專利名稱：靶向腺苷受體A_2BAR的藥物在制備用于預防或治療自身免疫性疾病的藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，涉及一種靶向腺苷受體A2bAR的藥物在制備用于預防或治療自身免疫性疾病的藥物中的用途。
背景技術：
多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis, MS)被認為是一種典型的由T細胞介導的由免疫細胞介導的引起中樞神經系統(tǒng)(Central Nervous System, CNS)脫髓鞘和神經損傷的自身免疫性疾病(Krishnamoorthy, G. S.，A. Mars, L. T. Domingues, H. S. Mentele,R. Ben-Nun, A. Lassmann, H. Dornmair，K. Kurschus，F. C. Liblau，R. S. Wekerle, H. 2009.Myelin-specific T cells also recognize neuronal autoantigen in a transgenic mouse model of multiple sclerosis. Nat Medl5 :626-632. McFarland, H. F. , andR.Martin. 2007. Multiple sclerosis a complicated picture of autoimmunity.Nat Immunol 8:913-919.)。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental AutoimmuneEncephalomyelitis，EAE)是一種病理特征與MS相似的動物模型。以分泌產生干擾素-Y (IFN-Y)為特征的輔助性Th-I細胞(Th-I)被認為是典型的介導多發(fā)性硬化癥發(fā)生的細胞亞群，而隨后的研究已經預示能分泌白介素-17(IL-17)的輔助性TH-17細胞(Th-17)在EAE發(fā)病中是主要的致病T細胞亞群(Langrish, C. L，Y. Chen,W. M. Blumenschein, J. Mattson，B. Basham，J. D. Sedgwick, T. McClanahan，R. A. Kastelein，and D.J.Cua. 2005. IL-23drives a pathogenic T cell population that inducesautoimmune inflammation. J Exp Med 201 :233-240. Daniel J. Cual, J. S. , Yi Chenl,Craig A. MurphyI, Barbara Joycel，Brian Seymourl，Linda Lucianl, Wayne To2, SylviaKwan2, Tatyana Churakova2，Sandra Zurawski2，Maria Wiekowski3, Sergio A.Lira3，4，Daniel Gorman5，Robert A. Kastelein5 & Jonathon D.Sedgwick. 2003. Interleukin-23rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammationof the brain. Nature 421 :744-748)，轉錄生長因子-0 (TGF-3)和 IL-6 能誘導 TH_17 分化。IL-6是由抗原遞呈細胞(antigen-presenting cells，APCs)如巨嗷細胞和樹突狀細胞產生的炎性細胞因子，而在疾病早期發(fā)生時，樹突狀細胞又是外周T細胞分化的主要參與者。在一些免疫性疾病如類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)和炎性腸炎(inflammatory bowel disease, IBD)中都可以觀察到 IL-6 水平的增加(Ishihara，K. , andT. Hirano. 2002. IL-6 in autoimmune disease and chronic inflammatory proliferativedisease. Cytokine Growth Factor Revl3 :357-368.)。三個獨立研究小組在小鼠體外實驗中已經證實IL-6是Th_17細胞分化核實調節(jié)者(Zhou, L，Ivanov, II，R. Spolski，R.Min，K. Shenderov，T. Egawa，D. E. Levy, W. J. Leonard，and D. R. Littman. 2007. IL_6programsT(H)-17cell differentiation by promoting sequential engagement of the IL-21 andIL-23 pathways. Nat Immunol 8 :967-974. Nurieva, R.，X. 0. Yang，G. Martinez, Y. Zhang,
A.D. Panopoulos，L Ma, K. Schluns，Q. Tian，S. S. Watowich, A. M. Jetten，and C. Dong. 2007.Essential autocrine regulation by IL-21 in the generation ot inflammatoryT cells. Nature 448 :480-483. Korn, T.，E. Bettelli，W. Gao, A. Awasthi, A. Jager,T. B. Strom, M.Oukka, and V. K. Kuchroo. 2007. IL-21 initiates an alternative pathwayto induce pro inf lammatory T (H) 17cells. Nature 448 :484-487.)，而 IL-6 缺失小鼠能完全抵制由髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein，M0G)誘導的EAE 發(fā)病(Yoshinobu Okuda, S. S. , Claude C. A. Bernardl, Harutoshi Fujimura，YukihikoSaeki2，Tadamitsu Kishimoto2 and Takehiko Yanagihara. 1998. IL-6—deficient miceare resistant to the induction of experimental autoimmune encephalomyelitisprovoked by myelin oligodendrocyte glycoprotein. International Immunology.Samoilova, E. B.，J. L Horton，B. Hilliard，T. S. Liu, and Y. Chen. 1998. IL_6_deficientmice are resistant to experimental autoimmune encephalomyelitis roles of IL-6in the activation and differentiation of autoreactive T cells. J Immunol 161 6480-6486.)。腺苷是一種在炎癥和局部缺血條件下聚集的信號分子，通過激活四種細胞表明的G蛋白偶聯(lián)腺苷受體(ARs)，分別命名為A1AIA2aAR, A2BAR，and A3AR來起作用的。這些受體在免疫系統(tǒng)細胞中表達，在炎癥疾病中發(fā)揮重要作用(Hasko，G.，J. Linden, B. Cronstein,and P.Pacher. 2008. Adenosine receptors therapeutic aspects for inflammatory andimmune diseases. Nat Rev Drug Discov 7 :759-770.)。大量研究表明，MS和EAE 的發(fā)病與腺苷代謝失調有關。在來自MS病人血樣中腺苷水平下調(Mayne，M.，P. N. Shepel，Y. Jiang,J.D.Geiger, and C.Power. 1999. Dysregulation of adenosine Al receptor-mediatedcytokine expression in peripheral blood mononuclear cells from multiplesclerosis patients. Ann Neurol 45 :633-639.)。A1AR 敲除小鼠易得 EAE,激活 Al 受體能減輕 EAE 脫髓鞘(Tsutsui，S.，J. Schnermann, F. Noorbakhsh, S. Henry, V. W. Yong,
