專利名稱：傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的制備方法，另外還涉及該蛋黃抗體的用途。
上述單克隆抗體(簡稱單抗)或多單克隆抗體(簡稱多抗)作為傳染性疾病的診斷劑或檢測劑，近年來已在醫(yī)學和生物學領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。該類方法的原理是基于單抗或多抗對相應(yīng)傳染性疾病病原體相關(guān)抗原的高特異性識別能力而設(shè)計的，結(jié)合以相應(yīng)的標記物(酶標、金標、硒標、熒光、發(fā)光和放射性標記等)而顯示傳染性疾病病原體相關(guān)抗原的存在與否及其量的多少。
單抗作為治療劑的研究也于近年獲得重要進展。單抗藥物(monoclonal antibody agents)可應(yīng)用于治療腫瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾患，尤其是用于傳染性疾病的治療，已顯示出良好的前景。
抗體藥物一般包括兩類，一是抗病原體單抗或多抗；二是抗病原體單抗或多抗偶聯(lián)物，或稱免疫偶聯(lián)物(1mmunoconjugate)。免疫偶聯(lián)物分子由單抗或多抗與“彈頭”藥物兩部分構(gòu)成，故稱為導(dǎo)向藥物，又稱為生物導(dǎo)彈或“魔彈”(magic bullets)，與之相對應(yīng)的治療方法稱為導(dǎo)向治療。單抗或多抗所針對的靶標通常為病原體表面的相關(guān)抗原或特定的受體。用作“彈頭”的物質(zhì)主要有三類，即放射性核素、藥物和毒素，其與單抗或多抗連接分別構(gòu)成放射免疫偶聯(lián)物、化學免疫偶聯(lián)物和免疫毒素。自80年代以來對抗病原體尤其是抗腫瘤單抗藥物進行了大量研究，特別是自1997年以來，Rituxan、Herceptin在美國相繼獲批準用于臨床腫瘤治療，單抗藥物的研究與開發(fā)有了新的發(fā)展勢頭，成為生物技術(shù)藥物的新熱點(甄永蘇，單克隆抗體藥物治療腫瘤的研究現(xiàn)狀與展望，中國醫(yī)學科學院學報，2000，229-12)。
盡管單抗藥物的臨床研究結(jié)果已為其應(yīng)用于治療腫瘤展示出良好的前景，但仍有許多問題需要進一步研究解決(Nguyen DT，Amess JA，Doughty H，et al.IDEC-C2B8 anti-CD20(rituximab)immunotherapy in patients with low-grade non-Hodgkin′s lymphoma and lymphoproli ferative disordersevaluation of response on 48 patients.Eur J Haematol，1999，6276-82)。單抗藥物存在的問題主要涉及免疫學和藥理學兩方面。免疫學方面的問題關(guān)鍵是人抗鼠Ig抗體(HAMA)反應(yīng)，因為多年來用于臨床研究的單抗藥物多數(shù)使用小鼠單抗制備，往往導(dǎo)致HAMA反應(yīng)。此外，病原體在抗原性方面的異質(zhì)性，病原體的抗原性調(diào)變等也能影響單抗藥物的療效。藥理學方面的問題主要是到達病原體的藥量不足。單抗藥物在體內(nèi)運送過程中受多種因素影響。由于它是異體蛋白，會被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，有相當數(shù)量將積聚于肝、牌和骨髓；再者就是機體對該異體蛋白產(chǎn)生抗體而降低其效力。單抗藥物是大分子物質(zhì)，通過毛細血管內(nèi)皮層以及穿透病原體均受到限制。(甄永蘇，單克隆抗體藥物治療腫瘤的研究現(xiàn)狀與展望，中國醫(yī)學科學院學報，2000，229-12)。
傳染性疾病免疫治療是利用病原體抗原進行主動免疫來激發(fā)、增強機體對病原體的主動特異性免疫反應(yīng)。目前所研究的病原體疫苗主要是基因工程疫苗、肽疫苗、核酸疫苗、抗獨特型抗體疫苗。其中a病原體基因工程疫苗是通過基因重組技術(shù)，將目的基因?qū)胧荏w細胞而制備的疫苗。b肽疫苗是基于在免疫反應(yīng)中抗原在胞漿內(nèi)降解為短肽，最后形成肽-MHC-TCR復(fù)合體最終激發(fā)細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應(yīng)。c核酸疫苗是由編碼能引起保護性免疫反應(yīng)的抗原基因片段和載體構(gòu)建而成的，包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前研究較多的為DNA疫苗。核酸疫苗能夠同時刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，誘導(dǎo)許多亞單位疫苗不能誘導(dǎo)的CTL效應(yīng)。d抗獨特型抗體疫苗(Ab2疫苗)是根據(jù)抗獨特型抗體具有模擬抗原及免疫調(diào)節(jié)的雙重作用，同時能克服機體免疫抑制，打破免疫耐受故能代替病原體抗原誘發(fā)特異性主動免疫反應(yīng)(Bhattacharya CM，Mukerjee S，biddle W，et alMurine monoclonal anti-idiotype antibldy as a potential netword antigen for human carcinoembryonicantigen.J Immumol，1990，1452758)。
在上述病原體疫苗免疫治療方法中，由于病原體抗原的抗原性強弱不同，且病原體宿主經(jīng)常處于免疫抑制狀態(tài)，難以激發(fā)有效的抗病原體反應(yīng)。盡管抗獨特型抗體的研究已取得許多進展，但事物總是兩方面的。Ab2疫苗應(yīng)用存在許多困難，因為Ab2β雖能模擬小分子多肽抗原，卻難以精確反映大分子蛋白質(zhì)抗原的決定簇，尤其是Ab2β單抗。再者由于病原體抗原極其復(fù)雜，常發(fā)生調(diào)變等，制備廣譜的病原體特異性獨特型疫苗難度很大。更重要的是目前使用的Ab2β主要來自鼠雜交瘤細胞，為異種蛋白，能激發(fā)人免疫系統(tǒng)產(chǎn)生人抗鼠Ig抗體(HAMA)，發(fā)生中和反應(yīng)并產(chǎn)生毒性免疫復(fù)合物，而降低療效，嚴重時可引起血清病反應(yīng)。
鑒于以上技術(shù)方案所存在的諸多問題，為了避免或減少HAMA反應(yīng)，現(xiàn)通常是使鼠源性單抗人源化或研制完全的人源抗體。單抗人源化主要是通過基因工程技術(shù)制備嵌合抗體(chimericantibody)或改形抗體(reshaping antibody)。嵌合抗體是將Fc段置換為人源性，其它部分仍為鼠源性。改形抗體是指除互補決定區(qū)(CDR)為鼠源性外，其它部分均為人源性。使偶聯(lián)物分子小型化，以提高藥物對病原體的滲透力，研制高效單抗藥物。局部注射以提高單抗藥物在病原體部位的濃度。多種抗體混合應(yīng)用以彌補單抗的異質(zhì)性問題。其中鼠源性單抗人源化和研制完全的人源抗體具有較高的技術(shù)難度，難于普及應(yīng)用。
禽類尤其是雞在系統(tǒng)發(fā)育上與哺乳動物有很大差異，雞的免疫球蛋白與哺乳動物免疫球蛋白在免疫學特性上也有很大不同。雞的免疫系統(tǒng)能識別更多的免疫反應(yīng)位點和更多的抗原決定簇，因此雞免疫系統(tǒng)對哺乳動物的蛋白或生物分子能產(chǎn)生具有更高效價和親和力的特異性抗體。雞免疫系統(tǒng)針對于外源性蛋白所產(chǎn)生的IgY不僅具有更高的免疫特異性，更重要的是這種特異性IgY主要儲存在雞蛋黃中，因此可利用下蛋母雞作為免疫反應(yīng)器來大量生產(chǎn)具有重要臨床應(yīng)用價值的抗體藥物。
