專利名稱：TGF-β超家族基因在制備治療痛經(jīng)藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及TGF-β超家族基因在制備治療痛經(jīng)藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
痛經(jīng)為婦科血瘀證臨床常見多發(fā)病癥，可分為原發(fā)性痛經(jīng)(PD)和繼發(fā)性痛經(jīng) (SD)兩大類。原發(fā)性痛經(jīng)特征表現(xiàn)在無生殖系統(tǒng)明顯病變，一般在初潮開始就會發(fā)生；繼發(fā)性痛經(jīng)可由生殖器炎癥、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位等生殖器官疾病引起，其中子宮內(nèi)膜異位癥者居多。流行病學(xué)研究表明，我國婦女中痛經(jīng)發(fā)生率33. 1%，尤其是原發(fā)性痛經(jīng)者占 53.2%，痛經(jīng)嚴(yán)重影響工作者占13. 55%，為影響婦女正常工作和生活質(zhì)量的常見原因。痛經(jīng)為婦科最常見的癥狀之一，約有75%的婦女發(fā)生痛經(jīng)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，痛經(jīng)的發(fā)病機(jī)制與子宮異常收縮有關(guān)。由于子宮痙攣性收縮使子宮血流量減少，造成子宮缺血和疼痛發(fā)生，其病理機(jī)制涉及內(nèi)分泌因素(前列腺素合成和釋放，加壓素、催產(chǎn)素、內(nèi)啡肽)、神經(jīng)與神經(jīng)遞質(zhì)(去甲腎上腺素)和免疫失調(diào)等多種環(huán)節(jié)。西醫(yī)臨床?？墒褂梅橇趔w抗炎藥或口服避孕藥進(jìn)行治療，但這些藥物長期療效不理想，且對機(jī)體代謝有明顯的毒副作用，臨床不良反應(yīng)大。目前有關(guān)基因治療痛經(jīng)的報道較少，轉(zhuǎn)化生長因子β (transforming growth factor)家族由一類結(jié)構(gòu)、功能相關(guān)的多肽生長因子亞家族組成，其中包括TGF-β、活化素 (activin)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、生長分化因子(GDF)等。TGF-β除了影響細(xì)胞的增殖、 分化，還在胚胎發(fā)育、胞外基質(zhì)形成、骨的形成和重建等方面起著重要作用。TGF-β家族成員廣泛存在于從果蠅到人多種生物的各種組織中，對正常細(xì)胞、癌變細(xì)胞都有著顯著作用。且TGF-β超基因家族成員共同的特征(1)N-端有1段信號肽序列，可借以跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；( 緊挨著生物活性區(qū)有由4個氨基酸(RSRR)組成的蛋白酶加工位點(diǎn)；C3)C-末端包含9個保守的半胱氨酸的生物活性區(qū)，靠分子間的二硫鍵形成二聚體。目前還沒有文獻(xiàn)報道TGF-β超家族基因用于治療痛經(jīng)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中治療痛經(jīng)藥物的不足， 提供TGF-β超家族基因在制備治療痛經(jīng)藥物中的應(yīng)用。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為本發(fā)明提供TGF-β超家族基因在制備治療痛經(jīng)藥物中的應(yīng)用，其中優(yōu)選的 TGF- β 超家族基因為 ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、GSF1、⑶Fll、GDF5、MSTN、TXLNA, LEFTY2 或 NODAL。本發(fā)明所述的TGF-β超家族基因在制備治療痛經(jīng)藥物中的應(yīng)用，所述的痛經(jīng)類型可為原發(fā)性痛經(jīng)或繼發(fā)性痛經(jīng)。本發(fā)明采用了 Real-time PCR免疫芯片為研究工具，通過比較原發(fā)性痛經(jīng)患者和正常人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)基因表達(dá)譜。發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性痛經(jīng)發(fā)病前后，病人與正常人