B.W. Winston, K. Warren, and C. Power. 2004. Al adenosine receptor upregulationand activation attenuates neuroinflammation and demyelination in a model ofmultiple sclerosis. J Neurosci 24 :1521-1529.)。慢性咖啡因治療可能通過 Al 受體減輕 EAE(Tsutsui, S.，J. Schnermann, F. Noorbakhsh, S. Henry, V. W. Yong, B. W. Winston,K. Warren, and C. Power. 2004. Al adenosine receptor upregulation and activationattenuates neuroinflammation and demyelination in a model of multiplesclerosis. J Neurosci 24 1521-1529.Chen, G. Q.，Y.Y.Chen, X.S.Wang, S.Z.Wu,H. M. Yang，H. Q. Xu, J. C. He，X. T. Wang, J. F. Chen, and R. Y. Zheng. 2010. Chronic caffeinetreatment attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis induced byguinea pig spinal cord homogenates in Wistar rats. Brain Res 1309 :116-125.)。CD73是一種胞外核苷酸酶，對胞外腺苷代謝十分重要，該基因缺失小鼠能抵抗EAE，作者還發(fā)現通過抑制 A2aAR 可抑制 EAE ((Mills, J. H.，L F. Thompson，C. Mueller, A. T. Waickman,S. Jalkanen，J. Niemela，L Airas，and M. S. Bynoe. 2008. CD73is required for efficiententry of lymphocytes into the central nervous system during experimentalautoimmune encephalomyeliti s. Proc Natl Acad Sci USA105 :9325-9330.))。這些發(fā)現都表明腺苷及其受體在調節(jié)EAE發(fā)病中扮演著重要角色。

發(fā)明內容
針對現有技術中的不足，發(fā)明人致力于研究EAE發(fā)病的介質和機理，腺苷及其受體在EAE發(fā)病中的作用，以及腺苷受體能否作為自身免疫病的治療靶點，并且完成了本發(fā)明。在本發(fā)明的研究中，發(fā)明人發(fā)現在EAE動物模型中，腺苷受體A2bAR在外周免疫組織中表達水平明顯上調。拮抗劑CVT-6883和MRS-1754阻斷A2bAR后能減少CNS的炎癥細胞浸潤，減輕EAE的臨床癥狀。本發(fā)明的研究表明，腺苷受體在EAE發(fā)病中扮演了重要角色，主要通過增加抗原遞呈細胞如樹突狀細胞(Dendritic cells, DC)炎性因子白介素-6 (Interleukin-6, IL-6)的生成，從而增加炎性T細胞TH_17的分化，引起EAE發(fā)病。炎癥細胞的過度激活及對組織的浸潤是許多自身免疫病(包括多發(fā)性硬化、類風濕關節(jié)炎、紅斑狼瘡、炎癥性腸病等)的共同特征。因此，本發(fā)明的目的是提供一種靶向腺苷受體A2bAR的藥物在制備用于預防或治 療自身免疫性疾病的藥物中的用途。本發(fā)明的技術方案如下本發(fā)明提供了一種靶向腺苷受體A2bAR的藥物在制備用于預防或治療自身免疫性疾病的藥物中的用途。所述的靶向腺苷受體A2bAR的藥物為A2bAR拮抗劑。所述的A2bAR 拮抗劑包括 CVT-6883 或 MRS-1754。所述的自身免疫性疾病包括多發(fā)性硬化、類風濕關節(jié)炎、紅斑狼瘡或炎癥性腸病(inflammatory bowel disease)。經研究發(fā)現，在EAE小鼠中，A2bAR在免疫組織中表達上調。A2bAR的兩個拮抗劑(CVT-6883和MRS-1754)給藥EAE小鼠后，EAE小鼠發(fā)病時間推遲，發(fā)病癥狀減輕，發(fā)病率降低，CNS炎癥細胞浸潤減少。近一步研究發(fā)現，A2bAR信號并不影響致敏T細胞的分化，而是通過影響上游DC細胞IL-6的分泌，導致下游Th-17的分化，導致EAE的發(fā)病，而給予A2bAR拮抗劑后，可以抑制致病性T細胞的分化，減輕EAE病情。A2bAR拮抗劑可以用于臨床治療多發(fā)性硬化等疾病，本發(fā)明不僅揭示了 MS發(fā)病的部分機制，同時也為疾病的臨床干預提供了新的治療靶點。本發(fā)明同現有技術相比，具有如下優(yōu)點和有益效果本發(fā)明的優(yōu)點在于首次發(fā)現了腺苷受體A2bAR在MS病人及其動物模型EAE中表達上調，且用腺苷受體A2bAR拮抗劑CVT-6883能夠有效減輕EAE發(fā)病癥狀。本發(fā)明的有益效果在于目前能有效治療MS且副作用小的藥物非常少，而腺苷受體A2bAR拮抗劑CVT-6883現已作為臨床實驗藥物用于治療哮喘，作為治療MS疾病的藥物具有很大的可能性，本發(fā)明給治療MS疾病提供了新的作用靶點和藥物來源。


圖I為顯示EAE發(fā)病過程中A2bAR受體基因表達變化的圖。提取免疫后第5天，第9天，第12天，第15天，第18天，第21天EAE小鼠及對照鼠的脾，淋巴結，腦及脊髓的mRNA，實時定量-PCR用于分析基因表達。同一組織樣品基因表達與P-actin表達的比值再與對照相比。A-D，在脾(A)，淋巴結⑶，腦(C)和脊髓⑶中四種腺苷受體基因表達變化；數據表示為mean 土 SEM (n = 6)，來源兩次獨立實驗。與對照比較*p < 0. 05，**p < 0. 01和***p < 0.001, (Student， s t-test)。圖2為顯示A2bAR受體拮抗劑減輕EAE的病情的圖。小鼠誘導EAE免疫后第3天起每天一次腹腔給藥，CVT-6883 (0. 3mg, Img and 3mg/kg/天)(A-C)或 MRS 1754 (lmg/kg/天)(D)至實驗結束(N= 10)，記錄臨床評分，對照給予0.9%生理鹽水。數據表示為mean土SEM 與對照相比較，***p < 0. 001 (two-way ANOVA test), *p < 0. 05, **p < 0. 01，(Mann-ffhitney test)。