病毒性肝炎滅活疫苗，每次免疫間隔7天時(shí)間，以后免疫加I倍量，兩種疫苗交替免疫，交替免疫三次，第二次免疫后開始抗體效價(jià)檢測(cè)，使抗體效價(jià)達(dá)到I :256時(shí)，開始收集種蛋；開始收集蛋，收集的蛋進(jìn)行清理、消毒，晾干備用；3)水稀釋法酸化處理分離蛋卵黃，加入等體積的無(wú)菌水，攪拌混勻至顏色發(fā)白，得到卵黃溶液；將卵黃溶液放入60°C水浴鍋內(nèi)均勻加熱30min，然后加入pH為4. 8、溫度為40C的酸化水溶液，加入量為卵黃溶液體積的6倍，混勻，4°C環(huán)境放置4-8h靜置沉淀，取上清液，離心20min, 15000rpm/min,留上清液；4)辛酸處理向步驟3)上清液中加入辛酸，加入量為溶液體積的0. 8%，混勻，靜置，棄去雜質(zhì)漂浮物，離心10min,20000rpm/min,留取上清液,靜置；5)對(duì)步驟4)所得上清液依次用0. 45 ii m的濾膜截流分子量為200KD大分子物質(zhì)，留取濾液；6)向步驟5)所得濾液加入甲醛、硫柳汞，甲醛的加入量為0. 2%，硫柳汞為0. 01% ；7)除菌濾膜進(jìn) 行過濾，分裝，保存。為了檢測(cè)卵黃抗體注射液在常溫下的放置時(shí)抗體效價(jià)變化，以此來確定本產(chǎn)品的保質(zhì)期，做了以下試驗(yàn)將本品保存在37°C培養(yǎng)箱中，保存24個(gè)月，分別I周、2周、I月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后，用瓊脂擴(kuò)散(AGP)法，測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣品的卵黃抗體效價(jià)變化，結(jié)果見表I。表I.常溫放置注射液不同時(shí)間段效價(jià)的變化
權(quán)利要求
1.一種鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液，其特征在于，由以下重量百分?jǐn)?shù)的組分組成鴨病毒性肝炎卵黃抗體50-60%、鴨瘟卵黃抗體35-45%、辛酸0. 8-1. 0%、甲醛0. 2-0. 3%、硫柳汞0. 01-0. 02%及余量的水。
2.一種如權(quán)利要求I所述鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟分離毒株制備疫苗，免疫健康鴨群制得蛋，將蛋經(jīng)過消毒、酸化處理、辛酸處理、精制提取凈化處理、配制、分裝得到鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液的制備方法，其特征在于，具體步驟是 1)分離毒株制備疫苗本次病毒樣品主要從江蘇南京和福建分別采集鴨病毒性肝炎樣品和鴨瘟樣品，經(jīng)過無(wú)菌采集臨床上發(fā)病癥狀明顯的病例，將采集的樣品研磨，經(jīng)過3次凍融，15000rpm/min高速離心留取上清液，將上清液接種于雞胚囊中傳代經(jīng)過62代的傳遞，根據(jù)傳代胚胎病變和人工致病試驗(yàn)，驗(yàn)證得弱毒株JSNJ62株；鴨瘟病毒株經(jīng)過上述的方式得到病毒株FJ株，根據(jù)GenBank登錄號(hào)為EF643557公布UL28基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，連接至PMD18-T載體并轉(zhuǎn)化感受細(xì)胞DH5 a，測(cè)序，得到克隆完整UL28基因序列2415bp ； 2)免疫健康鴨群制得蛋采用自備的鴨病毒性肝炎滅活疫苗和鴨瘟滅活疫苗對(duì)健康鴨群交替免疫，免疫接種鴨病毒性肝炎滅活疫苗I. 5mL (含毒103_2ELD5tlA). ImL)和鴨瘟滅活疫苗I. 5mL(含毒102_8ELD5tlA). lmL)，第一次免疫健康鴨群使用鴨病毒性肝炎滅活疫苗，每次免疫間隔7天時(shí)間，以后免疫加I倍量，兩種疫苗交替免疫，交替免疫三次，第二次免疫后開始抗體效價(jià)檢測(cè)，使抗體效價(jià)達(dá)到I :256時(shí)，開始收集種蛋；開始收集蛋，收集的蛋進(jìn)行清理、消毒，晾干備用； 3)水稀釋法酸化處理分離蛋卵黃，加入等體積的無(wú)菌水，攪拌混勻至顏色發(fā)白，得到卵黃溶液；將卵黃溶液放入60-65°C水浴鍋內(nèi)均勻加熱30min，然后加入pH為4. 8-5. 2、溫度為4-6°C的酸化水溶液，加入量為卵黃溶液體積的6倍，混勻，放置4°C環(huán)境中4-8h靜置沉淀，取上清液，離心20min, 15000rpm/min,留上清液； 4)辛酸處理向步驟3)上清液中加入辛酸，辛酸加入量為溶液體積的0.8-1. 0%，混勻，靜置，棄去雜質(zhì)漂浮物，離心10min，20000rpm/min，留取上清液，靜置； 5)對(duì)步驟4)所得上清液依次用0.45mm的濾膜截流分子量為200KD的大分子物質(zhì)，留取濾液； 6)向步驟5)所得濾液加入甲醛、硫柳汞，甲醛的加入量為0.2-0.3%，硫柳汞為0. 01-0. 02% ； 7)除菌濾膜進(jìn)行過濾，分裝，保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液及其制備方法，包括以下步驟分離毒株制備疫苗，免疫健康鴨群制得蛋，將蛋經(jīng)過消毒、酸化處理、辛酸處理、精制提取凈化處理、配制、分裝得到鴨病毒性肝炎和鴨瘟二聯(lián)高免卵黃抗體注射液。本申請(qǐng)制備方法特點(diǎn)在于通過對(duì)發(fā)病率高的地區(qū)采樣分離病毒，篩選出覆蓋面較廣的病毒株，制備疫苗；其次經(jīng)過冷、熱酸化處理得到澄清卵黃抗體粗液，這項(xiàng)技術(shù)在現(xiàn)生產(chǎn)中未曾提到；再者經(jīng)過辛酸、低溫高速離心和微濾及超濾制得卵黃抗體液。這種方法制備的二聯(lián)卵黃抗體注射液不僅劑型不同其他公司，也存在其他優(yōu)勢(shì)特征生產(chǎn)過程中損失少、純度高、生物活性高、無(wú)臨床副作用。
文檔編號(hào)A61K39/42GK102716485SQ20121018075
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者吳紅云, 徐榮君, 徐進(jìn), 郭俊清 申請(qǐng)人:鄭州后羿制藥有限公司