3相比，TGF-β 超家族基因(BMP4、BMP6、GSFl、GDFll、GDF5、MSTN、TXLNA, LEFTY2 或 NODAL) 表達(dá)明顯下調(diào)。發(fā)明者首次發(fā)現(xiàn)了下調(diào)的TGF-β超家族基因(BMP4、BMP6、GSFU⑶F11、⑶F5、 MSTN、TXLNA, LEFTY2或NODAL)為原發(fā)性痛經(jīng)的致病基因。上述基因及其TGF-β /Smad信號通路，構(gòu)成了原發(fā)性痛經(jīng)藥物治療的新靶點(diǎn)?？傊?，TGF-β超家族基因(ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、GSFl、GDFl 1、GDF5、MSTN、TXLNA, LEFTY2 或NODAL)的表達(dá)和原發(fā)性痛經(jīng)直接相關(guān)，即TGF-β超家族基因(BMP4、BMP6、GSFl、ffl)Fll、 0^5、1^111乂1^嫩、1^ 1丫2或而040的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致和加劇痛經(jīng)發(fā)生，上調(diào)TGF-β超家族基因出1^4、81^6、65 1、0^11、0^5、]^111乂11^、1^ 1￥2或吣041^)的表達(dá)可作為治療原發(fā)性痛經(jīng)的新靶點(diǎn)。其中，TGF-β 超家族基因 ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、GSFl、⑶Fl 1、GDF5、MSTN、TXLNA, LEFTY2 和 NODAL的核苷酸序列分別為說明書序列SEQ ID NO 1 9，即BMP4核苷酸序列為序列1 ； BMP6核苷酸序列為序列2 ；GSFl核苷酸序列為序列3 ；GDFll核苷酸序列為序列4 ；GDF5核苷酸序列為序列5 ；MSTN核苷酸序列為序列6 ；TXLNA核苷酸序列為序列7 ；LEFTY2核苷酸序列為序列8 ；NODAL核苷酸序列為序列9。有益效果本發(fā)明通過大量實(shí)驗研究結(jié)果表明TGF-β超家族基因和痛經(jīng)，尤其是原發(fā)性痛經(jīng)的直接相關(guān)性，TGF-β超家族基因(ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、GSFl、⑶F11、⑶F5、MSTN、 TXLNA、LEFTY2或NODAL)的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致和加劇痛經(jīng)發(fā)生，上調(diào)TGF-β超家族基因(ΒΜΡ4、 ΒΜΡ6、GSFU⑶F11、⑶F5、MSTN、TXLNA, LEFTY2或NODAL)的表達(dá)能減輕和消除痛經(jīng)癥狀， TGF-β超家族基因可作為治療原發(fā)性痛經(jīng)的新靶點(diǎn)；和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明從基因水平治療痛經(jīng)癥狀，具有針對性強(qiáng)，療效好，不良反應(yīng)低的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明經(jīng)大量實(shí)驗研究表明， 四物湯的類方，如少腹逐瘀湯、香附四物湯等能顯著上調(diào)TGF-β超家族基因(ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、 GSFl、⑶F11、⑶F5、MSTN、TXLNA, LEFTY2或NODAL)表達(dá)，進(jìn)一步從基因水平驗證四物湯類方的良好的抗痛經(jīng)效果。


圖 1 為 TGF-β 超家族基因 BMP4、BMP6、GSF1、⑶F11、⑶F5、MSTN、TXLNA、LEFTY2 或 NODAL的表達(dá)倍數(shù)柱形圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。原發(fā)性痛經(jīng)患者PBMC細(xì)胞TGF-β超家族基因的研究本發(fā)明采用基因芯片技術(shù)， 針對免疫因子基因，證明TGF-β超家族基因BMP4、BMP6、GSF1、GDF11、GDF5、MSTN、TXLNA、 LEFTY2或NODAL和痛經(jīng)的相關(guān)性。1、材料與方法1. 1、原發(fā)性痛經(jīng)病人和正常人血樣收集經(jīng)江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，在正常月經(jīng)前7天和正常月經(jīng)第一
4天，收集10例原發(fā)性痛經(jīng)病人和10例正常人的靜脈血樣，并收集病人給予少腹逐瘀湯、香 附四物湯治療后的血樣。1. 2、RNA抽提=TRIZOL試劑(Invitrogen)，氯仿(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)，異丙 醇(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)，100%乙醇(上海化學(xué)試劑有限公司)，75%乙醇(以DEPC 處理的水配制)，無RNA酶的水，無RNA酶的糖原(Ambion)TE =IOmM, Tris-HCl pH8. 0，ImM EDTA (Tris-HCl，EDTA華美生物工程公司)，0. 4M MOPS, pH7. 0 (M0PS，華美生物工程公司)， 0. IM乙酸鈉(乙酸鈉，上?