取正常或免疫后給生理鹽水及CVT-6883 (3mg/kg，第3天給藥)第17天小鼠腰髓組織石蠟切片進行H&E染色(E)及快藍染色(F) j-H，對E-F中細胞浸潤總數及脫髓鞘數進行定量分析，數據以mean 土 SEM表示。每組取3只小鼠，每只小鼠脊髓取15塊切片進行分析，與正常比較#P < 0. 01，***p <0. 001 ;與對照比較，###p <0. 001 (Student’st-test).流式細胞儀檢測CNS侵潤總細胞⑴，⑶4+T細胞(J)，Th-I和TH_17細胞⑷。圖3為顯示CVT-6883治療抑制體內而不是體外TH_17細胞分化的圖。流式分析源 自免疫后第10天EAE給藥CVT-6883 (3mg/kg)或生理鹽水組小鼠脾臟和血液中白細胞。A和B，表面染色⑶45+細胞，⑶4+T細胞，⑶8+T細胞和B細胞；C，在脾臟⑶4+T細胞內胞內染色IFN-Y，IL-17流式檢測Th-I，Th-17細胞。D，實時定量PCR檢測在脾臟中Th-I和TH_17相關基因表達。E-H，來自正常鼠，EAE給生理鹽水組或CVT-6883(3mg/kg)組的脾細胞體外M0G35-55 重刺激48h 后取上清 ELISA檢測 IL_17a，IFN- y，11^-4和16 -@。I，在NECA (IOuM)或CVT-6883(0. IuM)存在下，來源于8_9周小鼠脾內的正常⑶4+T細胞體外誘導分化為Th-I或TH-17,數據來處三次獨立實驗，表示為mean土SEM。數據表示為mean土SEM(n = 5)與正常對照 *P < 0. 05 ;與實驗對照組比較 #p < 0. 05,##p < 0. 01，(Student，s t-test)。圖4為顯示CVT-6883抑制體內DC細胞IL-6產生的圖。A，血清采自正常小鼠，EAE小鼠給CVT-6883(3mg/kg)或對照處理免疫第10天，ELISA檢測IL-6水平。B和C，實時定量PCR檢測來自脾臟和外周淋巴結的白細胞中IL-6表達水平。D，分離自免疫第3，6，9天EAE小鼠外周淋巴結的樹突狀細胞，qPCR檢測四個腺苷受體表達變化。E，外周淋巴結中CDllc+樹突狀細胞在抗⑶40抗體(IOug ml—1)刺激36小時，或是有腺苷受體激動劑NECA(IOuM)和A2b拮抗劑CVT-6883 (IOOnM)孵育情況下IL-6生成量由ELISA檢測。F，DC-T細胞體外共培養(yǎng)體系中，在存在NECA (IOuM)，CVT-6883 (IOOnM)或兩者都在情況下FACS檢測TH_17分化。數據表示為mean土SEM.與正常對照*P < 0. 05，#p < 0. 01，*#p < 0. 001 ;與實驗對照組比較 #P < 0. 05，##p < 0. 01，刪p < 0. 001，(Student，s t-test)。圖5為顯示Gq-PLCP -PKC和p38MAPK信號通路參與腺苷受體A2bAR介導的DC細胞IL-6生成的圖。腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ 22536和PKA抑制劑H89 (A)，PLCP抑制劑U73122和 PKC 抑制劑 Ro 31-8220 (B)，三個 MAPKs 抑制劑 SB 203580，U0126 和 SP 600125(C)在NECA誘導DC細胞IL-6生成中的作用。DC細胞和抑制劑孵育30分鐘后與IOuM NECA孵育36 小時。*P < 0. 05, **p < 0. 01。圖6為顯示腺苷受體A2bAR在MS病人中上調及CVT-6883抑制NECA誘導人源DC細胞IL-6生成的圖。A，qPCR檢測來自正常人(n = 20)和RRMS病人(n = 10)外周血白細胞樣本腺苷受體表達。B，分離自正常捐助者外周血單核細胞的人源DC細胞在anti-CD4抗體(IOug mr1)刺激下孵育36小時，或是與NECA(IOuM)亦或NECA和CVT-6883 (IOOnM)一起ELISA檢測IL-6分泌水平。C，人源DC細胞與PLC3抑制劑U73122 (IOuM)或PKC抑制劑Ro 31-8220 (IuM)預孵育30分鐘后與NECA培養(yǎng)36小時，ELISA檢測IL-6水平。數據表示為 mean土 SEM (n = 3)。與對照組比較 #p < 0. 01，*#p < 0. 001 ;與 CVT-6883 處理組比較 ###p < 0. 001 (Student，s t-test)。
具體實施例方式以下結合附圖所示實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例材料與方法動物
C57BL/6雌鼠購自上海實驗動物中心(上海，中國)。所用小鼠為8_9周齡，并在免疫前至少飼養(yǎng)7天。所有小鼠都飼養(yǎng)于同濟大學實驗動物中心SPF級實驗室。所有實驗均獲得批準，并按照同濟大學的動物保健委員會的指引進行。試劑M0G35_55 (MEVGffYRSPFSRVVHLYRNGK)購自吉泰生化(上海，中國)，純度 > 97 %。熱滅活結核桿菌H37RA購自BD Diagnostics,百日咳毒素購自Calbiochem。福氏完全佐劑(CFA)購自 Sigma-Aldrich, CVT-6883 和 MRS 1754 購自 Tocris Bioscience (USA)。M-MLVReverse Transcriptase 和 RNasin Ribonuclease inhibitor 購自 Promega (Fitchburg,WI) .SYBR Green JumpStart Taq ReadyMi x kit 和 sodium fluorescein 購自 Sigma (St.Louis, MO) Percoll 購自 GE healthcare。Allophycocyanin anti-mouse/rat Foxp3 staining set 購自 eBioscience (SanDiego, CA). PE-Cy7anti-mouse CD4, PE anti-mouse IL17a, Allophycocyanin anti-mouseIFN- y , PE anti-mouse Foxp3 和 BD Cytof ix/Cytoperm kit 購自BD bioscience (FranklinLakes, NJ). Dynal Mouse CD4Cell Negative Isolation Kit 購自 Invitrogen (Carlsbad,CA) DC 細胞分離磁珠購自 Miltenyi Biotec,mouse IL_17a, IFN-Y , TGF-0 , IL-4, IL-6 及human IL-6ELISA kits購自達科為(深圳，中國)。EAE誘導及小鼠給藥8-9周雌性C57BL/6小鼠皮下注射200 u g MOG35^55輔以完全弗氏佐劑及熱滅活結核桿菌(H37Ra strain, 5mg/ml,BD Diagnostics)。免疫第0天及第2天每只小鼠腹腔注射百日咳毒素200ng(Calbiochem)。采取“雙盲法”每天為小鼠評分，評分按“5分制”標準如下0分，無臨床癥狀；I分，尾部癱瘓；2分，輕度癱瘓(單側或雙側后肢無力，不完全癱瘓)；3分，截癱(雙側后肢完全癱瘓)；4分，截癱并前肢無力或癱瘓；5分，瀕死狀態(tài)或死亡。小鼠給藥，CVT-6883和MRS 1754 (0. 3_3mg/kg)從免疫后第3天腹腔給藥至研究結束。生理鹽水為陰性對照(每只100 u I)。組織病理分析為分析CNS浸潤，小鼠PBS灌流后取脊髓，進行組織染色，小鼠麻醉后PBS灌流及4%多聚甲醛灌流固定。組織樣品4%多聚甲醛固定過夜。石蠟包埋后H&E染色分析炎癥浸潤，快藍染色分析脊髓脫髓鞘。
