專利名稱：一種靶向干擾socs1基因的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及ShRNA重組腺相關(guān)病毒載體及其構(gòu)建方法與其在制備抗腫瘤藥物和疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞因子信號抑制因子(Suppressor of cytokine signaling, S0CS)是信號傳導(dǎo)通路JAK/STAT (Janus kinase/signal transduction and activators of transcription)的一個負(fù)性調(diào)控分子家族。SOCS家族包括八個成員(CIS，S0CS1-7)，其中S0CS1與多種細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。S0CS1是多種細(xì)胞因子的負(fù)性調(diào)控因子，TLR信號活化的DC產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，包括IL-12、TNF-a、IL_6、IFN-a / β、IFN-Y等，其中大部分被SOCSl調(diào)節(jié)。研究表明，S0CS1參與DC的發(fā)生、成熟和活化，對DC的免疫負(fù)反饋調(diào)節(jié)起重要作用，S0CS1可通過負(fù)反饋降低DC對細(xì)胞因子和LPS刺激的反應(yīng)，能限制DC的抗原提呈能力，下調(diào)其表達(dá)可以有效增強DC的抗腫瘤免疫反應(yīng)。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是利用序列特異性的、與靶基因同源的雙鏈RNA(dsRNA)對靶基因轉(zhuǎn)錄后的mRNA的分解，從而抑制靶基因表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。RNA干擾技術(shù)可以高效、特異地下調(diào)目標(biāo)基因的表達(dá)，為研究內(nèi)源性基因功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供了強有力的研究工具。RNAi因具有特異、快速、高效等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于抗腫瘤、抗病毒和基因治療等研究。在RNAi技術(shù)的應(yīng)用方式中，采用化學(xué)合成siRNA，存在小分子RNA在體外易被RNase降解、轉(zhuǎn)染效率低、持續(xù)時間短等缺點；質(zhì)粒介導(dǎo)RNAi也存在局限性，瞬時轉(zhuǎn)染在不同的宿主細(xì)胞質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率差別很大，尤其對于原代細(xì)胞、干細(xì)胞等體系難以滿足實驗要求，而腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒本身具有生物毒性，具有很大的潛在相關(guān)危險，限制了其臨床應(yīng)用。腺相關(guān)病毒(AAV)是一種非致病性的缺陷性病毒，需要其他病毒(如腺病毒)的基因產(chǎn)物輔助才能裝配成為具有感染性的病毒顆粒。美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)和食品及藥品管理局(FDA)宣布，AAV是基因治療最安全的病毒載體。目前，主要是歐美國家在進行以AAV為基礎(chǔ)的基因治療臨床試驗。
腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾能將自身攜帶片斷整合入宿主細(xì)胞基因組中，能夠長期穩(wěn)定并特異性抑制靶基因的表達(dá)，并且與腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，還具有低免疫原性的特點，因而成為基因治療載體的首選
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的主要是提供一種靶向干擾S0CS1基因的重組腺相關(guān)病毒載體。本發(fā)明所提供的重組腺相關(guān)病毒載體，是攜帶人U6啟動子和RNAi核苷酸序列，其針對S0CS1的RNAi序列為:
5' -CAGCTTAACTGTATCTGGA-3'用于轉(zhuǎn)錄該shRNA的DNA序列為:正義鏈:5 ' -TCGAC CAGCTTAACTGTATCTGGA AAGCTCCAGATACAGTTAAGCTGTTTTTT-3'；反義鏈:5' -CTAGAAAAAA CAGCTTAACTGTATCTGGA GCTTTCCAGATACAGTTAAGCTGG-3'；本發(fā)明的第二個目的是提供上述shRNA重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明所提供的構(gòu)建方法，是使用常規(guī)的基因重組方法，先將腺相關(guān)病毒載體中的結(jié)構(gòu)基因剔除，再將人U6 snRNA啟動子與shRNA核苷酸序列與AAV質(zhì)粒連接，構(gòu)建成靶向SOCSl基因的RNAi表達(dá)質(zhì)粒，然后將shRNA重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒和pHelper質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-HEK293細(xì)胞得到相應(yīng)的重組腺相關(guān)病毒(rAAV/shRNA)。本發(fā)明的最后一個目的是提供上述shRNA重組腺相關(guān)病毒載體及其相關(guān)產(chǎn)品在制備抗腫瘤藥物及疫苗中的用途。


