專利名稱：一種基于dna水平的高致病性豬藍(lán)耳病病毒jev復(fù)制子疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于DNA水平的高致病性豬藍(lán)耳病病毒JEV復(fù)制子疫苗及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前臨床應(yīng)用的PRRS疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗。由于滅活疫苗免疫效果不理想，而減毒活疫苗又存在毒力返強(qiáng)的可能性。當(dāng)前PRRS己成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一，疫苗的免疫接種仍是預(yù)防與控制PRRS最有效的措施。目前用于預(yù)防PRRS的商品化疫苗主要是弱毒苗和滅活疫苗， 但因存在安全隱患或免疫效果差的缺陷，不能提供理想的免疫保護(hù)。而被譽(yù)為“第三次疫苗革命”DNA疫苗是將編碼某種抗原蛋白的基因置于真核表達(dá)元件的控制之下，構(gòu)成重組表達(dá)質(zhì)粒DNA，將其直接導(dǎo)入動物體內(nèi)，通過宿主細(xì)胞表達(dá)加工合成抗原分子，從而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答。雖然DNA疫苗具備許多優(yōu)勢，但是卻因接種劑量大和存在與宿主基因組重組的安全隱患在發(fā)展受到很多限制。因此，研究更安全、有效的新型疫苗載體對預(yù)防和控制PRRS的發(fā)生與流行具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種基于DNA水平的高致病性豬藍(lán)耳病病毒JEV復(fù)制子疫苗。本發(fā)明另一目的在于提供上述基于DNA水平的高致病性豬藍(lán)耳病病毒JEV復(fù)制子疫苗的構(gòu)建方法。本發(fā)明還有一個目的在于提供上述基于DNA水平的高致病性豬藍(lán)耳病病毒JEV復(fù)制子疫苗的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
一種基于DNA水平的高致病性豬藍(lán)耳病病毒JEV復(fù)制子疫苗，是建立在JEV復(fù)制子 (PJEV-REP)上的。所述JEV復(fù)制子系統(tǒng)是以改造過的低拷貝質(zhì)粒pOKM為骨架，在缺失絕大部分結(jié)構(gòu)基因(第165-M02核苷酸)的情況下，構(gòu)建包括CMV啟動子、5’ UTR、C蛋白N端的前23個氨基酸(C23)、E蛋白C端的NSl蛋白的信號肽(E25)、所有非結(jié)構(gòu)蛋白、3’ UTR、核酶(HDVr)和polyA序列的基于DNA水平的JEV復(fù)制子載體系統(tǒng)。上述JEV復(fù)制子系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括如下步驟設(shè)計引物，其序列如SEQ ID NO: Γ18所示，從質(zhì)粒pWF-GFP中擴(kuò)增片段A，再從JEV的基因組RNA中擴(kuò)增出片段B、C、D
和片段II ,再以片段A和B為模板，通過融合PCR的方法擴(kuò)增出片段I ；以片段C和D為模板，融合PCR擴(kuò)增出片段III，將片段I、Π和III定向克隆到低拷貝質(zhì)粒中，得到基于DNA水平的乙型腦炎病毒復(fù)制子載體系統(tǒng)。本發(fā)明所述基于DNA水平的高致病性豬藍(lán)耳病病毒JEV復(fù)制子疫苗是將藍(lán)耳病的結(jié)構(gòu)基因GP5與M蛋白插入到基于DNA水平的JEV復(fù)制子(pJEV-REP)中，包括CMV啟動子、 5'UTRX蛋白N端的前23個氨基酸(C23)、E蛋白C端的NSl蛋白的信號肽、所有非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)、3’ UTR、核酶、polyA序列、GP5蛋白編碼區(qū)、FMDV-2A的序列和M蛋白編碼區(qū)。