實時-定量PCR根據產品說明，利用TRIzol (Invitrogen)提取脊髓，大腦皮質，脾細胞和淋巴結細胞及RRMS病人和正常人血液樣本總RNA，用六堿基隨機引物和M-MLVReverseTranscriptase (Progema)逆轉錄至 CDNA。利用 SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix kit (Sigma)及各基因引物序列在 LightCycler quantitative PCRapparatus (Stratagene)上進行實時定量-PCR檢測各基因表達情況。引物序列如下小鼠引物 mAdoral 上游引物 _5，-TCCTGGCTCTGCTTGCTATTG-3，，mAdoral 下游引物 _5，-GGCTATCCAGGCTTGTTCCAC-3，；mAdora2a 上游引物 _5 ’ -GTCCTCACGCAGAGTTCCATC-3 ’，mAdora2a 下游引物 _5，-GAATGACAGCACCCAGCAAA-3，；mAdora2b 上游引物 _5，-CCTCTTCCTCGCCTGCTTC-3，，mAdora2b 下游引物 _5 ’ -AACGGAGTCAATCCAATGCC-3 ’ ；mAdora3 上游引物 _5 ’ -CCGATACCTGCGGGTCAAG-3 ’，mAdora3 下游引物 _5 ’ -CCGATACCTGCGGGTCAAG-3 ’ ；1117a 上游引物-5 ’ -TTAACTCCCTTGGCGCAAAA-3 ’，1117a 下游引物-5 ’ -CTTTCCCTCCGCATTGACAC-3，；I117f 上游引物 _5，-TGCTACTGTTGATGTTGGGAC-3，，I117f■下游引物-5，-TGCTACTGTTGATGTTGGGAC-3，；1122 上游引物-5，-GTGAGAAGCTAACGTCCATC-3 ’，1122 下游引物-5，-GTCTACCTCTGGTCTCATGG-3，；1123r 上游引物 _5 ’ -ACACTGGGAAGCCTACCTACA-3 ’，1123r 下游引物-5 ’ -AGCTTGGACCCATACCAAATACT-3，；I fng 上游引物-5 ’ -ATGAACGCTACACACTGCATC-3 ’，I fng 下游引物 _5 ’ -CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC-3 ’ ；IllO 上游引物-5’ -GCTCTTACTGACTGGCATGAG-3’，IllO 下游引物-5’ -GCTCTTACTGACTGGCATGAG-3’ ；116 上游引物-5，-ACCACGGCCTTCCCTACTTC-3，，116 下游引物-5，-ACCACGGCCTTCCCTACTTC-3，；^ -actin 上游引物 _5’ -GGCTGTAITCCCCTCCATCG-3 ’，P -actin 下游引物 _5’ -CCAGTTGGTAACAATGCCATGTT-3’。人源引物hAdoral 上游引物 _5 ’ -TGCGAGTTCGAGAAGGTCATC-3 ’，hAdoral 下游引物 _5’ -GAGCTGCTTGCGGATTAGGTA-3’ ；hAdora2a 上游引物 _5 ’ -GCTGGGATCAAGGACAGGG-3 ’，hAdora2a 下游引物 _5，-TCCCTTTAGAAGGAAAGGCAGT-3，；hAdora2b 上游引物 _5，-TCTTCCTCGCCTGCTTCGT-3，，hAdora2b 下游引物 _5，-TCTTCCTCGCCTGCTTCGT-3，；
hAdora3 上游引物 _5 ’ -TCTTTACCCACGCCTCCATC-3 ’，hAdora3 下游引物 _5 ’ -CAATCCCACCAGGAATGACAC-3 ’ ； ^ -actin 上游引物 _5’ -CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，P -actin 下游引物 _5’ -CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。流式細胞檢測及CNS浸潤白細胞分離脾細胞，外周血單核細胞或來自EAE小鼠CNS的浸潤細胞與phorbol12-myristatel3-acetate(50ng/ml ；Sigma), ionomycin (750ng/ml ；Sigma)和 brefeldinA(1.0u g/ml ； Sigma) 37 °C孵育5小時，相應抗體染色表面標記物，表面染色后細胞重懸于固定/通透液(Cytofix/Cytoperm kit ；BD Pharmingen),胞內染色按產品說明操作。對 于 Foxp3 染色,細胞不用 phorbol 12-myristate 13-acetate 和 ionomycin 刺激,而是使用Foxp3 Staining Buffer set 并按產品說明操作。結果用 Guava easyCyte 8HT System和GuavaSoft軟件進行分析。用組織勻漿器冰上將脊髓組織勻漿后用70i!m細胞過濾器濾過，細胞懸液4°C 500g離心10分鐘后，用8ml 37% percoll重懸細胞，小心加入到4mI 70% percoll液體中，25°C 780g離心25分鐘。收集位于37% -70% percoll中間層細胞并流式檢測。血清和MOG-特異性細胞因子ELISA檢測眼眶取血4°C靜置30分鐘，4500X g離心10分鐘得到血清。對照小鼠或EAE給生理鹽水或CVT-6883小鼠在免疫后第10天處死，脾取出后紅細胞裂解液裂解后IOOOg離心3分鐘收集白細胞，在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中重懸，以2X105/well/100iil鋪96孔板，細胞37°C MOG35^55 ( 20 u g/ml)重刺激48小時，上清收集后根據特定的ELISA Kits,按照產品說明，分別檢測IL-17a，IFN- y , IL-4和TGF-P的含量。⑶4+T細胞分離和體外分化磁珠分離8-9周C57BL/6小鼠脾中幼稚⑶4+T細胞，分離⑶4+T細胞加入anti-CD3 (2u g/ml ；145-2C11, soluble ；BD Pharmingen)和 anti_CD28 (2u g/ml ;37. 51, soluble ；BD Pharmingen)抗體激活后分別加入 IL-12 (lOng/ml ；Peprotech)和anti-IL-4 (10 u g/ml ；11B11 ；BD Pharmingen)誘導分化為 ThI 細胞及加入 TGF-3 I (5ng/ml ；Peprotech),重組鼠 IL_2(50U/ml ；Peprotech)和 anti-IFN-y (10 u g/ml ；XMG1. 2 ；BD Pharmingen)誘導分化為 Treg 細胞，或加入 anti-IL-4, anti-IFN- y , TH_17 “雞尾酒”含 TGF-3 I(3ng/ml), IL-6(30ng/ml ；eBioscience), tumor necrosis factor(lOng/ml ；Peprotech)和IL-1 ^ (lOng/ml ；Peprotech)誘導分化為TH_17細胞。各種濃度的復合物同時加入以評估其對T細胞分化的影響。樹突狀細胞分離和IL-6分析用Miltenyi Biotec磁珠從C57BL/6小鼠淋巴結中分離提純⑶llc+DC細胞。而對于人的DC細胞分離，通過Ficoll-Paque對來自實驗室捐獻者外周血進行密度梯度離心得到 PBMC 后，用 Miltenyi Biotec 的 Blood Dendritic Cell Isolation Kit II Human 試劑盒兩步法分離得到人血DC細胞。剛分離的DC細胞(I X IO5)接種于IOOul培液中，該培液為 RPMI-1640,包括 10% FBS, I Xantibiotic antimycotic mixture (Sigma)和 lU/mladenosine deaminase, lOug/ml 的抗 CD40 抗體，實驗中加或不加 NECA(IOuM)，37°C孵育 36小時。A2bAR受體拮抗劑CVT-6883 (IOOnM)和信號通路抑制劑在加NECA前30分鐘孵育。將收集培養(yǎng)上清進行IL-6的ELISA檢測。DC-T細胞共培養(yǎng)在DC-T細胞共培養(yǎng)實驗中，5父1050)4+0025飛細胞和I. 6X IO5未分化DCs (比例3 I)在有2. gmr1可溶性抗CD3抗體(145-2C11，BD Pharmingen)的條件下培養(yǎng)48-72h。細胞在未加入NECA前加入A2bAR受體拮抗劑CVT-6883 (IOOnM)孵育30分鐘。CVT-6883對T細胞分化的影響通過FACS來檢測。數據統(tǒng)計數據表示為mean土SEM, EAE小鼠處理組間統(tǒng)計學差異用two-way ANOVA test分析，時間點內EAE評分統(tǒng)計學差異用Mann-Whitney test分析。其他數據分析如基因表達，細胞因子生成后病理學統(tǒng)計分析用Student’ s t-test分析。p < 0. 05為有統(tǒng)計學意義。