眾所周知雞蛋作為人類的常用食品和化妝品原料，無論內(nèi)服和外用均對人體無任何生物毒性和不良作片。因此，利用禽類作為免疫反應(yīng)器來大量生產(chǎn)抗體藥物，并應(yīng)用于傳染性疾病的診斷和免疫治療，將具有極廣闊的應(yīng)用前景。以傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY為原料制備的免疫藥物和抗獨特型抗體疫苗(Ab2疫苗)可以很好地解決上述單抗偶聯(lián)物或上述病原體疫苗所存在的HAMA反應(yīng)和異質(zhì)性問題。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于克服上述缺點與不足，提供一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的制備方法，包括針對于病原體的蛋黃多克隆抗體IgY、抗獨特型抗體和病原體特異性表達抗原的制備方法，尤其是針對與多重病原體的蛋黃多克隆抗體IgY、抗獨特型抗體和病原體特異性表達抗原中的多重組合物的制備方法，另外還涉及該蛋黃抗體的用途即采用該蛋黃抗體制備相關(guān)藥物、食品或保健品。技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的制備方法是利用禽類作為免疫反應(yīng)器，通過將病原體特異性免疫原(包括病原體、純化或重組抗原或疫苗瘤苗、病原體特異性DNA或mRNA及其與相應(yīng)載體組成的重組體、針對于病原體特異性抗原的單克隆或多克隆抗體)或其組合物單獨或聯(lián)合注射給產(chǎn)蛋禽類尤其是雞，使其產(chǎn)生針對于病原體特異性免疫原的蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體(包括Ab2α和Ab2β)或病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物而被大量地輸送到蛋黃中儲存，然后無創(chuàng)性的利用蛋黃提純所需要的病原體抗體(包括病原體特異性蛋黃抗體IgY、病原體特異性表達抗原和抗獨特型抗體Ab2α和Ab2β中的任一種或其組合物)。利用該蛋黃抗體中的IgY抗體為主要原料可制備成針對于病原體特異性抗原的免疫診斷藥劑和免疫治療藥劑，包括病原體體外診斷試劑、體內(nèi)導(dǎo)向診斷試劑和特異性蛋黃抗體免疫治療劑以及特異性蛋黃抗體偶聯(lián)藥物或毒素的導(dǎo)向藥物即生物導(dǎo)彈；利用該蛋黃抗體中的病原體特異性表達抗原可制備成針對于病原體的免疫診斷藥劑和免疫治療藥劑，包括傳染性疾病體外診斷試劑和病原體特異性疫苗瘤苗；利用該蛋黃抗體中的抗獨特型抗體Ab2α和Ab2β為主要原料可制備成針對于傳染性疾病體病原體的免疫診斷藥劑和免疫治療藥劑，包括傳染性疾病體外診斷試劑、體內(nèi)導(dǎo)向診斷試劑(主要采用Ab2α)和抗獨特型抗體Ab2α偶聯(lián)藥物或毒素的導(dǎo)向藥物即抗獨特型生物導(dǎo)彈和抗獨特型抗體疫苗(主要采用Ab2β)；用于傳染性疾病的診斷、免疫治療和導(dǎo)向治療。另外該蛋黃抗體還可作為添加劑添加于食品、飲料及保健品中，用于傳染性疾病的預(yù)防及早期預(yù)防性治療。
由于采用本發(fā)明方法制備傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體，利用雞免疫系統(tǒng)對異源性蛋白或生物分子能產(chǎn)生具有更高效價和親和力的特異性抗體，可誘導(dǎo)高滴度的特異性抗病原體抗原的抗體，且具有成本低、產(chǎn)量高、特異性強、決定簇廣并能進行集約化大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點，可實現(xiàn)針對與多重病原體的蛋黃多克隆抗體IgY、抗獨特型抗體和病原體特異性表達抗原中的多重組合物的一次性制備，更重要的是該蛋黃抗體能夠很好地解決上述鼠源性單抗偶聯(lián)物或病原體疫苗所存在的HAMA反應(yīng)和異質(zhì)性問題，且對人體無毒副作用，具有較好的安全性。另外，本發(fā)明所制備的傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體或其組合物可用作傳染性病原體相關(guān)診斷試劑的原料，尤其是傳染性病原體相關(guān)生物芯片的原料；再者就是本發(fā)明所制備的傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體或其組合物能夠在被動免疫和主動免疫兩方面共同發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)和治療作用。本發(fā)明適用于傳染性疾病的免疫診斷、免疫治療和預(yù)防，尤其適用于對人類具有極大危害性傳染病如艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、結(jié)核、幽門螺桿菌性胃炎、梅毒、淋病等性傳播性疾病、病毒性腸炎、病毒性肺炎、病毒性腦炎、支原體、衣原體肺炎、斑疹傷寒、皰疹、風疹流感及寄生蟲感染等疾病的被動免疫和主動免疫治療，將具有極其廣闊的應(yīng)用前景。
為了進一步公開本發(fā)明，下就對本發(fā)明進行更進一步的詳細描述。
一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的制備方法，其特征在于以產(chǎn)蛋禽類尤其是雞作為免疫反應(yīng)器，用一種或多種純化或滅活的病原體抗原或通過基因工程技術(shù)重組的病原體特異性抗原或疫苗瘤苗或病原體特異性DNA或mRNA及其與相應(yīng)載體組成的重組體或針對于病原體特異性抗原的單克隆或多克隆抗體或其脂質(zhì)體復(fù)合物作為免疫原，分別單獨進行或多種聯(lián)合進行禽類尤其是雞的多次重復(fù)免疫注射，然后再以不完全佐劑進行追加強化反應(yīng)，待5-20天后禽類尤其是雞的產(chǎn)蛋中即有針對于上述病原體免疫原的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體或病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物存在和儲存。其具體步驟包括a)病原體免疫原或其組合物進行多次免疫注射禽類優(yōu)選為雞。在此所述的病原體免疫原是采用純化的病原體抗原或通過滅活的病原體、通過基因工程技術(shù)重組的病原體特異性抗原或疫苗瘤苗、通過提取純化的病原體特異性裸DNA或mRNA及其與相應(yīng)載體組成的重組體、病原體特異性抗原的單克隆或多克隆抗體，另外還包括上述病原體免疫原的脂質(zhì)體微粒甚至是納米微粒的免疫注射，借助于脂質(zhì)體對組織和細胞的親和性以強化免疫效果；所述禽類包括雞、鴨、鵝、鵪鶉，首選是雞；注射部位包括肌肉、皮下、皮內(nèi)、血管和生殖腔囊；注射方法包括將上述病原體免疫原單獨進行注射和多種病原體免疫原聯(lián)合進行多次重復(fù)免疫注射，其中所述的多種病原體免疫原聯(lián)合進行免疫注射包括用不同種類和來源的病原體抗原、基因重組病原體特異性抗原或疫苗瘤苗、病原體特異性裸DNA或mRNA及其重組體中的任一種或其組合物；還包括不同種類和來源的病原體特異性單克隆或多克隆抗體中的任一種或其組合物；所述的免疫原注射量為1-2ml(免疫原量10-500μg/ml+等量不完全福氏佐劑，其中抗體Ab1的用量為100～2000μg/ml+等量不完全福氏佐劑)；所述的病原體包括病毒、衣原體、支原體、立克次氏體、細菌、螺旋體、真菌和原蟲、蠕蟲、線蟲等人體寄生蟲中的任一種或其組合；所述傳染性疾病病原體包括艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、結(jié)核、幽門螺桿菌性胃炎、梅毒、淋病等性傳播性疾病、病毒性腸炎、病毒性肺炎、病毒性腦炎、支原體、衣原體肺炎、斑疹傷寒、皰疹、風疹流感及寄生蟲感染等疾病的病原體中的任一種或其組合。
b)上述病原體免疫原用不完全佐劑進行追加免疫反應(yīng)。
c)待5-20天后禽類尤其是雞的產(chǎn)蛋中即有針對于上述病原體免疫原的蛋黃抗體存在和儲存。其中所述的蛋黃抗體包括針對于上述病原體抗原、病原體、重組病原體抗原或疫苗瘤苗或其脂質(zhì)體或納米微粒的蛋黃多克隆抗體IgY中的任一種或其組合物；針對于病原體特異性裸DNA或mRNA及其重組體或其脂質(zhì)體或納米微粒的病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物；針對于病原體特異性單克隆或多克隆抗體或上述蛋黃多克隆抗體IgY或其脂質(zhì)體或納米微粒的抗獨特型抗體Ab2α和Ab2β中的任一種或其組合物。