上述基于DNA水平的高致病性豬藍(lán)耳病病毒JEV復(fù)制子疫苗的構(gòu)建方法包括如下步驟設(shè)計引物，其序列如SEQ ID N0:19l8所示，擴(kuò)增出高致病性豬藍(lán)耳病病毒XH株的 GP5和M基因，利用融合PCR的方法，在兩個基因中間插入FMDV-2A的序列，從而得到G-2A-M 片段，最后通過SpeI和MlI兩個酶切位點(diǎn)克隆到JpJEV-REP ；另外，為了使M蛋白能夠產(chǎn)生真實(shí)的N末端，G-2A-M片段的下游插入了 IRES序列(G-2A-M-IRES)，最后利用MlI-HF 和SpeI兩個酶切位點(diǎn)插入到pJEV-REP中，最終構(gòu)建基于JEV復(fù)制子并且能夠表達(dá)GP5和 M蛋白的高致病性藍(lán)耳病疫苗。IRES的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示。G-2A-M片段的核苷酸序列如SEQ ID N0:30所示。本發(fā)明上述基于DNA水平的高致病性豬藍(lán)耳病病毒JEV復(fù)制子能有效表達(dá)并能誘發(fā)特異性抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)，可作為預(yù)防高致病性豬藍(lán)耳病的一種新型基因工程疫苗。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
目前市場普遍存在的藍(lán)耳病疫苗弱毒疫苗，但減毒活疫苗最大的缺點(diǎn)是存在毒力返強(qiáng)的可能性，而傳統(tǒng)的基因工程疫苗蛋白表達(dá)量低，免疫原性較差等不足。而本發(fā)明研發(fā)的復(fù)制子疫苗不存在活病毒，因此不存在病毒毒力返強(qiáng)的可能性，另外，本發(fā)明也證明了與傳統(tǒng)的DNA疫苗相比，本發(fā)明的疫苗可以產(chǎn)生更高的抗體和更強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。


圖1為基于JEV復(fù)制子載體的豬高致病性藍(lán)耳病疫苗的構(gòu)建圖，其中，A為 JEV-REP-G-2A-M-IRES ；B 為 pJEV-REP-G-2A_M ；
圖2為GP5基因、M基因及其融合PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，1為DNA Marker DL2, 000 ； 2為GP5基因PCR片段；3為M基因PCR片段；4為G-2A-M片段；5為G-2A-MR片段；6為 IRES序列PCR片段；7為G-2A-M-IRES片段；
圖3為各重組質(zhì)粒的酶切鑒定；其中，1為λ-EcoTH I digest Marker ;2為DNA Marker DL2, 000 ；3 為 pJEV-REP-G-2A-M_IRES (Sall/Spel);4 為 pJEV-REP-G-2A_M (Sail/ Spel);5 為 ρJEV-REP-GFP (Sall/Spel);6 為 pJEV-REP-IRES (Sall/Spel);7 為 pCAGGS-GM (EcoRI 和 XhoI)；
圖4為表達(dá)GP5/M蛋白的三組重組質(zhì)粒的Wfestern blot檢測結(jié)果；其中， 1 為 pageRuler Prestained Protein Ladder ；2 為 pJEV-REP-G-2A-M-IRES ；3 為 PJEV-REP-G-2A-M ；4 為 pCAGGS-GM ；5 為 293T 細(xì)胞；
圖5為三組pJEV-REP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h的IFA結(jié)果(X400)；其中，A 為 pJEV-REP-G-2A-M-IRES 轉(zhuǎn)染細(xì)胞；B 為 pJEV-REP-IRES 轉(zhuǎn)染細(xì)胞；C 為 PJEV-REP-G-2A-M 轉(zhuǎn)染細(xì)胞；D 為細(xì)胞； 圖6為免疫小鼠血清抗體的生長曲線；圖7為不同疫苗免疫小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞特異性增殖反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。材料=PRRSV-XH株由農(nóng)業(yè)部動物疫病防控重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室張桂紅教授惠贈； Mac 145細(xì)胞由農(nóng)業(yè)部動物疫病防控重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室提供；8周齡的SPF級BALB/c雌性小鼠購自廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心。實(shí)施例1 構(gòu)建豬高致病性藍(lán)耳病復(fù)制子疫苗