結果EAE發(fā)病過程中腺苷受體A2bAR表達上調本發(fā)明用M0G35-55免疫C57BL/6小鼠誘導EAE。為闡明腺苷受體是否與EAE發(fā)病有關，首先檢查了四個腺苷受體A1AIA2aAIA2bAR和A3AR在EAE免疫后第5，9，12，15，18，21天的表達水平。發(fā)明人發(fā)現腺苷受體A2bAR和A3AR從免疫后第5天到第21天在脾臟和淋巴結中均有明顯上調。而腺苷受體A2bAR在腦和脊髓中的表達沒有明顯變化。腺苷受體A3AR在脊髓中表達明顯上調，而在腦中變化不明顯。腺苷受體A1AR在淋巴結中有上調，但在中樞神經系統(tǒng)中沒有顯著變化，它在脾臟中不表達。腺苷受體A2aAR在脾臟和淋巴結中略有下調而在腦和脊髓的表達沒有變化(圖1.A-D)。腺苷受體A2bAR在免疫后的上調預示這該受體可能在EAE發(fā)病過程中起作用。圖I為顯示EAE發(fā)病過程中A2bAR受體基因表達變化的圖。提取免疫后第5天，第9天，第12天，第15天，第18天，第21天EAE小鼠及對照鼠的脾，淋巴結，腦及脊髓的mRNA，實時定量-PCR用于分析基因表達。同一組織樣品基因表達與P-actin表達的比值再與對照相比。A-D，在脾(A)，淋巴結⑶，腦(C)和脊髓⑶中四種腺苷受體基因表達變化；數據表示為mean土SEM(n = 6)，來源兩次獨立實驗。與對照比較*p < 0. 05, **p < 0.01和***p < 0.001, (Student， s t-test)。抑制腺苷受體A2bAR能起到減輕EAE的臨床癥狀 為進一步評價腺苷受體A2bAR在EAE發(fā)病過程中的作用，腺苷受體A2bAR的兩個特異性拮抗劑CVT-6883和MRS-1754，不同的給藥劑量(0. 3mg，lmg and 3mg/kg/Day)用來治療MOG誘導的EAE小鼠。從免疫后第3天到第19天開始每天給藥。結果顯示CVT-6883治療組在每天給藥劑量為lmg/kg/day和3mg/kg/day時能降低EAE發(fā)病率、顯著減輕發(fā)病嚴重性及總體臨床分數(圖2A-C)。另外一種拮抗劑MRS 1754也能顯著減輕EAE的癥狀(圖
2.D)。脊髓取自圖2C中免疫后第17天的小鼠，可以發(fā)現給予CVT-6883治療的小鼠的脊髓中浸潤細胞(圖2，E，G)和脫髓鞘程度(圖2，F，H)明顯少于對照組。檢驗淋巴細胞對CNS的浸潤進一步證實了 CVT-6883治療對EAE改善作用。就目前而言，多發(fā)性硬化癥被認為是一種典型的T細胞介導的自身免疫性疾病，而Th-17 and Th-I在EAE過程中是重要的致?、?+T效應細胞。報道CVT-6883治療能夠同時減少EAE小鼠CNS浸潤和⑶4+T數量(圖2，I，J)。Th-I和Th-17細胞絕對數量也顯著減少(圖2，K)。從以上數據顯示CVT-6883能夠減緩EAE，減少淋巴細胞和T細胞對CNS的浸潤。圖2為顯示A2bAR受體拮抗劑減輕EAE的病情的圖。小鼠誘導EAE免疫后第3天起每天一次腹腔給藥，CVT-6883(0. 3mg, lmg and 3mg/kg/天)(A-C)或MRS 1754 (lmg/kg/天)(D)至實驗結束(N = 10)，記錄臨床評分，對照給予0. 9%生理鹽水。數據表示為mean 土 SEM與對照相比較，***p < 0. 001 (two-way ANOVAtest), *p < 0. 05, **p <0. 01, (Mann-ffhitneytest)。取正?；蛎庖吆蠼o生理鹽水及CVT-6883 (3mg/kg,第3天給藥)第17天小鼠腰髓組織石蠟切片進行H&E染色(E)及快藍染色(F) W-H，對E-F中細胞浸潤總數及脫髓鞘數進行定量分析，數據以mean土SEM表示。每組取3只小鼠，每只小鼠脊髓取15塊切片進行分析，與正常比較 **P < 0. 01，_p < 0. 001 ;與對照比較，###p < 0. 001 (Student，s t-test).流式細胞儀檢測CNS侵潤總細胞⑴，⑶4+T細胞(J)，Th-I和Th-17細胞⑷。CVT-6883 抑制 EAE 小鼠 TH_17 生成發(fā)明人首先在脾臟和血液中檢測了白細胞，⑶4+T細胞，⑶8+T細胞和B細胞，發(fā)現CVT-6883給藥不影響EAE小鼠中這些細胞的百分比(圖3. A，B)。胞內細胞因子染色結果 顯示CVT-6883能影響脾臟中Th-17細胞和ThI細胞在⑶4+的百分比(圖3. C)。與此想一致的是，Th-17細胞相關基因如1117a，I117f，1122和I123r在EAE發(fā)病中都有明顯上調，而CVT-6883給藥能明顯減少這些基因的表達，Th-I細胞相關基因Ifng也有少許下降，而與其他T細胞相關因子如114和Tgfb等給藥后沒有明顯變化(圖3. D)。CVT-6883能抑制來自脾細胞MOG重刺激上清的Th-17細胞相關因子IL-17a(圖3. E)，Th-I細胞相關因子IFN-Y □(圖3. F)的產生，而對IL-4和TGF-P沒有影響(圖3. G，H)。這些數據顯示CVT-6883影響EAE主要是通過影響TH_17細胞的分化，同時一定程度上也影響了 Th-I細胞。圖3為顯示CVT-6883治療抑制體內而不是體外TH_17細胞分化的圖。流式分析源自免疫后第10天EAE給藥CVT-6883 (3mg/kg)或生理鹽水組小鼠脾臟和血液中白細胞。A和B，表面染色⑶45+細胞，⑶4+T細胞，⑶8+T細胞和B細胞；C，在脾臟⑶4+T細胞內胞內染色IFN-Y，IL-17流式檢測Th-I，Th-17細胞。D，實時定量PCR檢測在脾臟中Th-I和TH_17相關基因表達。E-H，來自正常鼠，EAE給生理鹽水組或CVT-6883(3mg/kg)組的脾細胞體外M0G35-55 重刺激48h 后取上清 ELISA檢測 IL_17a，IFN- y，IL-4 和 TGF- ^。I，在NECA (IOuM)或CVT-6883(0. I u M)存在下，來源于8_9周小鼠脾內的正常⑶4+T細胞體外誘導分化為Th-I或TH-17,數據來處三次獨立實驗，表示為mean土SEM。數據表示為mean土SEM(n = 5)與正常對照 *P < 0. 05 ;與實驗對照組比較 #p < 0. 05,##p < 0. 01，(Student，s t-test)。CVT-6883 抑制 IL-6 生成在免疫反應中，抗原遞呈的DC細胞遷移到外周淋巴結，把抗原呈遞給⑶4+T細胞，影響T細胞分化。在前面的實驗中顯示CVT-6883在體外不直接影響TH_17的分化(圖3. I，J)。Jeffrey和他的同事們報道腺苷受體A2bAR能夠介導DC細胞IL-6的生成，在體外促進Th-17 的分化(Wilson, J. M.，C. C. Kurtz, S. G. Black, ff. G. Ross, M. S. Alam, J. Linden, andP.B.Ernst. 2011. The A2B Adenosine Receptor Promotes Thl7 Differentiation viaStimulation of Dendritic Cell IL-6. J Immunol.)。這些數據預不 CVT-6883 可能影響了抗原遞呈細胞如DC細胞IL-6的產生，減輕EAE的發(fā)病。在EAE小鼠免疫后第10天收集了血清、脾臟和淋巴細胞，發(fā)現給于CVT-6883處理組血清中IL-6水平，以及在脾和淋巴結中的表達水平都有明顯下降(圖4. A，B，C)。而根據DC細胞極化T細胞的功能主要體現在EAE發(fā)病的早期，檢測了 EAE免疫第3，6，9天分離子淋巴結DC細胞中四個腺苷受體表達情況。A2bAR在EAE發(fā)病過程中明顯上調,而A2aAR明顯下調,而A1AR和A3AR沒有顯著變化(圖