本發(fā)明用上述病原體免疫原注射免疫產(chǎn)蛋禽類尤其是雞，并以所產(chǎn)蛋黃作為針對于上述病原體免疫原的抗病原體抗體的來源，該類方法具有很多優(yōu)點如禽類尤其是雞易于飼養(yǎng)，費用不高，收集產(chǎn)蛋方便，無需抽動物血，無損傷，符合現(xiàn)代動物保護規(guī)則；另外還具有產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)所需抗原量小的優(yōu)點，高度保守的異源性蛋白質(zhì)對種系發(fā)生學上距離較遠的禽類尤其是雞通常有較強的免疫原性。
一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的制備方法，其特征還在于該蛋黃抗體的提取純化方法是采用水稀釋法、反復(fù)凍融法或硫酸銨、硫酸鈉、PEG、硫酸葡聚糖、藻酸鈉或辛酸沉淀或浸提、萃取、濃縮、膜過濾的方法從上述禽類蛋黃尤其是雞蛋黃中提取純化針對于上述病原體免疫原的多克隆抗癌抗體IgY或抗獨特型抗體或病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物，然后將該純化的蛋黃抗體添加相應(yīng)輔料包括海藻糖而制備成藥劑學上的任意劑型包括片劑、針劑、口服液和噴霧劑。其具體步驟包括a)取禽蛋尤其是雞蛋去殼取黃，除去粘附于蛋黃膜上的蛋白組分，然后將蛋黃置于滅菌蒸餾水中，反復(fù)洗滌三次，進一步除去蛋黃膜上的蛋自組分，瀝干后刺破蛋黃膜，收集蛋黃。
b)將上述收集蛋黃充分攪拌均勻后，加入蛋黃勻漿5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，制成稀釋蛋黃液。在該稀釋蛋黃液中海藻糖的重量百分比是5-30％。
c)將上述稀釋蛋黃液置于冰盒(-20℃)冰凍1-5小時，然后取出于室溫復(fù)融并低速離心(500-1000r/min)后瀝出收集上清液，然后再向沉淀物中加入2-5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，充分混勻溶解沉淀物，依上法再次凍融收集上清液，如此反復(fù)凍融3-5次，合并收集各次得到的上清液備用。
d)向上述收集上清液中按比例加入硫酸銨、硫酸鈉、PEG、硫酸葡聚糖、藻酸鈉或辛酸沉淀劑中的任一種或其復(fù)合物，離心收集其沉淀物，該沉淀物中即含有針對于上述病原體免疫原的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體或病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物。批量制備的病原體相關(guān)蛋黃抗體，每只雞蛋可提取57～171mg的病原體特異性蛋黃抗體，平均每只雞蛋可提取89mg，其純度為95％。
e)將上述沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后透析或超濾濃縮或凝膠層析，進一步分離純化針對于上述病原體免疫原的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體或病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物。
f)向上述純化的蛋黃抗體按比例添加相應(yīng)輔料，將其制備成藥劑學上的任意劑型包括片劑、針劑、口服液和噴霧劑。在此所述的輔料包括海藻糖。
一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的制備方法，其特征還在于該蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α的修飾處理方法是采用偶聯(lián)或共價結(jié)合放射性核素、藥物和毒素及其他細胞毒性物質(zhì)的方法制備免疫導(dǎo)向藥物或生物導(dǎo)彈；是采用偶聯(lián)或共價結(jié)合放射性核素、發(fā)光物質(zhì)、膠體金或膠體硒或酶的方法制備體內(nèi)免疫診斷藥劑和體外免疫診斷試劑包括免疫組化試劑和生物芯片；是采用向上述蛋黃抗體尤其是抗獨特型抗體Ab2β或病原體特異性表達抗原中添加不完全佐劑或其他組分的方法制備病原體特異性疫苗(包括抗獨特型抗體疫苗和多肽疫苗)。
導(dǎo)彈的主要部件一是能追蹤目標的導(dǎo)航系統(tǒng)，二是摧毀特定目標的炸彈。應(yīng)用這一原理制備出一種能追蹤病原體而又能專一性地殺傷病原體的“武器”，即生物導(dǎo)彈，它的基本部件是能特異地識別病原體抗原目標的抗體以及在抗體的末端接上殺傷病原體的毒性藥物。這樣從理論上講，只要能研制出可識別病原體的抗體，并使它帶上毒性藥物就可大功告成。但事實上并不那么簡單，首先是抗體問題，早期人們是用純度及特異性相對較高的病原體抗原免疫小鼠后的完整抗體(即由識別抗原簇的Fab片段和Fc片段所組成的免疫球蛋白)，使它的“尾端”(Fc片段)攜帶上放射性核素碘(125I)；1975年雜交瘤技術(shù)的建立及單克隆抗體的問世，使單抗與放射性核素的結(jié)合，推動了導(dǎo)向治療的進展。然而，經(jīng)過一段時間的實驗，單抗與多抗在體內(nèi)治療的結(jié)果，并沒有明顯的差別，其主要原因是①單抗和多抗都是完整抗體，它們一旦進入機體，就會被正常組織交叉吸附，不能相對集中地到達靶標；而且不容易清除和排出體外；②由于完整抗體的分子量大，不易通過機體的生理屏障(如結(jié)締組織等)進入病原體中心部位；③由于完整的抗體都來源于小鼠，對人體來說是一種異源性蛋白，所以可在體內(nèi)產(chǎn)生抗抗體而被中和。由于存在以上問題，因此使完整抗體用于導(dǎo)向治療受到限制。
根據(jù)以上存在的問題，近幾年來研究人員已設(shè)法研究制備出應(yīng)用小分子量的抗體片段，而且設(shè)法用人-人雜交瘤來制備人-人單克隆抗體，目前又用基因工程的方法來制備出基因工程抗體，這是一種不含F(xiàn)c片段的Fab小分子多肽，并建立了雙功能抗體技術(shù)。后者有特異性識別的雙臂(即把兩個Fab片段結(jié)合在一起)，因此有雙重識別能力，即既可以與病原體結(jié)合，又可與藥物彈頭相連接。由于基因工程抗體不含F(xiàn)c片段，因此減少了非特異吸附，并可將鼠源性成分減少到最低限度；小分子的基因工程產(chǎn)物，有利于殺傷物質(zhì)進入病原體內(nèi)部且不易被宿主識別為異物而產(chǎn)生抗抗體；這種雙功能抗體，使彈頭直接命中病原體，若將雙功能抗體與LAK，TIL細胞聯(lián)合應(yīng)用，則可獲得更大的效應(yīng)，從而有效地控制疾病的發(fā)展。但該類方法均有較高的技術(shù)難度，難于推廣。
本發(fā)明就是為了克服以上問題而利用傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α的修飾處理即采用其偶聯(lián)或共價結(jié)合放射性核素、藥物和毒素及其他細胞毒性物質(zhì)的方法制備免疫導(dǎo)向藥物或生物導(dǎo)彈。其具體步驟包括a)傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α的酶分解或偶聯(lián)活性基團預(yù)修飾處理，其中酶分解是利用胃蛋白酶或無花果蛋白酶將傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α分解，再用二巰基蘇糖醇或β-巰基乙醇還原為Fab小片斷，以使其具有更好的組織穿透力；或用不同的活化試劑將傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α及其Fab小片斷上的氨基或羧基或巰基或醛基活化，如用1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)把其變成活潑酯，然后再同各種不同的藥物分子偶聯(lián)。
b)偶聯(lián)藥物的預(yù)修飾處理包括將放射性核素、藥物和毒素分子用不同的活化試劑活化，如用1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)把其變成活潑酯，如此采用類似公知共用的方法，可以分別把含有羥基、氨基、醛基、肼基、巰基等基團的偶聯(lián)藥物活化，以使其能夠與傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α及其Fab小片斷發(fā)生共價結(jié)合。