1.構(gòu)建豬高致病性藍(lán)耳病復(fù)制子疫苗的設(shè)計(結(jié)構(gòu)圖如圖1)
通過自行設(shè)計的引物(如SEQ ID NO: 19^29所示)，以HP PRRS基因RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，引物GP5F與GP5R-FMDV2A-R可擴(kuò)增出GP5基因的完整編碼區(qū)及2A序列的前45個堿基，結(jié)果擴(kuò)增出大小為648bp特異性片段；引物MF-FMDVF2A-F與MR- MlI則可以擴(kuò)增出 2A序列的后45個堿基及M基因的完整編碼區(qū)，擴(kuò)增出570bp。另外，引物GP5F和MR-&ilI 通過融合PCR的方法擴(kuò)增出約1，200bp的G-2A-M片段。同時以G-2A-M片段為模板，以 GP5F和MR為引物擴(kuò)增出約1，200bp的G-2A-MR片段，再以IRESlF和IRES-588R為引物， 以pIRESl-neo為模板擴(kuò)增出588bp的IRES序列。接著利用G-2A-MR片段和IRES為模板， 以GP5F和IRES-588R為引物融合擴(kuò)增出約1，800bp的G_2A_M_IRES特異性片段，最后利用 MlI-HF和SpeI兩個酶切位點(diǎn)插入到pJEV-REP中，最終構(gòu)建基于JEV復(fù)制子并且能夠表達(dá) GP5和M蛋白的高致病性藍(lán)耳病疫苗(如圖2)。2.真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
以GP5-EcoRI和MR-XhoI為引物，以質(zhì)粒pJEV-REP-G-2A_M為模板通過PCR的方法擴(kuò)增出G-2A-M-EX片段。然后將G-2A-M-EX片段和真核表達(dá)載體pCAGGS分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI和B10I進(jìn)行消化連接產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化以及重組質(zhì)粒的獲得，命名為pCAGGS-GM 伐口圖2)。3.各重組質(zhì)粒的酶切鑒定
重組質(zhì)粒 pCAGGS-GM 用 EcoRI 和 XhoI 進(jìn)行酶切鑒定，而 pJEV-REP-G-2A-M_IRES、 PJEV-REP-G-2A-M和pJEV_REP_IRES三個重組質(zhì)粒則均用MlI和SpeI進(jìn)行酶切鑒定(如圖3)。實(shí)施例2化學(xué)熒光法flfestern-blot檢測GP5蛋白和M蛋白表達(dá)
將共表達(dá) PRRSV 的 GP5 和 M 蛋白的質(zhì)粒(pJEV-REP-G-2A_M 和 pJEV-REP-G-2A-M_IRES) 與真核表達(dá)質(zhì)粒(pCAGGS-GM)分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4 后收集細(xì)胞，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染4 后，收獲細(xì)胞，PBS洗2次，適量PBS重懸，加入2 X SDS上樣緩沖液，沸水浴作用lOmin。制備12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)，按每孔20 μ 1點(diǎn)樣，并于80V/0. 5h和120V/1. 5h條件下電泳。電泳結(jié)束后，在半干電轉(zhuǎn)印儀上于17V/10min條件下將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上。 轉(zhuǎn)移完成以后用1\ 83洗膜5!^11，5%脫脂乳371封閉lh。用抗GP5蛋白和抗M蛋白特異性單克隆抗體室4°C孵育過夜，PBST洗3遍，每遍5min，將IRDye 800標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗作1 7，500稀釋后一起加入，室溫?fù)u床上孵育lh，PBST洗膜3次，每次5min，用Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒的細(xì)胞都在43KD出現(xiàn)特異性條帶，表明GP5和M蛋白的表達(dá)是以GP5/M異源二聚體的形式存在(見圖4)，表明這幾種重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后均可正確表達(dá)目的蛋白。實(shí)施例3間接免疫熒光檢測JEV非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)