4.D)。分離得到了來自正常小鼠淋巴結中的DC細胞，發(fā)現CVT-6883能夠顯著抑制由NECA刺激的IL-6生成(圖4. E)。發(fā)現在DC-T細胞共培養(yǎng)中，NECA能顯著促進TH_17的分化，而CVT-6883通過抑制IL-6的生成來抑制TH_17的分化(圖4. F，G)。結果顯示CVT-6883能夠抑制NECA誘導DC細胞產生的IL-6的生成，從而負面調控TH_17的分化。圖4為顯示CVT-6883抑制體內DC細胞IL-6產生的圖。A，血清采自正常小鼠，EAE小鼠給CVT-6883(3mg/kg)或對照處理免疫第10天，ELISA檢測IL-6水平。B和C，實時定量PCR檢測來自脾臟和外周淋巴結的白細胞中IL-6表達水平。D，分離自免疫第3，6，9天EAE小鼠外周淋巴結的樹突狀細胞，qPCR檢測四個腺苷受體表達變化。E，外周淋巴結中CDllc+樹突狀細胞在抗⑶40抗體(IOug mr1)刺激36小時，或是有腺苷受體激動劑NECA(IOuM)和A2bAR拮抗劑CVT-6883 (IOOnM)孵育情況下IL-6生成量由ELISA檢測。F，DC-T細胞體 外共培養(yǎng)體系中，在存在NECA (IOuM)，CVT-6883 (IOOnM)或兩者都在情況下FACS檢測TH_17分化。數據表示為mean土SEM.與正常對照*P < 0. 05，#p < 0. 01，*#p < 0. 001 ;與實驗對照組比較 #p < 0. 05，##p < 0. 01，刪p < 0. 001，(Student，s t-test)。Gq-PLC ^ -PKC信號通路參與DC細胞中A2bAR介導的IL-6生成NECA誘導IL-6生成依賴與腺苷受體A2BAR，因為其他三個腺苷受體的激動劑不能誘導 IL-6 生成(Feng, ff. , Y. Song, C. Chen, Z. Z. Lu, and Y. Zhang. 2010. Stimulationof adenosine A(2B)receptors induces interleukin-6 secretion in cardiacfibroblasts via the PKC-delta_P38signalling pathway.Br J Pharmacol 159 1598-1607.)，而在A2bAR敲除的巨噬細胞中，NECA幾乎不能誘導IL-6生成(Ryzhov,
5., R. Zaynagetdinov, A. E. Goldstein, S. V. Novitskiy, M. R. Blackburn, I. Biaggioni,and I.Feoktistov.2008. Effect of A2B adenosine receptor gene ablation onadenosine-dependent regulation of proinflammatory cytokines. J Pharmacol ExpTher 324 :694-700.)。腺苷受體A2bAR被報道參與多種信號通路如Gs_cAMP-PKA信號通路和Gq-PLC-PKC信號通路(Feoktistov, I. ,A. E. Goldstein,and I. Biaggioni. 1999. Role ofp38 mitogen-activated protein kinase and extracellular signal-regulated proteinkinase kinase in adenosine A2B receptor-mediated interleukin-8 production inhuman mast cells. Mol Pharmacol 55 :726-734.)。為了觀察Gs-cAMP-PKA信號通路是否參與NECA誘導DC細胞IL-6生成，DC細胞在NECA加入前30分鐘先和腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536和PKA抑制劑H-89孵育，培養(yǎng)36小時。這些抑制劑不能減少IL-6的生成(圖5. A)。PCLP和PKC特異性抑制劑U73122和Ro 31-8220用于揭示Gq-PLC-PKC信號通路是否參與NECA誘導IL-6生成。PCLP抑制劑U73122和PKC抑制劑Ro 31-8220能濃度依賴地抑制NECA誘導IL-6生成(圖5. B)。p38特異性抑制劑SB203580，ERK特異性抑制劑U0126和JNK特異性抑制劑SP600125用來研究p38，ERK和JNK在NECA誘導DC細胞IL-6生成中的作用。細胞首先與這些抑制劑孵育30分鐘，然后IOuM NECA激活36小時。SB203580能夠顯著抑制IL-6生成，而U0126和SP600125沒有作用(圖5. C)。綜上所述，這些結果顯示NECA誘導DC細胞IL-6生成是通過Gq-PLC-PKC和p38MAPK信號通路來實現的。圖5為顯示Gq-PLC ^ -PKC和p38MAPK信號通路參與A2bAR介導的DC細胞IL-6生成的圖。腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ 22536和PKA抑制劑H89 (A)，PLCP抑制劑U73122和PKC抑制劑 Ro 31-8220 (B)，三個 MAPKs 抑制劑 SB 203580，U0126 和 SP 600125 (C)在 NECA 誘導DC細胞IL-6生成中的作用。DC細胞和抑制劑孵育30分鐘后與IOuM NECA孵育36小時。*P < 0. 05，**p < 0. 01。腺苷受體A2bAR在多發(fā)性硬化癥病人中表達上調在用臨床樣品時，發(fā)現A2bAR在RRMS病人外周血白細胞中表達與年齡相仿的對照組相比明顯上升(圖6. A)，而其他三個腺苷受體表達沒有變化。這些結果與EAE小鼠中結果相似，預示著A2bAR與多發(fā)性硬化癥有聯(lián)系。接著，從實驗室成員的外周血單核細胞中提取樹突狀細胞，觀察CVT-6883能否抑制NECA誘導人DC細胞IL-6的生成。得到了同樣的 結果，CVT-6883能抑制NECA誘導人DC細胞IL-6的生成(圖6. B)。PCLP和PKC特異性抑制劑U73122和Ro 31-8220對人DC細胞IL-6產生的抑制作用表明Gq-PLC-PKC信號通路同樣參與了 NECA誘導人DC細胞IL-6的生成(圖6. C)。圖6為顯示腺苷受體A2bAR在MS病人中上調及CVT-6883抑制NECA誘導人源DC細胞IL-6生成的圖。A，qPCR檢測來自正常人(n = 20)和RRMS病人(n = 10)外周血白細胞樣本腺苷受體表達。B，分離自正常捐助者外周血單核細胞的人源DC細胞在anti-CD4抗體(IOug mr1)刺激下孵育36小時，或是與NECA(IOuM)亦或NECA和CVT-6883 (IOOnM)一起ELISA檢測IL-6分泌水平。C，人源DC細胞與PLC3抑制劑U73122 (IOuM)或PKC抑制劑Ro 31-8220 (IuM)預孵育30分鐘后與NECA培養(yǎng)36小時，ELISA檢測IL-6水平。數據表示為 mean土 SEM (n = 3)。與對照組比較 #p < 0. 01，*#p < 0. 001 ;與 CVT-6883 處理組比較 ###p < 0. 001 (Student，s t-test)。