；瘜W(xué)試劑有限公司)，0.0 IM EDTA (EDTA，華美生物工程公司)，甲 醛(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)，甲醛上樣染液(Ambion)，溴化乙錠 thidium Bromide, EB, 華美生物工程公司)，瓊脂糖(生エ生物工程有限公司)。采用人淋巴細(xì)胞分離液提取每份血樣的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)細(xì)胞，加入Iml 的TRIZOL試劑，反復(fù)吹打溶解，負(fù)80度保存。加入0.2ml的氯仿，蓋緊EP管蓋，手動劇烈 振蕩管體15秒后，15到30°C孵育2到3分鐘。4°C下12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，離心后 RNA全部被分配于水相中，將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中，水相與0. 5ml異丙醇混合，室溫孵育 10分鐘，4°C 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，移去上清液，加入至少Iml的75%乙醇，清洗RNA 沉淀，振蕩后，4°C 7500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5 10 分鐘，溶解RNA吋，先加入無RNA酶的水用槍反復(fù)吹打幾次，然后55到60°C孵育10分鐘， 獲得的RNA溶液保存于負(fù)70°C。采用RNeasy MinEluteTM純化試劑盒^jiagen)純化RNA。 使用NanoDrop ND-1000測RNA濃度和純度，測量前先用溶解RNA用的DEPC水調(diào)零。樣品 RNA濃度計算公式為A26(1X40ng/iU，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度。1.3、cDNA 合成SuperScript. Ill Reverse Transcriptase、invitrogen), RNase Innibitor (,epicentre), IOmM dNTPs Mix oligo (,aT) 181.31、配制混合物
500ng/ul oligo (dT) 181ド1
總 RNA1.5tig
IOmM dNTPs Mix1ド1
滅菌水up to 13 y 11. 32、先在65°C水浴5分鐘后，冰上放置至少1分鐘。1. 33、短暫離心后，在離心管中依次加入
5 X First-Strand 緩沖液4ド1
0. IM DTTm
RNA酶抑制劑1ド1
SuperScript III RT1ド11. 34、移液槍輕輕吸打幾次混合均勻。1. 35、在 50°C溫育 60 分鐘。
1. 36、在70°C溫育15分鐘使酶失活。1. 37、每20 ill cDNA加91 yl滅菌水混勻，置冰浴待用或_20°C保存。1.4、實(shí)時定量 PCR2X SuperArray PCR master mix(Cat. No. PA-112), PCR Array1. 41.樣品準(zhǔn)備
權(quán)利要求
1.TGF-β超家族基因在制備治療痛經(jīng)藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TGF-β超家族基因在制備治療痛經(jīng)藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的 TGF-6 超家族基因為 ΒΜΡ4、ΒΜΡ6、GSFl、GDFl 1、GDF5、MSTN、TXLNA, LEFTY2 或 NODAL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的TGF-β超家族基因在制備治療痛經(jīng)藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的痛經(jīng)類型為原發(fā)性痛經(jīng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了TGF-β超家族基因(BMP4、BMP6、GSF1、GDF11、GDF5、MSTN、TXLNA、LEFTY2或NODAL)在制備治療痛經(jīng)藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明通過大量實(shí)驗研究表明痛經(jīng)病人外周血單個核細(xì)胞PBMC細(xì)胞的的TGF-β超家族基因有明顯下調(diào)，表明痛經(jīng)，尤其是原發(fā)性痛經(jīng)和TGF-β超家族基因(BMP4、BMP6、GSF1、GDF11、GDF5、MSTN、TXLNA、LEFTY2或NODAL)有直接相關(guān)性，TGF-β超家族基因可作為治療原發(fā)性痛經(jīng)的新靶點(diǎn)。
文檔編號A61K48/00GK102441176SQ20111039422
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月2日
發(fā)明者劉培, 唐于平, 宿樹蘭, 段金廒, 洪敏 , 馬宏躍 申請人:南京中醫(yī)藥大學(xué)