將共表達(dá)PRRSV的GP5和M蛋白的JEV復(fù)制子質(zhì)粒(pJEV-REP-G-2A_M和 PJEV-REP-G-2A-M-IRES)與載體對照質(zhì)粒(pJEV_REP_IRES)分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后，用間接免疫熒光的方法檢測到三種JEV復(fù)制子重組質(zhì)粒均能表達(dá)JEV NSl蛋白(見圖5)。實(shí)施例4免疫小鼠血清特異性抗體的檢測
60只8周齡的SPF級BALB/c雌性小鼠分為5組，每組12只，分別免疫 pJEV-REP-G-2A-M-IRES、pJEV-REP-IRES、pJEV-REP-G-2A-M、pCAGGS-GM 和 PBS，免疫劑量為 100 μ L/只，每側(cè)各50 μ L，共免疫3次，每隔3周免疫一次。采集免疫后0、2、4、6、8和10周的免疫小鼠血清，用豬藍(lán)耳病ELISA檢測試劑盒進(jìn)行檢測(其中將豬的酶標(biāo)二抗更換為小鼠的酶標(biāo)二抗)。主要步驟如下1:100稀釋待檢小鼠血清，取預(yù)包被的板，每孔加100 μ L待檢血清，置37°C溫育30min ；300 μ L/孔洗滌液洗板4次，每次靜置:3min ；每孔加NBL公司的鼠酶標(biāo)二抗(1:7，500稀釋)100 μ L， 置37°C溫育60min ；洗滌4次，方法同上；每孔加底物A液和B液各50 μ L，室溫避光顯色 IOmin ；每孔加終止液50 μ L, 10 min內(nèi)用酶標(biāo)儀630nm波長測定各孔的OD值(見圖6)。 從圖中可以看出免疫組在一免后兩周開始檢測到特異性抗體，二免后ρJEV-REP-G-2A-M 和ρJEV-REP-G-2A-M-IRES免疫組相比對照組抗體水平開始增加，并在三免后兩周(8 周)三組疫苗組均達(dá)到抗體的高峰，此時PJEV-REP-G-2A-M (0D630=0. 73士0. 09)和 PJEV-REP-G-2A-M-IRES (0D630=0. 71 士0. 08)免疫組比 pCAGGS-GM (0D630=0. 59 士0. 11)DNA 疫苗免疫組產(chǎn)生更高的抗體。結(jié)果表明復(fù)制子疫苗比DNA疫苗能產(chǎn)生更高的抗體水平。實(shí)施例5免疫小鼠的特異性淋巴細(xì)胞增殖水平
三免后兩周進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。首先用眼球采血法處死小鼠，浸泡于75%的乙醇中；在超凈臺中取出小鼠脾臟置于35mm培養(yǎng)皿中，注意無菌操作；在培養(yǎng)皿中加入4_5 mL淋巴細(xì)胞分離液。用注射器將脾臟挑成碎塊，然后于200目的篩網(wǎng)下用注射器的活塞進(jìn)行研磨，然后吹打成單個細(xì)胞懸液；然后把懸有脾臟細(xì)胞的分離液立即轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，覆蓋200-500 μ L的1640培養(yǎng)基，保持液面分界明顯；室溫，800g離心30min ；接下來吸出淋巴細(xì)胞層，再加入10 mL1640培養(yǎng)基，顛倒洗滌。室溫，250g離心IOmin收集細(xì)胞；最后傾倒上清液，用1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)，然后用1640完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋到IX IO6個/ mL。將上述制備的淋巴細(xì)胞懸液離心后懸浮到RPMI1640完全培養(yǎng)基，然后加到96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板(1 X 105個/孔)，每孔加入100 μ L的細(xì)胞懸液。