討論多發(fā)性硬化癥是一種引起中樞神經系統(tǒng)炎癥和脫髓鞘，并由T細胞介導的自生免疫性疾病。TH-17細胞可能在MS發(fā)病中起重要作用(Tesmer，L.A.，Lundy，S.K.，Sarkar，S. &Fox, D. A. 2008. Thl7 cells in human disease. Immunol. Rev.) 白介素-6，作為 TH_17 細胞分化最重要的調節(jié)者，可以作為臨床應用于治療MS病人一種新的有價值的作用靶點。最近研究限制抑制白介素-6可減輕EAE發(fā)病，抑制Th-17細胞分化(Satoshi Serada, M. F.，Masahiko Mihara, Nobuo Koike, Yoshiyuki Ohsugi, Shintaro Nomura, Hiroto Yoshida,Teppei Nishikawa, Fumitaka Terabe, Tomoharu Ohkawara, Tsuyoshi Takahashi, BarryRipley, Akihiro Kimura, Tadamitsu Kishimoto, and Tetsuji Naka. 2008. IL-6 blockadeinhibits the induction of myelin antigen-specific Thl7 cells and Thl cells inexperimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci USA.)。腺苷是一種信號分子，它能調控免疫和炎癥，在炎癥反應性疾病中發(fā)揮重要作用(Hasko, G. , J. Linden, B. Cronstein, and P. Pacher. 2008. Adenosine receptors therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases. Nat Rev Drug Discov7 :759-770.)。腺苷四個受體中，A1AR在MS病人臨床樣本和EAE動物模型中是被研究最為深入的一個受體。A1AR在MS病人腦及血液樣本中的單核細胞/巨噬細胞中表達減少，肯能會激活巨曬細胞，增加 CNS 浸潤(Mayne, M.，P. N. Shepel, Y. Jiang, J. D. Geiger,and C. Power. 1999. Dysregulation of adenosine Alreceptor-mediated cytokineexpression in peripheral blood mononuclear cells from multipiesclerosispatients. Ann Neurol 45 :633-639. Johnston，J.B.，C. Silva, G. Gonzalez, J. Holden，K. G. Warren, L.M. Metz, and C. Power. 2001. Diminished adenosine Al receptorexpression on macrophages in brain and blood of patients with multiplesclerosis. Ann Neurol 49 :650-658.)。A1AR 敲除小鼠 EAE 病情加重，激活 A1AR 能減輕 EAE脫髓鞘作用(Tsutsui, S.，J. Schnermann,F. Noorbakhsh, S. Henry, V. W. Yong，B. W. Winston,K. Warren, and C. Power. 2004. Al adenosine receptor upregulation and activationattenuates neuroinflammation and demyelination in a model of multiplesclerosis. J Neurosci 24 :1521-1529.)。慢性咖啡因能通過 A1AR 減輕 EAE (Tsutsui,S.，J. Schnermann, F. Noorbakhsh, S. Henry, V. W. Yong, B. W. Winston, K. Warren, andC.Power. 2004.Al adenosine receptor upregulation and activation attenuatesneuroinflammation and demyelination in a model of multiple sclerosis. J Neurosci24 :1521-1529. Chen, G. Q.，Y. Y. Chen, X. S. Wang, S. Z. Wu, H. M. Yang，H. Q. Xu，J. C. He，X. T. Wang, J. F. Chen, and R. Y. Zheng. 2010. Chronic caffeine treatment attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by guinea pig spinal cordhomogenates in Wistar rats. Brain Res 1309:116-125.)。CD73 基因敲除小鼠對 EAE 有抵制作用。作用們發(fā)現使用A2aAR拮抗劑SCH58261能減輕EAE(Mills，J. H.，L. F. Thompson,
C.Muelle r，A. T. Waickman, S. Jalkanen，J. Niemela，L Airas，and M. S. Bynoe. 2008. CD73is required for efficient entry of lymphocytes into the central nervous systemduring experimental autoimmune encephalomyelitis.Proc Natl Acad Sci USA 105 9325-9330.)。目前還沒有腺苷受體A2bAR和A3在MS或EAE中的報道。雖然腺苷在細胞外濃度很低，而激活腺苷受體A2bAR需要IOuM濃度的腺苷(Fredholm，B. B.，E. Irenius, B. Kull, and G. Schulte. 2001. Comparison of the potencyof adenosine as an agonist at human adenosine receptors expressed in Chinesehamster ovary cells. Biochem Pharmaco 161 :443-448.)，但在局部貧血或炎癥反應下腺苷濃度會上升(Linden，J. 2001. Molecular approach to adenosine receptors receptor-mediated mechanisms of tissue protection. Annu Rev Pharmacol Toxicol41 :775-787.),同時受體密度在實現細胞功能中也起很重要作用((Hasko，G.，J. Linden,