圖1為人U6啟動子PCR擴增鑒定圖。
圖2重組腺相關(guān)病毒載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3為重組腺相關(guān)病毒載體rAAV的雙酶切鑒定圖。
圖4為重組腺相關(guān)病毒rAAV的制備流程圖。
圖5為重組腺相關(guān)病毒的病毒滴度檢測結(jié)果。
圖6為重組腺相關(guān)病毒載體感染效率流式檢測圖。
圖7為RT-PCR檢測靶基因干擾效率。
圖8為western blot檢測祀基因干擾效率。
具體實施例方式實施例1目的基因片段的獲取所用引物、DNA序列由上海生工生物公司合成，DNA測序由華大基因公司完成。hU6 啟動子引物序列:U6F:5' -ATATGCATCCAAGGTCGGG CAGGAAGAGGGCCTAT-3'和U6R:5/ -ATCTCGAGATCGATGC GGCCGCCA TATGGA-3'。根據(jù)NCBI Genebank中登錄的人SOCSl基因序列(NM_003745)及shRNA設(shè)計原則，利用Ambion公司的RNAi Design軟件，設(shè)計合成針對SOCSl基因有效的RNAi序列:
5' -CAGCTTAACTGTATCTGGA-3'用于轉(zhuǎn)錄該shRNA的DNA序列為:正義鏈:5 ' -TCGAC CAGCTTAACTGTATCTGGA AAGCTCCAGATACAGTTAAGCTGTTTTTT-3'；反義鏈:5'-CTAGAAAAAA CAGCTTAACTGTATCTGGA GCTT TCCAGATACAGTTAAGCTGG-3/ ； 實施例2pAAV2_S0CS1-shRNA載體構(gòu)建及鑒定A.采用PCR擴增技術(shù)擴增hU6啟動子利用引物 U6F: 5' -ATATGCATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGG CCTAT-3'
和 U6R:5' -ATCTCGAGATCGATGCGGCCGCCA TATGGA-3'，
通過PCR反應(yīng)從PAVU6+27質(zhì)粒中擴增出含hU6啟動子的序列片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖1)，膠回收純化產(chǎn)物。B.將擴增出的片段經(jīng)SalI和XbaI雙酶切后，和S0CSl_shRNA干擾序列連接，行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收純化產(chǎn)物，獲得完整的hU6啟動子及干擾序列，并行測序鑒定。C.以XhoI和NsiI雙酶切pAAV2和hU6啟動子及干擾序列，分別回收大片段，以T4DNA連接酶將hU6啟動子及干擾序列插入pAAV2質(zhì)粒，得到重組腺相關(guān)病毒載體(pAAV2-S0CSl-shRNA)。D.將連接后的導(dǎo)入基因工程大腸桿菌(E.coli)DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(按分子克隆實驗指南方法制備)，涂板到含lOOug/mlAmp的LB瓊脂培養(yǎng)基上進行抗性篩選，挑選陽性單克隆菌落，提取質(zhì)粒并純化，行后續(xù)雙酶切鑒定(圖3)，經(jīng)鑒定正確的質(zhì)粒再擴增培養(yǎng)，大量抽提質(zhì)粒。實施例2重組腺 相關(guān)病毒(rAAV)的制備及滴度測定A.按照Lipofectin說明書進行操作:將1.0ug rAAV載體質(zhì)粒、phelper質(zhì)粒、
4.0ul Lipofectin和50ulDMEM混勻，共轉(zhuǎn)染AAV-HEK293細(xì)胞培養(yǎng)過夜。次日換液，加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)至72hr后，收集培養(yǎng)液和細(xì)胞于50ml無菌離心管中，劇烈振蕩I分鐘，4°C，IOOOOrmp離心15min。取上清,過濾除菌,即可獲得相應(yīng)的重組腺相關(guān)病毒(rAAV/shRNA)。B.病毒滴度的測定:以地高辛(DIG)標(biāo)記的探針進行斑點雜交法檢測rAAV的病毒滴度。以已知病毒滴度的質(zhì)粒作為對照，制備的rAAV/shRNA病毒滴度(拷貝數(shù))為lX1012eg/ml(圖 5)。實施例3重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染效率的檢測無菌抽取健康志愿者外周血50mL,肝素抗凝,采用Ficoll密度梯度法分離外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC),培養(yǎng)于 6 孔板,貼壁 5h 后,輕輕洗去懸浮的淋巴細(xì)胞，剩余貼壁的細(xì)胞即為DC前體細(xì)胞，每孔加2.5ml含GM-CSF(800U/mL)的AIM-V培養(yǎng)基，隔天半量換液，從培養(yǎng)第2天起加入IL_4 (1000U/mL)。在DC培養(yǎng)第3天用重組腺相關(guān)病毒(rAAV/shRNA)感染，實驗分為干擾組、陰性對照組(NC)和空白對照組(Mock)。感染復(fù)數(shù)MOI為100，8小時后除去含病毒的培養(yǎng)基，以新鮮的AIM-V培養(yǎng)基取代之，并于第4天起給予TNF-a(20ng/mL)刺激DC成熟，第6天收集懸浮細(xì)胞，即為成熟的DC細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測GFP表達(dá)量，每個樣本測10000個細(xì)胞，GFP陽性細(xì)胞的陽性率即為感染效率?？梢娭亟M腺相關(guān)病毒的感染效率高達(dá)90%以上(圖6)。實施例4重組腺相關(guān)病毒體外抑制效率檢測A.qRT-PCR檢測干擾后SOCSlmRNA的表達(dá)情況