c)傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α及其Fab小片斷與已活化處理的偶聯(lián)藥物包括將放射性核素、藥物和毒素分子共價結(jié)合而成為傳染性疾病特異性免疫導(dǎo)向藥物或生物導(dǎo)彈。
本發(fā)明是采用傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α的修飾處理即采用偶聯(lián)或共價結(jié)合放射性核素、發(fā)光物質(zhì)、膠體金或膠體硒或酶的方法制備體內(nèi)免疫診斷藥劑和體外免疫診斷試劑包括免疫組化試劑和生物芯片。其具體步驟包括a)將傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α采用公知共用的方法進行放射性核素、發(fā)光物質(zhì)、膠體金或膠體硒或酶標記而制備其相應(yīng)的標記物。
b)將傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α的放射性核素、發(fā)光物質(zhì)、膠體金或膠體硒或酶標記物中的任一種配合其他組分制備體內(nèi)免疫診斷藥劑和體外免疫診斷試劑(包括免疫組化試劑和生物芯片)。
本發(fā)明是采用傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體中的蛋黃抗體IgY制備病原體特異性免疫治療劑。其具體步驟包括向上述中蛋黃抗體IgY添加不完全佐劑及其他組分，然后再進行免疫注射，免疫機體產(chǎn)生針對于傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY的抗獨特型抗體Ab2β，從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗病原體的特異性免疫應(yīng)答。
本發(fā)明是采用傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體中的抗獨特型抗體Ab2β或病原體特異性表達抗原制備特異性病原體疫苗。其具體步驟包括向上述抗獨特型抗體Ab2β、病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物中添加不完全佐劑及其他組分制備特異性病原體疫苗。在此所述的抗獨特型抗體Ab2β疫苗是采用向禽類尤其是雞注射病原體特異性單克隆或多克隆抗體尤其是注射蛋黃抗體中的傳染性病原體相關(guān)抗體IgY而制備的。
針對外來抗原的抗體分子(Ab1)可變區(qū)上獨特型(Id)可刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗Id抗體(Ab2)。其中Ab2β具有與外來抗原相似的氨基酸排列順序或空間構(gòu)型，它能夠在體內(nèi)模擬始動抗原的作用，故被認為是外部抗原在機體免疫系統(tǒng)中的＂內(nèi)影像＂(internal image)。應(yīng)用Ab2β的這一特性，可有目的地制備Ab2β，將其作為抗原的替代物用于誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗病原體的特異性免疫應(yīng)答，即所謂抗獨特型疫苗(anti-idiotype vaccine)。它是用抗Id型抗體(Ab2)代替抗原作為免疫原，故該類疫苗特別適用于目前還不能培養(yǎng)或培養(yǎng)很困難而產(chǎn)量又很低的病原體；直接用病原體制苗有危險的病原體；以及免疫原性低且不能用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的病原體多糖類抗原。
一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的制備方法，其特征還在于將上述蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α制備成脂質(zhì)體微粒甚至是納米微粒然后再偶聯(lián)上述細胞毒性物質(zhì)成免疫導(dǎo)向藥物的方法，以增加其對病灶的親和性和滲透性；將上述抗獨特型抗體Ab2β或病原體特異性表達抗原制備成脂質(zhì)體微粒甚至是納米微粒的特異性病原體疫苗的方法。
脂質(zhì)體技術(shù)是被喻為“生物導(dǎo)彈”的第四代靶向給藥技術(shù)，脂質(zhì)體屬于納米級藥物載體，該技術(shù)利用脂質(zhì)體的獨有特性，將毒副作用大、在血液中穩(wěn)定性差、降解快的藥物包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，根據(jù)人體病灶部位血管內(nèi)皮細胞間隙較大，脂質(zhì)體藥物可透過此間隙到達病灶部位，在病灶部堆積釋放，從而達到定向給藥。脂質(zhì)體主要輔料為磷脂，而磷脂在血液中消除極為緩慢，因此脂質(zhì)體藥物在血循環(huán)系統(tǒng)保留時間長，使病灶部位得到充分治療的效果。利用該技術(shù)可將一大批已知高毒性活性藥物安全有效地應(yīng)用于臨床治療，其中有抗癌藥、抗生素類藥、抗真菌類藥、抗寄生蟲類藥、蛋白質(zhì)或多肽類藥物，極大地提高了臨床治療水平，減輕了患者的病痛。同時可將單克隆抗體連接到脂質(zhì)體上，借助于抗原與抗體的特異反應(yīng)，將載藥脂質(zhì)體定向送入。本發(fā)明就是利用上述傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體包括蛋黃抗體IgY、抗獨特型抗體Ab2α、抗獨特型抗體Ab2β和病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物所制備的脂質(zhì)體微粒甚至是納米微粒，能夠有效到達靶區(qū)，共同發(fā)揮其主動和被動免疫治療作用和對不同病原體共同發(fā)揮免疫治療作用。
一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的制備方法，其特征還在于將上述蛋黃抗體中的具有相同或相近作用的兩種或兩種以上組分同其他輔料按一定配比混合成組合物，使相應(yīng)蛋黃抗體組分針對于病原體發(fā)揮協(xié)同作用。
一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的用途，其特征在于上述蛋黃抗體中的任一種或任意組合的任意劑型單獨或聯(lián)合用于傳染病的診斷、治療和預(yù)防。
人體對傳染病有一定的免疫力，但不同的人，免疫力有強有弱。免疫治療是設(shè)法調(diào)動人體內(nèi)各種積極防御因素，提高機體的免疫力，以消除藥物治療后殘余的病原體，以防止疾病的復(fù)發(fā)和惡化。傳染病的免疫治療概括起來可分為特異性免疫治療和非特異性免疫治療兩大類。免疫治療是一種扶正措施，副作用少，所以易受病人歡迎。傳染病的被動免疫治療是指給機體輸注外源的免疫效應(yīng)物質(zhì)，由這些外源性效應(yīng)物質(zhì)在機體內(nèi)發(fā)揮治療作用。目前主要有以下兩大類a)抗病原體導(dǎo)向治療即利用高度特異性的單克隆抗體為載體，將細胞毒性的殺傷分子帶到病灶處，可特異地殺傷病原體。目前根據(jù)所用的殺傷分子的性質(zhì)不同，將傳染病的導(dǎo)向治療分為①放射免疫治療，將高能放射性核素與單克隆抗體連接，可將放射性核素帶至病灶殺死病原體；②抗體導(dǎo)向化學療法，抗病原體藥物與單抗通過化學交聯(lián)組成的免疫偶聯(lián)物，可以將藥物導(dǎo)向病灶，殺傷病原體，常用的有氨甲蝶呤(MTX)、阿霉素等；③免疫毒素療法(immunotoxintherapy)，將毒素與單克隆抗體相連，制備的免疫毒素對病原體有特異性的強殺傷活性。常用的毒素有兩類一類是植物毒素，包括篦麻籽毒素(RT)、相思子毒素(abrin)、苦瓜毒素(MD)、氧化苦參堿(OXY)等。另一類是細胞毒素，包括白喉毒素(DT)、綠膿桿菌外毒素(PE)。但目前所用的單克隆抗體多為鼠源單克隆抗體，應(yīng)用于人體后會產(chǎn)生抗鼠源單克隆抗體的抗體，使其不能反復(fù)應(yīng)用影響了其療效。用基因工程的方法，使鼠源抗體人源化可減少這個問題，但技術(shù)難度較高，廣泛推廣受限。