B.Cronstein, and P. Pacher. 2008. Adenosine receptors therapeutic aspects forinflammatory and immune diseases. Nat Rev Drug Discov 7 :759-770.))。腺苷通SA2bAR受體在哮喘發(fā)病中起重要作用，而間接調節(jié)肺中的腺苷和使用CVT-6883拮抗A2bAR受體都能抑制氣管炎癥反應和收縮(Mustafa，S. J.，A. Nadeem，M. Fan，H. Zhong，L Belardinelli，and D. Zeng. 2007. Effect of a specific and selective A(2B)adenosine receptorantagonist on adenosine agonist AMP and allergen-induced airway responsivenessand cellular influx in a mouse model of asthma. J Pharmacol Exp Ther 320 1246-1251.)。有報道稱A2bAR受體在肺部疾病中還參與促炎和促纖維化作用，而A2bAR受體的選擇性拮抗劑CVT-6883可以顯著抑制可發(fā)育成肺部炎癥損傷的腺苷脫氨基酶缺失小鼠中促炎因子和趨化因子如TNF-a，IL-6, CXCL2，CCLlI, CCL17和CXCLl的上升(Sun, C. X. , H. Zhong, A. Mohsenin, E. Morschl, J. L. Chunn, J. G. Molina, L. Belardinelli,
D.Zeng, and M. R. Blackburn. 2006. Role of A2B adenosine receptor signaling inadenosine-dependent pulmonary inflammation and injury. J Clin Invest 116 2173-2182.)。在本研究中，發(fā)現腺苷受體A2bAR通過調節(jié)IL-6生成，調節(jié)TH-17細胞分化，最終在EAE發(fā)病中起重要作用。檢測了四個腺苷受體在EAE發(fā)病過程中的表達。腺苷受體A2bAR在脾臟和淋巴結中顯著上調，而在腦和脊髓中沒有變化。這個結果預示腺苷受體A2bAR在EAE中介導外周免疫細胞。腺苷受體A2bAR同時也在MS病人外周血白細胞中表達顯著上調，這和EAE小鼠中的結果一直。而A3受體激動劑IB-MECA作為一種治療類風濕性關節(jié)炎的新藥物已進入臨床二期研究，這也預示該受體可作為治療MS作用靶點。兩種腺苷受體A2bAR選擇性拮抗劑MRS-1754和CVT-6883都能減輕EAE發(fā)病癥狀，而CVT-6883目前被認為可能成為一種治療哮喘的藥物。CVT-6883能減少脾臟中TH-I和TH-17細胞比例及相應細胞因 子的表達。CVT-6883同樣抑制MOG重刺激后EAE T細胞分泌的IL_17a和IFN- y。結果顯示通過CVT-6883抑制腺苷受體A2bAR能在體內減少TH-17細胞的分化。但在體外實驗中，無論是NECA或是CVT-6883都不能影響TH-I和TH-17細胞的分化，所以猜想腺苷可能影響了 T細胞分化因子如IL-6的生成。IL-6來自與很多細胞，外周的抗原遞呈細胞如巨噬細胞(Ryzhov，S.，R. Zaynagetdinov, A. E. Goldstein, S. V. Novitskiy, M. R. Blackburn, I. Biaggioni,and I.Feoktistov.2008.Effect of A2B adenosine receptor gene ablation onadenosine-dependent regulation of proinflammatory cytokines. J Pharmacol ExpTher 324:694-700.)和樹突狀細胞(Wilson, J. M.，C. C. Kurtz, S. G. Black, ff. G. Ross,M. S. Alam, J.Linden, and P.B.Ernst.2011.The A2B Adenosine Receptor PromotesThl7Differentiation via Stimulation of Dendritic Cell IL-6. J Immunol.),已及星形膠質細胞是腦中 IL-6 的主要來源(Van Wagoner, N.J. , and E. N. Benveni ste. 1999.Interleukin-6 expression and regulation in astrocytes. J Neuroimmunol 100 124-139.)。最近研究表明A2bAR通過刺激DC細胞IL-6的產生來促進TH_17細胞的分化(Wilson, J. M. , C. C. Kurtz, S. G. Black, ff. G. Ross, M. S. Alam, J. Linden, andP.B.Ernst.2011.The A2B Adenosine Receptor Promotes Thl7Differentiation viaStimulation of Dendritic Cell IL-6. J Immunol.)。檢測到 CVT-6883 抑制 A2bAR 能顯著EAE中IL-6在血清、脾臟和淋巴結的水平。DC細胞最為最主要的抗原遞呈細胞，引起T細胞的極化。而EAE發(fā)病早期，A2bAR在DC細胞中表達顯著上調。目前為止還沒有A2bAR選擇性激動劑，腺苷類似物NECA仍是最有效的激動劑(Feoktistov，I.，and I. Biaggioni. 1997.Adenosine A2B receptors. Pharmacol Rev 49:381-402.)。本研究中，CVT-6883 能夠抑制由NECA誘導人源和鼠源DC細胞IL-6的生成。DC-T細胞共培養(yǎng)實驗顯示CVT-6883通過抑制DC細胞上A2bAR影響了 Th-17細胞的分化。該結果與從EAE中得到的體內結果一致。綜上所述，A2bAR參與了多發(fā)性硬化癥和EAE發(fā)病，可作為新的臨床應用于多發(fā)性硬化癥病人的治療靶點，而CVT-6883通過抑制Th-17細胞的分化可作為治療MS的潛在藥物。上述的對實施例的描述是為便于該技術領域的普通技術人員能理解和應用本發(fā)明。熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于這里的實施例，本領域技術人員根據本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進和修改都應該在 本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種靶向腺苷受體A2bAR的藥物在制備用于預防或治療自身免疫性疾病的藥物中的用途。
2.根據權利要求I所述的用途，其特征在于所述的靶向腺苷受體A2bAR的藥物為A2bAR拮抗劑。
3.根據權利要求2所述的用途，其特征在于所述的A2bAR拮抗劑包括CVT-6883或MRS-1754。
4.根據權利要求I所述的用途，其特征在于所述的自身免疫性疾病包括多發(fā)性硬化、類風濕關節(jié)炎、紅斑狼瘡或炎癥性腸病。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，公開了一種靶向腺苷受體A2BAR的藥物在制備用于預防或治療自身免疫性疾病的藥物中的用途，經研究發(fā)現，與健康野生型小鼠相比，在EAE小鼠中，腺苷受體A2BAR在免疫組織中表達上調。腺苷受體A2BAR的兩個拮抗劑，CVT-6883和MRS-1754，給藥EAE小鼠后，EAE小鼠發(fā)病時間推遲，發(fā)病癥狀減輕，發(fā)病率降低，CNS炎癥細胞浸潤減少。本發(fā)明的優(yōu)點在于首次發(fā)現了腺苷受體A2BAR在MS病人及其動物模型EAE中表達上調，且用腺苷受體A2BAR拮抗劑CVT-6883能夠有效減輕EAE發(fā)病癥狀。本發(fā)明的腺苷受體A2BAR拮抗劑CVT-6883現已作為臨床實驗藥物用于治療哮喘，作為治療MS疾病的藥物具有很大的可能性，本發(fā)明給治療MS疾病提供了新的作用靶點和藥物來源。
文檔編號A61P37/02GK102772800SQ201110430879
公開日2012年11月14日 申請日期2011年12月20日 優(yōu)先權日2011年12月20日
發(fā)明者杜昌升, 謝欣, 魏巍 申請人:同濟大學