按照Trizol試劑盒操作說明分別提取干擾組、陰性對照組和空白對照組細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以GAPDH基因為內(nèi)參，采用實時熒光定量PCR法檢測SOCSlmRNA的表達(dá)情況。S0CS1基因上游引物序列為V -AGAGCTTCGACTGCCTCTTC-3 '，下游引物序列為V -GATGCGCTGGCGGCACAGCT-3 ' ； GAPDH基因為內(nèi)參照，上游引物序列為5' -GCATCCTGGGCTACACTGAG-3'，下游引物序列為 5' -TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3'。實驗操作按試劑盒說明書進行。PCR反應(yīng)采用美國羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀完成。采用相對定量法計算SOCSlmRNA的變化。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與空白細(xì)胞組及陰性對照組比較，干擾組mRNA表達(dá)量下調(diào)達(dá)82.5 %，較對照組顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P < 0.05) ο (見圖 7)B.Western blot檢測干擾后SOCSl蛋白的表達(dá)情況
轉(zhuǎn)染96h后收集各組細(xì)胞進行總蛋白提取，BCA法測定總蛋白濃度，樣品蛋白SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉液中孵育，加入鼠抗人SOCSl單克隆一抗(I: 1000)，4°C孵育過夜。TBST洗滌后加入山羊抗鼠二抗(I: 1000)室溫下?lián)u床孵育2h，TBST洗滌后用化學(xué)發(fā)光試劑孵育lmin，用X線片曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參照驗證蛋白的含量。Western blot檢測結(jié)果顯示:與空白細(xì)胞組及陰性對照組相比，干擾組SOCSl蛋白的表達(dá)顯著降低(P < 0.05)(見圖8)。臨床應(yīng)用
實驗證明，本發(fā)明的shRNA重組腺相關(guān)病毒載體能有效下調(diào)人DC中SOCSl基因的表達(dá)，這為后續(xù)研究、制備SOCSl受抑的DC抗腫瘤效應(yīng)和制備新型DC疫苗奠定了基礎(chǔ)，有很好的臨床應(yīng)用前 景。
權(quán)利要求
1.一種針對 SOCSl 的 RNAi 序列:5' -CAGCTTAACTGTATCTGGA-3'
2.一種用于轉(zhuǎn)錄權(quán)利要求1所述的shRNA的DNA序列，其DNA序列的正義鏈: 5' -TCGAC CAGCTTAACTGTATCTGGA AAGC TCCAGATACAGTTAAGCTGTTTTTT-3;； 反義鏈:5' -CTAGAAAAAA CAGCTTAACTGTATCTGGA GCTT TCCAGATACAGTTAAGCTG G-3,
3.權(quán)利要求1、2所述的RNAi序列及shRNA的DNA序列在制備抗腫瘤藥物及疫苗中的用途。
4.一種重組腺相關(guān)病毒基因治療載體及構(gòu)建方法，其特征在于:所述的重組腺相關(guān)病毒載體攜帶有權(quán)利要求2所述的DNA序列和適宜的啟動子和終止子。
5.權(quán)利要求4所述的shRNA重組腺相關(guān)病毒載體及相關(guān)產(chǎn)品的制備方法，包括如下步驟: (a)設(shè)計合成具有靶向抑制SOCSl基因的shRNA的DNA序列； (b)將人U6snRNA啟動子與RNAi核苷酸序列連接，分別經(jīng)雙酶切后與AAV載體質(zhì)粒相連接，構(gòu)建成靶向SOCSl基因的RNAi表達(dá)質(zhì)粒； (c)將上述shRNA重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒和pHelper質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-HEK293細(xì)胞得到相應(yīng)的重組腺相關(guān)病毒(rAAV/shRNA)。
6.權(quán)利要求4、5所述的shRNA重組腺相關(guān)病毒載體及其相關(guān)產(chǎn)品在制備抗腫瘤藥物及疫苗中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種特異性抑制SOCS1基因表達(dá)的shRNA(short hairpin RNA，shRNA)重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的shRNA重組腺相關(guān)病毒載體輸送入單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系中，下調(diào)SOCS1基因的表達(dá)，增強CTL的抗腫瘤活性。因此，本發(fā)明將在生物醫(yī)藥領(lǐng)域及基因功能的研究中發(fā)揮重要作用，可被用于制備抗腫瘤藥物，有很好的臨床應(yīng)用價值。
文檔編號A61P35/00GK103173446SQ20111044273
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者呂成偉 申請人:呂成偉