b)過繼免疫療法(adoptive immunotherapy)是取對病原體有免疫力的供者淋巴細胞轉(zhuǎn)輸給患者，或取患者自身的免疫細胞在體外活化、增殖后，再轉(zhuǎn)輸入患者體內(nèi)，使其在患者體內(nèi)發(fā)揮抗病原體作用。過繼免疫療法的效應(yīng)細胞具有異質(zhì)性，如CTL、NK細胞、巨噬細胞、淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)和浸潤性淋巴細胞(TIL)等都在殺傷病原體中起作用。
一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的用途，其特征還在于上述蛋黃抗體中的多克隆抗癌抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α及其熒光、發(fā)光、酶、金屬標記物中的任一種用于配制體外用免疫診斷試劑；上述蛋黃抗體中的多克隆抗癌抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α及其脂質(zhì)體甚至納米微粒的放射性核素標記物用于配制體內(nèi)免疫導(dǎo)向診斷試劑。上述所述的免疫診斷試劑包括免疫組化試劑和生物芯片。
一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的用途，其特征還在于上述蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α及其脂質(zhì)體甚至納米微粒用于制備治療性免疫制劑；上述蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α及其脂質(zhì)體甚至納米微粒與放射性核素、藥物和毒素的偶聯(lián)物用于制備免疫導(dǎo)向藥物或生物導(dǎo)彈。
一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的用途，其特征還在于上述蛋黃抗體中的病原體特異性表達抗原用于制備多肽疫苗；上述蛋黃抗體中的抗獨特型抗體Ab2β用于制備抗獨特型抗體疫苗。
特異性主動免疫治療是通過激活特定的免疫系統(tǒng)，達到消滅病原體的目的，這種治療并不影響周圍正常組織。從理論上講，由疫苗介導(dǎo)的特異性免疫治療，能夠激活特定的淋巴細胞(B細胞和(或)T細胞)反應(yīng)，產(chǎn)生即刻的抗病原體作用，并對將來的病原體產(chǎn)生記憶反應(yīng)。最初，利用病原體制備疫苗；后來，病原體抗原成為制備疫苗的材料。隨著分子生物學方法的進展，利用可表達抗原的基因修飾病原體抗原來增強免疫原性或利用修飾基因以分泌細胞因子等技術(shù)用于疫苗制備。同時，也可利用提純的病原體相關(guān)抗原、DNA編碼蛋白抗原和(或)蛋白衍生肽制備疫苗。疫苗接種的最終目的是激活免疫系統(tǒng)的某一部分，如抗體或淋巴細胞，來殺滅病原體。目前，特異性主動免疫治療有很多方法，如完整病原體與卡介苗等佐劑的混合物；用遺傳學方法改變病原體。另外，亦可用肽、黏蛋白和碳水化合物等單個抗原制備疫苗。許多重組疫苗可表達各種抗原如乙肝表面抗原。利用重組疫苗，其他基因(例如編碼協(xié)同刺激因子分子的基因)，亦可以病原體相關(guān)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。針對特異性抗體還可采用抗獨特型抗體，因為病原體抗原的抗原性不同，且病原體宿主經(jīng)常處于免疫抑制狀態(tài)，難以激發(fā)有效的抗病原體反應(yīng)。80年代以來，許多學者通過動物實驗證明用抗原內(nèi)影像型Ab2(又稱抗獨特型疫苗)能夠克服免疫抑制，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。免疫網(wǎng)絡(luò)理論認為，抗體(Ab1)分子上存在的獨特型(Id)抗原決定簇可以刺激機體產(chǎn)生A-Id抗體(Ab2)及Ab3等一系列抗體的產(chǎn)生，從而構(gòu)成一個復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)抗獨特型抗體與抗體獨特位反應(yīng)的特點和抗獨特型抗體的功能，可將A-Id分為Ab2α、Ab2β、Ab2γ、Ab2δ。其中Ab2β可識別Ab1上與抗原互補的決定簇，能完全抑制抗原與Id的結(jié)合。它具有類似抗原的結(jié)構(gòu)，可以＂模擬＂抗原，產(chǎn)生與抗原相同的生物學效應(yīng)，被認為是外部抗原在機體免疫系統(tǒng)中的“內(nèi)影像”(mternal image)。Ab2β具有下列特點；a)能特異性與不同種屬個體產(chǎn)生的抗體(Ab1)反應(yīng)；b)能特異性與不同類抗體(Ab1)反應(yīng)；c)Ab2β與抗原能競爭性地結(jié)合Ab1，二者之間存在競爭性抑制作用；d)能誘導(dǎo)不同種屬個體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。
具有內(nèi)影像特點的抗獨特型抗體能模擬病原體相關(guān)抗原誘導(dǎo)機體產(chǎn)生主動免疫應(yīng)答，其應(yīng)答過程極其復(fù)雜，但主要涉及體液免疫和細胞免疫兩方面。Ab2β作為胸腺依賴抗原(TD)激活輔助T淋巴細胞亞群(Th1和Th2)，分泌一系列細胞因子，如Th1細胞產(chǎn)生INF-γ、IL-10、TNF和IL-2；Th2細胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等。Th2細胞產(chǎn)生的細胞因子影響和促進B淋巴細胞分化和增殖，產(chǎn)生特異性抗體Ab3，Ab3一部分能與Ab1互相模擬，即具有與抗原結(jié)合性，稱之為抗病原體抗體(Ab1′)。總Ab3的產(chǎn)生已被證實與微小病原體病灶消退和/或病人病情好轉(zhuǎn)呈正相關(guān)。被激活的Th1細胞釋放細胞因子，如INF-γ可通過影響NK細胞及T細胞功能而發(fā)揮抗病原體效應(yīng)，IL-2可促進T細胞生長、克隆性擴增而增強機體的免疫功能，亦可誘導(dǎo)或促進多種細胞毒性細胞活性，如NK、CTL、LAK及TIL等，發(fā)揮免疫監(jiān)視及抗病原體效應(yīng)。同時IL-2還可協(xié)同刺激B細胞增殖及分泌抗體，與補體及效應(yīng)細胞相作用，發(fā)揮ADCC及CDC抗病原體作用(龔非力等，醫(yī)學免疫學，第二版，武漢科學出版社，2000)。人體內(nèi)免疫系統(tǒng)是一個處于自身動態(tài)平衡中的系統(tǒng)。在傳染病患者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)中，抗獨特型抗體是一個較關(guān)鍵的系統(tǒng)要素，用人為的方法改變抗獨特型抗體的質(zhì)量和數(shù)量，必然會使系統(tǒng)發(fā)生變化，再在更高的層次上達到新的平衡。使病原體免疫的系統(tǒng)平衡按照理論上預(yù)測的有利于患者的方向發(fā)展變化，在某種意義上這正是抗獨特型抗體應(yīng)用的關(guān)鍵所在。
本發(fā)明就是采用上述方法所制備的蛋黃病原體特異性表達抗原和抗獨特型抗體Ab2β作為病原體特異性疫苗而用于傳染病的特異性免疫治療，能夠激活特定的淋巴細胞(B細胞和(或)T細胞)反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的抗病原體作用，并對將來的病原體產(chǎn)生記憶反應(yīng)，激活機體免疫系統(tǒng)甚至重新調(diào)節(jié)機體免疫的系統(tǒng)平衡，調(diào)動體液免疫和細胞免疫作用，產(chǎn)生特異性病原體抗體或殺傷性淋巴細胞，來共同殺滅病原體，達到免疫性治療傳染病的目的。