再加入相同體積的PRRSV(1 μ g)、Mac 145空細(xì)胞對照或是RPMI1640完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)板在含5% C02的37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)84h后，每孔加入10 μ L CCK-8試劑，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)池，然后用酶標(biāo)儀檢測波長為450 nm的光密度值。每個樣品設(shè)三個重復(fù)，計算刺激指數(shù) (Stimulation Index, Si)。SI=PRRSV 刺激孔的平均光密度度值 0D450nm/Macl45 空細(xì)胞對照孔密度度值0D450nm。脾細(xì)胞加入PRRSV刺激培養(yǎng)80h后，加入WST-8溶液，來判斷活細(xì)胞數(shù)量?；罴?xì)胞的量由樣品的0D450nm顯示，根據(jù)PRRSV刺激組和空細(xì)胞對照組的 0D450nm計算刺激指數(shù)(Stimulation Index, Si)從而判斷增殖水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(見圖 7)pJEV-REP-G-2A-M(SI=l. 804士0. 175)和 pJEV-REP-G-2A-M_IRES (SI=L 853士0. 254)免疫組的 SI 明顯高于 pJEV-REP-IRES (SI=1. 155士0. 037)空載體免疫組(ρ<0· 01) ； DNA 疫苗組(pCAGGS-GM) SI指數(shù)(SI=1. 54士0. 10)也明顯高于PBS對照組(ρ<0· 01)，但是增殖水平低于其它兩組復(fù)制子疫苗組。
權(quán)利要求
1.一種基于DNA水平的高致病性豬藍(lán)耳病病毒JEV復(fù)制子疫苗，其特征在于將藍(lán)耳病的結(jié)構(gòu)基因GP5與M蛋白插入到基于DNA水平的JEV復(fù)制子(pJEV-REP)中，包括CMV啟動子、5’ UTR、C蛋白N端的前23個氨基酸(C23)、E蛋白C端的NSl蛋白的信號肽、所有非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)、3’UTR、核酶、polyA序列、GP5蛋白編碼區(qū)、FMDV-2A的序列和M蛋白編碼區(qū)。
2.權(quán)利要求1所述基于DNA水平的高致病性豬藍(lán)耳病病毒JEV復(fù)制子疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟設(shè)計引物，其序列如SEQ ID NO: 1918所示，擴(kuò)增出高致病性豬藍(lán)耳病病毒XH株的GP5和M基因，利用融合PCR的方法，在兩個基因中間插入FMDV-2A的序列，從而得到G-2A-M片段，最后通過SpeI和MlI兩個酶切位點(diǎn)克隆到JpJEV-REP ；另外， 為了使M蛋白能夠產(chǎn)生真實(shí)的N末端，G-2A-M片段的下游插入了 IRES序列(G-2A-M-IRES)， 最后利用MlI-HF和SpeI兩個酶切位點(diǎn)插入到pJEV-REP中，最終構(gòu)建基于JEV復(fù)制子并且能夠表達(dá)GP5和M蛋白的高致病性藍(lán)耳病疫苗。
3.權(quán)利要求1或2所述基于DNA水平的高致病性豬藍(lán)耳病病毒JEV復(fù)制子疫苗在制備生物制品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于DNA水平的高致病性豬藍(lán)耳病病毒JEV復(fù)制子疫苗及其應(yīng)用。本發(fā)明是通過引物擴(kuò)增出高致病性豬藍(lán)耳病病毒XH株的GP5和M基因，利用融合PCR的方法，在兩個基因中間插入FMDV-2A的序列，從而得到G-2A-M片段，最后通過SpeI和SalI兩個酶切位點(diǎn)克隆到JpJEV-REP；另外，為了使M蛋白能夠產(chǎn)生真實(shí)的N末端，G-2A-M片段的下游插入了IRES序列(G-2A-M-IRES)，最后利用SalI-HF和SpeI兩個酶切位點(diǎn)插入到pJEV-REP中，最終構(gòu)建基于JEV復(fù)制子并且能夠表達(dá)GP5和M蛋白的高致病性藍(lán)耳病疫苗。
文檔編號A61K39/12GK102247606SQ201110135690
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者亓文寶, 廖明, 李紅梅, 臧富玉, 陳孝明 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)