一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的用途，其特征還在于上述蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY、病原體特異性表達抗原、抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β的任一種或任意組合用于制備預(yù)防傳染病的食品、飲料和保健品。即采用將本發(fā)明中的多克隆抗體IgY、病原體特異性表達抗原、抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β中的任一種或任意組合按一定配比添加于食品、飲料及保健品中，用于傳染病的預(yù)防及早期預(yù)防性治療。技術(shù)效果本發(fā)明就是針對以上問題利用傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體中的IgY抗體為主要原料制備成針對于病原體特異性抗原的免疫診斷藥劑和免疫治療藥劑，包括體外診斷試劑、體內(nèi)導(dǎo)向診斷試劑和特異性蛋黃抗體免疫治療劑以及特異性蛋黃抗體偶聯(lián)藥物或毒素的導(dǎo)向藥物即生物導(dǎo)彈；利用該蛋黃抗體中的病原體特異性表達抗原可制備成針對于病原體的免疫診斷藥劑和免疫治療藥劑，包括體外診斷試劑和特異性疫苗瘤苗和核酸疫苗；利用該蛋黃抗體中的抗獨特型抗體Ab2α和Ab2β為主要原料可制備成針對于病原體的免疫診斷藥劑和免疫治療藥劑，包括體外診斷試劑、體內(nèi)導(dǎo)向診斷試劑(主要采用Ab2α)和抗獨特型抗體Ab2α偶聯(lián)藥物或毒素的導(dǎo)向藥物即抗獨特型生物導(dǎo)彈和抗獨特型抗體疫苗(主要采用Ab2β)；用于傳染病的診斷、免疫治療和導(dǎo)向治療。另外該蛋黃抗體IgY和抗獨特型抗體還可作為添加劑添加于食品、飲料及保健品中，用于傳染病的預(yù)防及早期預(yù)防性治療，尤其是用于對人類具有極大危害性傳染病如艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、結(jié)核、幽門螺桿菌性胃炎、梅毒、淋病等性傳播性疾病、病毒性腸炎及流感等的被動免疫和主動免疫治療。
由于采用本發(fā)明方法制備傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體，利用雞免疫系統(tǒng)對異源性蛋白或生物分子能產(chǎn)生具有更高效價和親和力的特異性抗體，可誘導(dǎo)高滴度的特異性抗病原體的抗體，且具有成本低、產(chǎn)量高、特異性強、決定簇廣并能進行集約化大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點，可實現(xiàn)針對與多重病原體的蛋黃多克隆抗體IgY、抗獨特型抗體和病原體特異性表達抗原中的多重組合物的一次性制備，更重要的是該蛋黃抗體能夠很好地解決上述鼠源性單抗偶聯(lián)物或腫瘤疫苗所存在的HAMA反應(yīng)和異質(zhì)性問題，且對人體無毒副作用，具有較好的安全性。另外，本發(fā)明所制備的傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體或其組合物可用作傳染性病原體相關(guān)診斷試劑的原料，尤其是傳染性病原體相關(guān)生物芯片的原料；再者就是本發(fā)明所制備的蛋黃抗體及其組合物能夠在被動免疫和主動免疫兩方面共同發(fā)揮其免疫治療作用。本發(fā)明適用于傳染病的免疫診斷、治療和預(yù)防，尤其適用于對人類具有極大危害性傳染病如艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、結(jié)核、幽門螺桿菌性胃炎、梅毒、淋病等性傳播性疾病、病毒性腸炎及流感等的被動免疫和主動免疫治療。
實施例1用具有免疫活性的病原體特異性免疫原包括病原體特異性抗原、疫苗瘤苗、DNA或mRNA和抗體或其脂質(zhì)體復(fù)合物中的任一種或其復(fù)合物免疫產(chǎn)蛋禽類尤其是雞，然后再以不完全佐劑進行追加強化反應(yīng)，待5-20天后禽類尤其是雞的產(chǎn)蛋中即有針對于上述病原體免疫原的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體或病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物存在和儲存，其具體步驟包括取6月齡SPF純系萊航產(chǎn)蛋母雞于標準II級清潔級動物房飼養(yǎng)，每只雞于胸腹部多點注射上述病原體免疫原1-2ml(免疫原量10-500μg/ml+等量不完全福氏佐劑，其中抗體Ab1的用量為100～2000ug+等量不完全福氏佐劑)，2～4周后加強免疫注射3-5次，待5-20天后免疫母雞所產(chǎn)的免疫蛋中即含有病原體相關(guān)蛋黃抗體。
實施例2傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的制備 將上述免疫雞蛋去蛋清后的卵黃充分攪拌均勻后，加入蛋黃勻漿5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，然后置于冰盒(-20℃)冰凍1-5小時，取出于室溫復(fù)融并低速離心(500-1000r/min)后瀝出收集上清液，再向沉淀物中加入2-5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，充分混勻溶解沉淀物，依上法再次凍融收集上清液，如此反復(fù)凍融3-5次，合并收集各次得到的上清液加入硫酸鈉，使硫酸鈉的終濃度達10-30％，離心收集其沉淀物，并將該沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后對鹽透析后超濾濃縮、凝膠過濾、冷凍干燥即得到純化的病原體相關(guān)蛋黃抗體包括蛋黃多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體或病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物。實驗結(jié)果表明批量制備的病原體相關(guān)蛋黃抗體，每只雞蛋可提取57～171mg的病原體特異性蛋黃抗體，平均每只雞蛋可提取89mg，其純度為95％。
實施例3傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的檢測 乙型肝炎重組表面抗原特異性蛋黃抗體IgY的檢測采用ELISA間接法檢測，以乙型肝炎重組表面抗原液包被酶標板孔，采用辣根過氧化物酶標記的鼠抗雞IgY單抗作為二抗；特異性表達乙型肝炎表面抗原的檢測采用ELISA雙抗體夾心法，以乙肝表面抗體包被酶標板孔，采用辣根過氧化物酶標記的乙肝表面抗體作為標記抗體；乙型肝炎重組表面抗原特異性蛋黃抗獨特型抗體的檢測采用ELISA間接法，以乙肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY包被酶標板孔，采用辣根過氧化物酶標記的鼠抗雞IgY單抗作為二抗；上述ELISA檢測依常規(guī)操作進行。實驗結(jié)果表明乙型肝炎重組表面抗原特異性蛋黃抗體的效價在1∶1280-1∶10240之間，其中乙肝重組表面抗原特異性蛋黃抗體IgY的平均效價在1∶5120左右；特異性表達乙肝表面抗原的平均效價在1∶2560左右；乙型肝炎重組表面抗原特異性蛋黃抗獨特型抗體的平均效價在1∶5120左右。
實施例4傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的穩(wěn)定性試驗 病原體相關(guān)蛋黃抗體經(jīng)過濾除菌，以10mg/ml分裝小試管中，分別于-20℃冰凍、4℃和室溫保存，定期進行其效價檢測。實驗結(jié)果表明病原體相關(guān)蛋黃抗體于-20℃冰凍保存，其穩(wěn)定性至少可保持12個月以上；于4℃保存，其穩(wěn)定性至少可保持6個月以上；于室溫保存，其穩(wěn)定性至少可保持2個月以上。
實施例5乙肝重組表面抗原特異性蛋黃抗體IgY與氧化苦參堿的偶聯(lián)試驗 首先取葡聚糖1.0g，加入200mL蒸餾水后加高碘酸鈉0.3g，室溫下避光反應(yīng)過夜，使葡聚糖充分氧化為多醛基葡聚糖，蒸餾水充分透析后凍干；注射治療前2小時內(nèi)取多醛基葡聚糖10mg加入0.15mol/L(pH7.2)的磷酸緩沖液2mL中，加氧化苦參堿10mg，室溫下反應(yīng)24小時后，再加入已純化的乙肝重組表面抗原特異性蛋黃抗體IgY10mg，4℃攪拌反應(yīng)24小時；然后在上述反應(yīng)混合物中加硼氫化鈉0.2mg，在4℃下還原2小時，離心后經(jīng)Sephadex G-150層析柱過柱，收集第一峰即可用于治療。
實施例6治療效果觀察 通過對36例乙肝患者(其中慢性乙肝26例，活動性乙肝12例，乙肝病毒攜帶者8例)分別給予單獨藥物(干擾素300萬單位)、乙肝重組表面抗原特異性蛋黃抗體IgY-氧化苦參堿導(dǎo)向治療、乙肝重組表面抗原特異性蛋黃抗體IgY-氧化苦參堿和乙肝重組表面抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體Ab2β聯(lián)合治療并進行療效觀察和比較。實驗結(jié)果表明乙肝病毒表面抗原HBsAg轉(zhuǎn)陰率聯(lián)合治療組(71.2％)明顯高于導(dǎo)向治療組(67.5％)和單獨藥物組(12.4％)；乙肝病毒HBeAg轉(zhuǎn)陰率后兩組(89.4％)明顯優(yōu)于單獨藥物組(42.5％)；乙肝病毒HBV DNA轉(zhuǎn)陰率后兩組(59.2％)明顯優(yōu)于單獨藥物組(6.5％)后兩組患者血清ALT、DBIL及TNF-α水平明顯低于單獨藥物組。表明乙肝重組表面抗原特異性蛋黃抗體IgY-氧化苦參堿導(dǎo)向治療具有特異性強、毒副作用小等優(yōu)點；乙肝重組表面抗原特異性蛋黃抗體IgY-氧化苦參堿和乙肝重組表面抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體Ab2β聯(lián)合治療具有激活機體細胞及體液免疫的作用，從而達到對抗乙肝病毒保護肝臟組織細胞的目的。
權(quán)利要求
1.一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的制備方法，其特征在于以產(chǎn)蛋禽類尤其是雞作為免疫反應(yīng)器，用一種或多種純化的或采用基因工程技術(shù)重組的病原體特異性抗原或疫苗瘤苗或病原體特異性DNA或mRNA及其與之相應(yīng)載體組成的重組體或針對于病原體特異性抗原的單克隆或多克隆抗體或病原體或上述病原體免疫原的脂質(zhì)體復(fù)合物作為免疫原，分別單獨進行或多種聯(lián)合進行禽類尤其是雞的多次重復(fù)免疫注射，然后再以不完全佐劑進行追加強化反應(yīng)，待5-20天后禽類尤其是雞的產(chǎn)蛋中即有針對于上述病原體免疫原的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體或病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物存在和儲存。其具體步驟包括a)病原體免疫原或其組合物進行多次免疫注射禽類優(yōu)選為雞。在此所述的病原體免疫原是通過純化的病原體抗原或通過滅活的病原體、通過基因工程技術(shù)重組的病原體特異性抗原或疫苗瘤苗、通過提取純化的病原體特異性裸DNA或mRNA及其與相應(yīng)載體組成的重組體、病原體特異性抗原的單克隆或多克隆抗體，另外還包括上述病原體免疫原的脂質(zhì)體微粒甚至是納米微粒；所述禽類包括雞、鴨、鵝、鵪鶉，首選是雞；注射部位包括肌肉、皮下、皮內(nèi)、血管和生殖腔囊；注射方法包括將上述病原體免疫原單獨進行注射和多種免疫原聯(lián)合進行多次重復(fù)免疫注射，其中所述的多種病原體免疫原聯(lián)合進行免疫注射包括用不同種類和來源的病原體抗原、基因重組病原體特異性抗原或疫苗瘤苗、病原體特異性裸DNA或mRNA及其重組體中的任一種或其組合物；還包括不同種類和來源的病原體特異性單克隆或多克隆抗體中的任一種或其組合物；所述的免疫原注射量為1-2ml(免疫原量10-500μg/ml+等量不完全福氏佐劑，其中抗體Ab1的用量為100～2000μg/ml+等量不完全福氏佐劑)。所述的病原體包括病毒、衣原體、支原體、立克次氏體、細菌、螺旋體、真菌和原蟲、蠕蟲、線蟲等人體寄生蟲中的任一種或其組合；所述傳染性疾病病原體包括艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、結(jié)核、幽門螺桿菌性胃炎、梅毒、淋病等性傳播性疾病、病毒性腸炎、病毒性肺炎、病毒性腦炎、支原體、衣原體肺炎、斑疹傷寒、皰疹、風疹流感及寄生蟲感染等疾病的病原體中的任一種或其組合。b)上述病原體免疫原用不完全佐劑進行追加免疫反應(yīng)。c)待5-20天后禽類尤其是雞的產(chǎn)蛋中即有針對于上述病原體免疫原的蛋黃抗體存在和儲存。其中所述的蛋黃抗體包括針對于上述病原體抗原、病原體、重組病原體抗原或疫苗瘤苗及其脂質(zhì)體或納米微粒的蛋黃多克隆抗體IgY中的任一種或其組合物；針對于病原體特異性裸DNA或mRNA及其重組體及其脂質(zhì)體或納米微粒的病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物；針對于病原體特異性單克隆或多克隆抗體或上述蛋黃多克隆抗體IgY及其脂質(zhì)體或納米微粒的抗獨特型抗體Ab2α和Ab2β中的任一種或其組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的制備方法，其特征還在于上述病原體相關(guān)蛋黃抗體的提取純化方法是采用水稀釋法、反復(fù)凍融法或硫酸銨、硫酸鈉、PEG或辛酸沉淀或浸提、萃取、濃縮、膜過濾的的方法從上述禽類尤其是雞蛋黃中提取純化針對于上述病原體免疫原的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體或病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物，然后將該純化的病原體相關(guān)蛋黃抗體添加相應(yīng)輔料包括海藻糖而制備成藥劑學上的任意劑型包括片劑、針劑、口服液和噴霧劑。其具體步驟包括a)取禽蛋尤其是雞蛋去殼取黃，除去粘附于蛋黃膜上的蛋白組分，然后將蛋黃置于滅菌蒸餾水中，反復(fù)洗滌三次，進一步除去蛋黃膜上的蛋白組分，瀝干后刺破蛋黃膜，收集蛋黃。b)將上述收集蛋黃充分攪拌均勻后，加入蛋黃勻漿5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，制成稀釋蛋黃液。在該稀釋蛋黃液中海藻糖的重量百分比是5-30％。c)將上述稀釋蛋黃液置于冰盒(-20℃)冰凍1-5小時，然后取出于室溫復(fù)融并低速離心(500-1000r/min)后瀝出收集上清液，然后再向沉淀物中加入2-5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，充分混勻溶解沉淀物，依上法再次凍融收集上清液，如此反復(fù)凍融3-5次，合并收集各次得到的上清液備用。d)向上述收集上清液中按比例加入硫酸銨、硫酸鈉、PEG、硫酸葡聚糖、藻酸鈉或辛酸沉淀劑中的任一種及其復(fù)合物，離心收集其沉淀物，該沉淀物中即含有針對于上述病原體免疫原的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體或病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物。批量制備的病原體相關(guān)蛋黃抗體，每只雞蛋可提取57～171mg的病原體特異性蛋黃抗體，平均每只雞蛋可提取89mg，其純度為90-95％。e)將上述沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后透析或超濾濃縮或凝膠層析，進一步分離純化針對于上述病原體免疫原的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體或病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物。f)向上述純化的病原體相關(guān)蛋黃抗體按比例添加相應(yīng)輔料，將其制備成藥劑學上的任意劑型包括片劑、針劑、口服液和噴霧劑。在此所述的輔料包括海藻糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的制備方法，其特征還在于上述病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α的修飾處理方法是偶聯(lián)或共價結(jié)合放射性核素、藥物和毒素制備免疫導(dǎo)向藥物或生物導(dǎo)彈；是偶聯(lián)或共價結(jié)合放射性核素、發(fā)光物質(zhì)、膠體金或膠體硒或酶制備體內(nèi)免疫診斷藥劑和體外免疫診斷試劑包括免疫組化試劑和生物芯片；是向上述病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY中添加不完全佐劑制備病原體特異性免疫治療劑；是向上述病原體相關(guān)蛋黃抗體尤其是抗獨特型抗體Ab2β或病原體特異性表達抗原中添加不完全佐劑及其他組分制備病原體特異性疫苗。其具體步驟包括a)病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α的酶分解或偶聯(lián)活性基團預(yù)修飾處理，其中酶分解是利用胃蛋白酶或無花果蛋白酶將蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α分解，再用二巰基蘇糖醇或β-巰基乙醇還原為Fab小片斷，以使其具有更好的組織穿透力；或用相應(yīng)的活化試劑將蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α及其Fab小片斷上的氨基或羧基或巰基或醛基活化，然后再同各種不同的藥物分子偶聯(lián)。b)偶聯(lián)藥物的預(yù)修飾處理包括將放射性核素、藥物和毒素分子用相應(yīng)的活化試劑，分別把含有羥基、氨基、醛基、肼基、巰基等基團的偶聯(lián)藥物活化，然后再使其與病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α及其Fab小片斷發(fā)生共價結(jié)合。c)病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α及其Fab小片斷與已活化處理的偶聯(lián)藥物包括將放射性核素、藥物和毒素分子共價結(jié)合而制備病原體特異性免疫導(dǎo)向藥物或生物導(dǎo)彈。d)將病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α進行放射性核素、發(fā)光物質(zhì)、膠體金或膠體硒或酶標記而制備其相應(yīng)的標記物。e)將病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α的放射性核素、發(fā)光物質(zhì)、膠體金或膠體硒或酶標記物中的任一種配合其他組分制備體內(nèi)免疫診斷藥劑和體外免疫診斷試劑(包括免疫組化試劑和生物芯片)。f)向上述病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY中添加不完全佐劑及其他組分，然后再進行免疫注射，免疫機體產(chǎn)生針對于病原體相關(guān)蛋黃抗體IgY的抗獨特型抗體Ab2β，從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗病原體的特異性免疫應(yīng)答。g)向上述抗獨特型抗體Ab2β、病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物中添加不完全佐劑及其他組分制備病原體特異性疫苗(包括抗獨特型抗體疫苗和多肽疫苗)。h)向禽類尤其是雞注射病原體特異性單克隆或多克隆抗體尤其是注射病原體相關(guān)蛋黃抗體中的IgY抗體，制備所述的抗獨特型抗體Ab2β疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的制備方法，其特征還在于將上述蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α制備成脂質(zhì)體微粒甚至是納米微粒然后再偶聯(lián)上述細胞毒性物質(zhì)而制備免疫導(dǎo)向藥物的方法；將上述抗獨特型抗體Ab2β或病原體特異性表達抗原制備成脂質(zhì)體微粒甚至是納米微粒的病原體特異性疫苗的方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的制備方法，其特征還在于將上述蛋黃抗體中的具有相同或相近作用的兩種或兩種以上組分同其他輔料按一定配比混合成組合物，使相應(yīng)病原體相關(guān)蛋黃抗體組分針對于病原體發(fā)揮協(xié)同作用。
6.一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的用途，其特征在于上述蛋黃抗體中的任一種或任意組合的任意劑型單獨或聯(lián)合用于傳染病的診斷、治療和預(yù)防。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的用途，其特征還在于上述病原體相關(guān)蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α及其熒光、發(fā)光、酶、金屬標記物中的任一種用于配制體外用免疫診斷試劑；上述病原體相關(guān)蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α及其脂質(zhì)體甚至納米微粒的放射性核素標記物用于配制體內(nèi)免疫導(dǎo)向診斷試劑。上述所述的免疫診斷試劑包括免疫組化試劑和生物芯片。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的用途，其特征還在于上述病原體相關(guān)蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α及其脂質(zhì)體甚至納米微粒用于制備治療性免疫制劑；上述病原體相關(guān)蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α及其脂質(zhì)體甚至納米微粒與放射性核素、藥物和毒素的偶聯(lián)物用于制備免疫導(dǎo)向藥物或生物導(dǎo)彈。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的用途，其特征還在于上述病原體相關(guān)蛋黃抗體中的IgY抗體用于制備傳染病免疫治療劑；上述病原體相關(guān)蛋黃抗體中的病原體特異性表達抗原用于制備病原體多肽疫苗；上述病原體相關(guān)蛋黃抗體中的抗獨特型抗體Ab2β用于制備病原體抗獨特型抗體疫苗。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的用途，其特征還在于上述病原體相關(guān)蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY、病原體特異性表達抗原、抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β的任一種或其組合物用于制備預(yù)防傳染病的食品、飲料和保健品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種傳染性病原體相關(guān)蛋黃抗體的制備方法，包括針對于病原體免疫原的蛋黃多克隆抗體IgY、抗獨特型抗體和病原體特異性表達抗原的制備方法，另外還涉及該蛋黃抗體的用途。本發(fā)明主要以產(chǎn)蛋禽類尤其是雞作為免疫反應(yīng)器，用一種或多種病原體免疫原進行免疫注射，特點是多種免疫原單獨或多種聯(lián)合進行禽類尤其是雞的免疫注射，其產(chǎn)蛋中即有針對于上述病原體免疫原的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體或病原體特異性表達抗原中的任一種或其組合物存在和儲存。本發(fā)明具有成本低、產(chǎn)量高、特異性強、決定簇廣并能進行集約化大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點，尤其是能避免HAMA反應(yīng)和異質(zhì)性問題，且無毒副作用、安全性好。適用于傳染病的免疫診斷、治療和預(yù)防，尤其適用于對人類具有極大危害性傳染病如艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、結(jié)核、幽門螺桿菌性胃炎、梅毒、淋病等性傳播性疾病、病毒性腸炎及流感等疾病的主、被動免疫治療。
文檔編號A61P31/12GK1438245SQ0310400
公開日2003年8月27日 申請日期2003年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月1日
發(fā)明者郭占軍, 趙華, 郭愛芹, 楊煥云, 張慧, 尹連杰 申請人:郭占軍